Aspergillus nidulans로부터 추출한 naringinase를 정제하여 물리화학적 성질을 검토하였다. 1) 효소는 유안침전, DEAE-Sephadex A-25, Sephadex G-100 column chromatography를 사용하여 정제하였으며 정제결과 두 개의 fraction이 나타남을 발견하였고 Fraction I의 비활상 조효소의 781배 종가함을 나타내었다. 2) 효소의 반응 최적 pH와 온도는 위의 두 fraction에서 같은 결과를 나타내었다. 최적 pH는 5.0 이었으며 최적온도는 4$0^{\circ}C$이었다. 3) 조효소액, Fraction I 및 Fraction II의 분해생물은 paper chromatography를 통해 조사한 결과 naringenin, glucose및 rhamnose 임이 밝혀졌다. 4) Andrew의 gel filtration 법에 의한 분자량을 측정한 결과 Fraction I은 약 78,000, Fraction II 는 약 26,000으로 추정되었다. 5) 효소의 안정성에 미치는 pH의 영향은 pH 5.2에서 15분간 처리로 6$0^{\circ}C$에서 50%가 실활되었으며 7$0^{\circ}C$에서는 거의 다 실화되었다. 6) 효소반응에 미치는 금속이온의 영향은 Fe$^{2+}$ 가 약간의 활성을 조해하였을 뿐 별로 영향이 없었다. 7) 효소의 기질에 대한 친화성에서 Km 값이 2.3X$10^{-6}$ g/ml 로 추정되었다
전보에서 분리 동정한 Y-33 균주의 $\beta$-galactosise 효소생산조건을 검토하고 효소를 정제하여 정제효소의 성질을 조사한 결과는 다음과 같다. 1. 효소생산을 위한 최적초발 pH는 7.0이었고 최적온도는 $65^{\circ}C$이었다. 2. 효소는 lactose와 galactose에 의하여 유도되어졌으며 세포내효소이었다. 3. 조효소액을 1차 DEAE-cellulose, 2차 DEAE-cellulose column chromatography 및 Sephadex G-150로 gel filtration하여 정제도가 28.3배, 수율이 15.2%의 정제효소를 얻었다. 4. 정제효소는 polyacrylamide gel 전기 영동에 의하여 순도가 검정되었다. 5. 정제효소의 유당가수분해를 위한 최적작용 온도는 $65^{\circ}C$. pH는 6.5이었다.
본 실험에 사용된 균주는 유류로 오염된 지역의 토양시료로부터 직접 분리한 Rhodococcus fascians로 이전 연구에서 항공유의 분해에 효과가 있는 것으로 밝혀진 균주이다. 디젤유가 항공유보다 R. fascians의 생장에 영향을 주는 것으로 나타났다. 해수중의 디젤 분해를 위해서는 2%이상의 접종량이 효과적이며 접종량이 증가할 경우 잔류량이 더 감소하였으나 큰 차이는 없었다. 해수중의 디젤이 5%이상에서는 디젤유의 독성에 의해 R. fascians의 생장이 저해를 받아 디젤 잔류량이 높게 나타났다. R. fascians는 pH 8에서 가장 높은 디젤 분해속도를 보였으며 비교적 넓은 pH 범위에서 디젤 분해도가 유지되는 것으로 나타났다. R. fascians의 최적 성장온도 보다 높은 $32^{\circ}C$에서는 디젤의 분해에 온도증가에 따른 자연분해의 영향이 큰 것으로 나타났다. R. fascians의 해수중 디젤유 분해의 최적온도는 $27^{\circ}C$로 최적 생장온도에서 분해가 활발히 이루어지는 것을 알 수 있었다.
고려인삼(Panax ginseng C. A.. Meyer) 중의 $\beta$-amylase를 연구하기 위하여 조(粗)인삼 $\beta$-amylase 를 분리한 후 그의 성질을 조사하였다. 조인삼 $\beta$-amylase는 ammonium sulfate 0.2$\sim$0.6포화분획에 의하여 효과적으로 조제되었다. 조제된 본 효소는 전형적인 $\beta$-amylase의 작용을 하여 starch에서 maltose만을 생산하였으며 maltase의 활성은 나타내지 않았다. 본 효소는 pH5$\sim$9(특히 pH7$\sim$8), $40^{\circ}C$ 이하의 조건하에서 안정성을 나타내었고 최적pH 5.0, 최적온도 $35^{\circ}C$를 나타내었다. 본 호소는 기질(starch)농도 l2mg% 이하에서 기질농도에 비례하여 호소활성이 증가하였으며 Km치는 4.76mg%이었다. 또 본 효소는 $K^{+}$, $Na^{+}$, $An^{++}$,$Ca^{++}$, $Co^{++}$,$Mn^{++}$$Zn^{++}$에는 영향을 받지 않았으나$Ag^{+}$, $Hg^{++}$,$Cd^{++}$, $Cu^{++}$,$ Al^{3+}$, and $Fe^{3+}$ 등에는 현저한 저해를 받았다.
분리 당화발효(Separate Hydrolysis and Fermentation, SHF)는 당화와 발효공정을 따로 수행하는 방법으로 최종 생성물인 글루코오스에 의해 억제 영향을 받기 때문에 반응에 진행됨에 따라 축적된 글루코오스의 농도가 높아지면 반응이 종결되는 단점이 있다. 이를 극복하기 위해 효소의 양을 늘리는 방법이 있지만, 효소의 생산비용이 비싸기 때문에 경제적인 방법이 될 수 없다. 이러한 분리 당화발효 공정의 단점을 극복하기 위해서 동시당화발효 공정(Simultaneous Saccharification and Fermentation, SSF)은 하나의 반응기에서 당화와 발효를 동시에 수행한다. 동시당화발효 공정에서는 당화과정에서 글루코오스가 생성되자마자 효모가 발효과정을 통해 글루코오스를 바로 제거하기 때문에 반응기내에서 당의 축적을 최소화할 수 있다. 따라서 동시당화발효 공정은 최종 생성물의 억제 작용을 방지할 수 있고, 효소의 가수분해 반응을 향상시킬 수 있다. 본 연구에서는 동시당화발효에서 에탄올의 수율에 관여하는 조건들(pH, 반응온도, 효소 투입량, 반응시간)의 최적 조건을 찾는 연구를 수행하였다. 기질로는 감자전분을 사용하였고, 효소는 glucoamylase, 균주는 Saccharomyces cerevisiae가 각각 사용되었다. 동시당화발효의 최적의 조건은 pH 4, 온도 38로 나타났다. 최적의 조건으로 감자전분을 동시당화발효하였을 때 반응 18시간 후에 에탄올은 최대 수율 86%에 도달하였다.
Lactobacillus plantarum 용균 효소를 생산하는 균주를 배양하여 생산된 효소를 정제한 결과 비활성도가 5.8 units/mg protein 이었고 정제도 8.3배, 수율은 30%이었다. 정제효소의 분자량은 gel filtration과 SDS-polyacrylamide gel eletrophoresis를 이용하여 측정한 결과 60,000 kDa 이었다. 용균 효소의 최적 반응 시간은 20분이었으며 최적 온도는 4$0^{\circ}C$, 최적 pH는 3.0이었다. 온도 안정성은 각 온도에서 30분간 처리하였을 때 $30^{\circ}C$까지는 안정하였으나 4$0^{\circ}C$에서는 80% 활성을 나타내었다. 효소의 pH 안정성은 실온에서 1시간 처리하였을 때 pH 4~7에서 안정성을 나타내었다.
저자들은 Cibacron Blue F3G-A Separose 컬럼 어피니티크로마토그래피에 의하여 GIn-cose-6-phosphate dehydrogenase를 Leuconostoc mesenteroides로부터 순수 분리한 바 있다. 이 효소를 사용하여 효소특성을 조사한 결과 분자량은 Sephadex G-200 컬럼에 의해 112,000이었으며 최적온도는 50$^{\circ}$, 활성화에너 지는 8.36kcal/mole 불활성화에너지는 -58.2kcal/mole로 나타났다. $NADP^+$를 조효소로 사용하였을때 최적 pH7.8에서 K_{G6p}:76.9${\mu}$M, ${\alpha}K_{NADP}:\;7.46{\mu}M,\;{\alpha}KNNADP:\;7.l4{\mu}M$이었으며 같은 조건에서 $NAD^+$를 조효소로 사용하였을때 $K_{G6P}:\;53.65{\mu}M,\;K_{NAD}:\;115.2{\mu}M\;{\alpha}K_{NAD}:\;707.2{\mu}M$이었다. 따라서 $NADP^+$ 및 $NAD^+$를 조효소로 사용한 경우에 있어서 ${\alpha}$ 값은 각각 1과 6으로 나타났다. pH변화에 따른 반응속도상수의 변화에 의하면 $NAD^+$를 조효소로 하였을때 최적 pH는 7.8 이었고 pKa가 7.2인 활성기와 ${\mu}Kb$가 9.0∼9.6인 활성기가 효소와 기질의 상호작용에 관여함을 알았다. 이중 pKa 7.2인 활성기를 밝히기 위하여 효소를 광산화와 carboxymethylation을 시킨결과 histidine의 imidazole기임을 알수 있있다.
한국 재래식 간장의 독특한 맛을 생성하는 B. licheniformis SSA3-2M1 의 배양액으로부터 proteinase 를 정제한 결과 2 종의 proteinase 의 역가를 확인할 수 있었다. Proteinase I 의 역가는 II 보다 두배가량 되며 최적 pH 가 7-11.5 이었다. Proteinase I 의 역가는 II 보다 두배가량 되며 최적 pH 가 7-11.5 이었다. Proteinase II 의 최적 pH 는7-9 이며 proteinase II 는 I 보다 pH3-5 부근의 상성에서 더 안정하고 활성이 강하였다. Proteinase I 과 II 의 최적온도는 각각 50.deg.C 였으며, proteinase II 의 온도안정성은 30-45 .deg.C 온도범위에서 proteinase I 보다 더 안정하였다. Proteinase I 은 45.deg.C 에서 60% 가 실현되었으며 protein II 는 45.deg.C 에서 5% 가량 실활되었다. 염에 대한 영향은 proteinase I 이 염의 농도 25-35% 범위에서 proteinase I 보다 효소활성이 높은 것으로 나타났다. Proteinase 치는 casein 을 기질로 사용하였을 경우, proteinase I 은 6.89 mg/ml, proteinase II 는 9 mg/ml 의 $K_{m}$ 치를 나타내었다. 이결과는 proteinase I 이 II 보다 기질에 대한 친화력이 높은 것으로 나타났다. 각종 금속이온의 농도 1 mM 에서는 Pb($CH_{3}$CCO)$_{2}$ 는 효소 활성을 증가시켰고 $ZnSO_{4}$, $7H_{2}$O, $K_{2}$$SO_{4}$, $HgSO_{4}$ 등은 저하시켰으며, 5 mM 이상에서는 $HgSO_{4}$ 와 $ZnSO_{4}$ 가 다른 염에 비해서 특히 효소활성을 많이 저히하였다. Proteinase I 과 II 는 대두 단백을 가수분해하여 peptide 와 아미노산을 생성하였으머 peptide 를 다시 아미노산으로 분해하였다. Proteinase I 과 II 는 한국재래식 간장의 중요 맛성분인 아미노산을 생성하는 주효소로 밝혀졌다.
Rhodotorula sp. CL-82 유래 의 epoxide hydrolase 활성을 이용하여 라세믹 styrene oxide에 대한 입체선택적 가수분해 반응을 실시하였다. Rhodotorula sp. CL-82 생촉매의 입체선택적 가수분해속도를 나타내주는 반응표면 곡선에 대한 분석을 통해 pH, 반응주도, cosolvent 첨가량에 대한 최적조건을 각각 7.6,$33.3^{\circ}C$ , 3%(v/v)으로 결정하였다. 최적반응조건에서 약 4시간 정도의 반응을 통해 ee값이 99% 이상인 광학적으로 순수한 (S)-styrene oxide를 이론 수율대비 40% 수율로 얻을 수 있었다.
콩나물 줄기로부터 추출, 정제한 peroxidase는 glucose oxidase와 함께 guaiacol을 기질로 사용하여 포도당의 분석에 사용되었다. peroxidase는 DEAE-Sephacel ion exchange column chromatography를 통해 얻은 분획이 조효소액에 비해 specific activity가 10.8배 증가되었고 수율은 11.3%였다. 정제된 peroxidase와 glucose oxidase를 이용한 포도당 분석의 최적 pH는 5.5였고 최적온도는 $40^{\circ}C$로 나타났으며 포도당 양의 증가에 따라 효소활성은 증가되었으며 반응시간과의 관계에서도 직선을 보여 주었다. 그리고 L-cysteine과 dithiothreitol과 같은 환원제는 포도당 분석에 이용되는 glucose oxidase와 콩나물 peroxidase의 활성을 저해하는 것으로 나타났다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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