• 한국동물번식학회:학술대회논문집
• /
• 한국동물번식학회 2004년도 춘계학술발표대회
• /
• pp.202-202
• /
• 2004

고양이 체세포 복제산자의 생산은 Shin등(2002, Nature 415: 859) 1마리의 "Cc"를 성공한 이래 재현 생산한 보도가 없다. 그리하여 본 실험에서는 체세포 복제산자 생산을 위한 기초 실험으로서 난자의 체외성숙, 체세포핵이식 수정란의 체외발달율을 검토하고자 수행하였다. 성성숙한 고양이에서 난소적출수술로 난소를 적출 한 후 4시간 내에 실험실로 운반하여 면도칼로 난소를 절재한 후 미성숙난자를 채취하여 TCM199 + 0.4% BSA + 1000 IU/ml bST에서 24시간 체외성숙하였다. 체외성숙한 난자는 난구세포를 제거 후 핵이식에 공시하였다. (중략)

• 한국동물번식학회:학술대회논문집
• /
• 한국동물번식학회 2001년도 춘계학술발표대회
• /
• pp.27-27
• /
• 2001

본 연구는 돼지 난포란의 체외 성숙시 hyaluronic acid (HA) 및 Tocopherol첨가가 돼지 수정란의 배발달에 미치는 효과를 검토하기 위하여 실시하였다. 돼지 난포란은 0.1% PVA, 3.05mM D-Glucose, 0.91mM sodium pyruvate, 0.57mM cysteine, 0.5$\mu\textrm{g}$/$m\ell$ LH, 0.5$\mu\textrm{g}$/$m\ell$ FSH and 10ng/$m\ell$ EGF가 첨가된 TCM-199에서 HA와 Tocopherol을 농도별로 첨가하여 42~44시간 배양함으로써 체외성숙을 유도하였다. HA의 효과를 보기 위해 체외성숙시 0.1% HA가 첨가된 처리구에서 배발달율은 25.6%로 대조구 16.7% 보다 높았다.(Table Omitted). 또한 수정시 HA를 0, 0.02, 0.2, 2.0 로 처리한 결과 8.7%, 19.4%, 11.1%, 0%로 대조구(8.7%)에 비해 0.02% 처리구(19.4%)에서 배발달율이 가장 높았다. 수정후 control, TCM-199, TCM-199+0.1% HA가 첨가된 배양액에 washing해주었을 때 발달율은 TCM-199+0.1% HA 첨가구에서 배발달율(35.6%)이 유의적으로 높게 나타났다. Tocopherol을 0, 50, 100, 200mM로 처리한 결과 수정된 난자중 배발달율은 32.1%, 40.0%, 35.7%, 39.6%로 처리구에서 높았으며, 성숙배양 후반기 22h. 동안 Tocopherol 첨가한 후 수정전 HA로 washing한 결과 Tocopherol 무첨가구에서는 차이를 보이지 않았으나, Tocopherol 첨가구에서는 HA처리구에서(19.0%)에서 무처리구보다(14.3%) 높은 결과를 나타내었다. 따라서 배양액내에 HA, Tocopherol를 첨가함으로써 미성숙 난포란의 수정율 및 발달율을 높일수 있을 것으로 생각된다.

• 한국가축번식학회지
• /
• 제20권4호
• /
• pp.459-465
• /
• 1997

본 연구는 핵이식의 시기가 융합과 체외발달에 미치는 영향을 조사하고 체외수정 공핵배의 핵과 체외성숙난자간에 전기융합의 최적 통전전압과 통전시간을 결정하기 위하여 시도하였다. 수핵난자는 체외성숙후 25~27시간에 제핵하였고 난자의 추가성숙을 위하여 융합전에 18~20시간 더 배양하였다. 공핵체외수정란은 16~32세포기까지 BOEC와 공배양하였다. 공핵배의 할구 이식시간은 조기핵이식구에서는 체핵후 1~3시간, 자연핵이식구를 체핵후 16~18시간이었다. 융합은 체외성숙후 43~45시간에 행하였다. 융합율은 할구 이식시기에 따라 차이가 없었으나 난할율과 8~16세포기 발달은 자연핵이식구에서 높았다. 융합, 난할 및 상실배 배반포 발달율은 1.0kV/cm보다 0.75kV/cm전압에서 높았으며 0.7kV/cm에서 상실배 배반포율은 17.6%였다. 통전시간에 따라 융합율은 차이가 없었으나 50$\mu$sec와 70$\mu$sec에서 난할율과 상실배-배반포 발달율이 다소 높았다. 본 결과에서 핵이식의 최적시기는 수핵난자의 체외성숙후 42~44시간이었으며 최적 전기융합 조건은 50~70$\mu$sec의 1회 0.75kV/cm임을 알 수 있었다.

• 한국수정란이식학회지
• /
• 제19권3호
• /
• pp.245-255
• /
• 2004

포유동물 난자의 체외수정은 외래유전자 도입에 의한 형질전환동물 생산과 우수한 형질을 가진 개체의 보존, 인간의 불임연구 등과 같은 수정란이식 기술로서 널리 이용되고 있다. 돼지 난포란을 이용한 체외수정란의 생산은 초기단계인 체외성숙 기술의 미확립, 그로인한 체외수정 시 높은 다정자 침입율과 불완전한 웅성전핵 형성 몇 체외발달능 정지현상(cell blocking) 등 어려움 때문에 아직도 다른 가축보다 양질의 수정란을 생산하기가 어려운 것으로 알려져 있다. 이와 같은 것을 해결하기 위하여 많은 연구자들은 배양액내에 hormon, growth factor, antioxdants 등과 같은 외인성 인자들을 첨가하고 있다. 이들 인자 중 antioxdant는 free radical을 소거하고 과산화물 생성을 억제하여 난자를 산화적 스트레스로부터 보호한다. 따라서 본 연구는 돼지 난포란으로부터 체외수정란의 생산에 있어서 배양액내 cysteine, catalase 및 glutathione의 첨가가 체외성숙, 체외수정 및 체외배양에 어떤 영향을 미치는지를 검토하였다. 실험 1은 체외성숙용 배양액인 TCM-199 용액에 catalase(100, 200, 500U/$m\ell$)와 glutathione(0.5, 1.0, 1.5mM/$m\ell$)의 첨가, 실험 2는 성숙된 난자의 체외수정용 배양액인 mTBM 용액에 cysteine(0.1, 1.6, 1.0mM/$m\ell$), catalase(100, 200, 500U/$m\ell$)와 glutathione(0.5, 1.0, 1.5mM/$m\ell$)의 첨가, 실험 3은 체외성숙 및 체외수정된 난자의 체외배양용 배양액인 NCSU-23 용액에 cysteine(0.1, 1.6, 1.0mM/$m\ell$), catalase(100, 200, 500U/$m\ell$)와 glutathione(0.5, 1.0, 1.5mM/$m\ell$)을 첨가하여 배반포로의 배 발달율을 관찰하였던 결과는 다음과 같다. 1. 체외성숙시 catalase의 경우는 500U 첨가군의 27.2%로 무첨가군의 15.4%보다 유의하게 높았다(p<0.05). 한편 glutathione의 경우 배반 포로의 배 발달율은 무첨가군과의 차이는 없었다. 그러나 1.0mM 첨가군에서 상실배까지의 배 발달율인 72%는 무첨가군의 53.9%보다 유의하게 높았다(p<0.05). 2. 체외수정시 여러 종류의 항산화제 첨가는 첨가하는 농도와 관계없이 배반포로의 배 발달율은 무첨가군과 차이가 없었다. 3. 체외배양시 여러 종류의 항산화제 첨가는 첨가하는 농도와 관계없이 배반포로의 배 발달율은 무첨가군과 차이가 없었다. 이상의 결과를 종합적으로 하면 돼지 난포란을 이용한 배반포의 체외생산에 있어서 배양액내 항산화제의 첨가는 체외성숙단계에서만 효과적이었다. 이것은 아마도 항산화제가 체외성숙 시 난포란 내에서 일어나는 여러 가지 생화학 반응의 처리시간과 관련하여 활성화시킴으로써 난포란의 생존력을 높인 것이라고 사료되기 때문에 앞으로는 돼지 난포란의 효율적인 체외성숙에 대해서 배양액내 첨가물질은 물론 나아가서 방법론적인 측면에서 더욱 연구되어져야 할 것이다.

• 한국수정란이식학회지
• /
• 제13권2호
• /
• pp.117-125
• /
• 1998

본 연구는 Percoll,Swim-up 그리고 Glass-wool 여과법의 세가지 정자분리 방법에 대한 정자 회수율, 생존율과 첨체반응율, 그리고 체외수정 후 배양시간에 따른 전핵형성율,수정란의 발달율과 세포할구수에 대한 효과를 조사하고자 실시하였다. 도축된 암소로 부터 채취한 난자를 22시간 체외배양 후 성숙된 난자를 체회수정시켰다. 수정 후 배양시간에 따라 존핵율을 조사하였으며 48시간에 분할율,192시간에 배반포기 발달율 및 세포할구수를 각각 비교 조사하였다. 정자의 첨체반응과 생존율은 처리군간에 차이가 없으나 회수율에 있어서 percoll 처리군이 다른 두 처리군보다 유의적으로 높았다(p<0.001).수정 후 배양시간별 전핵형성에 있어서도 percoll 처리군이 다른 두 처리군보다 빨리 진행됨을 볼 수 있다. 분할율에 있어서는 처리군간에 유의적 차이가 없으나.배반포기 발달율과 세포할구수에 있어서는 pecoll 처리군이 다른 두 처리군보다 유의적으로 높았다(P<0.05). 이상의 결과로 보아 percoll 처리에 대한 정자분리 방법은 정자 회수율이 높고 수정시 전핵형성 시간이 단축되어, 그 결과로 배반포기 발달율과 수정란의 세포할구수에 효과적임을 알 수 있었다.

• 한국동물번식학회:학술대회논문집
• /
• 한국동물번식학회 2001년도 춘계학술발표대회
• /
• pp.85-85
• /
• 2001

본 연구는 돼지 난자의 체외 수정시 sucrose 첨가가 돼지 난자의 다정자 침입율에 미치는 영향을 조사하기 위하여 실시하였다. 돼지 난포란은 0.1% PVA, 3.05 mM D-glucose, 0.91 mM sodium pyruvate, 0.57 mM cysteine, 0.5 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$ FSH, 0.5 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$ LH, 및 10 ng/$m\ell$ EGF가 첨가된 TCM199 배양액에서 42-44 시간 동안 배양하여 체외 성숙을 유도하였으며, 2 mM caffeine과 0.1% BSA가 첨가된 체외수정용 mTBM 배양액에 3% sucorse를 첨가하여 6시간동안 수정을 유도하였다. 수정된 난자의 다정자 침입율을 조사하기 위해 체외수정 후 12, 13 및 14 시간대에 각각 1% orcein으로 염색하여 전핵 형성율을 조사하였다. 돼지 난자의 체외수정시 3% sucorse를 첨가하였을 때, 전핵 형성율을 조사한 결과 대조구에서 미수정, 1, 2, 및 3 PN 이상의 전핵 형성율은 각각 57.6 7.6, 9.7, 및 25%로, 처리구 74.2, 7.6, 13.6, 및 4.5% 에 비교하여 다정자 침입율이 유의하게 높았다(p<0.05). 그리고 3% sucorse를 첨가한 체외수정용 배양액에서 수정을 유도한 후 12, 13, 및 14 시간대별로 나누어 전핵 형성율을 조사한 결과, 수정 후 시간이 경과되면서 다정자 침입율이 증가되는 것을 볼 수 있었다 그러나 대조구 60.7%에 비해서는 각각 32.5, 36.0, 및 33.3%로 현저히 낮은 것을 볼 수 있었다.(Table Omitted). 또한, 3% sucorse가 첨가된 배양액에서 수정된 수정란의 발달율을 조사한 결과, 배반포 생산율은 처리구 21.8%로 대조구 6.9%에 비해 유의하게 높은 것을 확인 하였다. 따라서, 돼지 난자의 체외수정시 3% sucorse첨가는 체외수정란 생산에서 문제가 되고 있는 다정자 침입율을 저하시키고 배발달율을 향상시킴으로서 수정란의 체외 대량생산 효율성은 물론 수정란 이식시 수태율을 증가시킬 수 있을 것으로 사료된다.

• 한국수정란이식학회지
• /
• 제16권3호
• /
• pp.173-182
• /
• 2001

본 연구는 돼지 난포란의 체외성숙배양액에 superoxide dismutase(SOD)를 첨가배양하여 체외성숙과 수성이후 배발달에 미치는 영향과 산소농도 및 SOD가 체외생산된 돼지초기수정란치 배발달에 미치는 영향을 규명하고자 실시하였다. 본 연구에서 얻어진 결과를 요약하면 다음과 같다. 1. 돼지 난포란을 체외성숙배양액인 NCSU-23에 SOD를 각각 0, 100,500 및 1,000uni1s/m1 첨가하여 성숙시킨 다음, 체외수정을 실시한 결과, 핵성숙률, 정자침입율, 다정자침입률 및 평균침입정자수는 처리구와 대조구간 유의적(P<0.05)인 차이가 인정되지 않았고, 웅성전핵형성률은 처리구(90.9∼81.2%)보다 오히려 대조구(95.0%)가 유의적으로 높은 결과를 나타냈다(P<0.05). 2. 체외수정 후, 배발달배양액인 NCSU-23에 7일 동안 배양한 결과, 배반포형성률과 총세포수는 처리구가 대조구보다 유의적(P>0.05) 으고 낮은 결과를 나타냈다. 3. 배발달배양액인 NCSU-23에 SOD를 각각 0, 100, 500 및 1,000uni1s/m1을 첨가하고 5% 및 20% 산소조건하에서 7일동안 배발달을 유기한 결과, 배양 7일째 산소조건에 따른 처리구간 배반포형성률 및 총세포수는 유의차가 없었으며, SOD농도별 배반포형성률은 100 units/ml 처리구에서 0, 500 및 1,000uni1s/m1 처리구 보다 유의적으로 높은 배반포형성률을 나타냈으나, 총세포수에서는 처리구(27.6∼37.3개)가 대조구(45.6개)보다 유의적(P<0.05) 로 낮은 결과를 나타내었다. 따라서 NCSU-23배양액에 SOD의 첨가는 돼지난포란의 체외성숙과 초기배발달에 영향을 미치지 않는 것으로 조사되었으며, 5% 및 20% 산소농도에 따른 영향도 없는 것으로 사료된다.

• 한국가축번식학회지
• /
• 제20권1호
• /
• pp.19-26
• /
• 1996

본 연구는 체외에서 생산된 돼지수정란에 외래유전자를 미세주입후 체외 배 발달과 유전자 발현을 조사하기 위하여 실시하였다. 체외수정후 18∼20 시간 사이에 LacZ 유전자와 산양 성장호르몬 유전자를 미세주입하였으며, 체외 배 발달율과 유전자 발현은 미세주입후 9일간 체외배양을 실시한 다음 조사하였다. 돼지수정란을 원심분리하여 전핵을 관찰한 결과 60.3%의 난자에서 전핵이 가시화되었다. 또한 유전자가 미세주입된 수정란중 상실배와 배반포까지 발달한 비율은 각각 8.6, 9.1%로 대조구의 발달율 19.0, 20.8%보다 유의하게 낮았다. 그러나, NCSU23 배양액에 4일간 배양후 EMEM 배양액으로 교체하여 배양한 결과, 배반포 및 부화배반포까지 높은 발달율(19.4%)을 나타내었다. X-gal 염색의 결과로서, LacZ의 발현을 나타낸 수정란의 비율은 상살배, 배반포 단계에서 40.0, 42.9%로 나타났으나, 이들 형질전환 수정란의 대부분은 mosaic 현상이 관찰되었다. 또한 PCR 부분에서, gGH 유전자가 도입된 수정란의 비율은 상실배, 배반포단계에서 45.0, 44.4%로 X-gal 염색의 결과와 유의한 차이가 없었다. 따라서 본 실험에서 얻어진 결과들은 체외에서 생산된 돼지수정란은 미세주입후에도 배반포 및 부화배반포까지 성공적으로 발달할 수 있다는 것을 입증하였다. 또한 체외성숙, 수정된 돼지수정란을 이용하여 형질전환 돼지 생산의 가능성을 시사하고 있다.

• 한국수정란이식학회지
• /
• 제21권2호
• /
• pp.101-107
• /
• 2006

본 연구는 돼지 수정란의 체외 성숙 및 체외 배양액의 retinol 첨가 효과를 규명하기 위하여 체외 성숙 및 체외 배양액에 retinol을 첨가하여 수정란의 체외 발달에 미치는 영향을 구명하고자 수행되었다. 체외 성숙 배양액에 retinol을 첨가한 결과 성숙율은 $66.7{\pm}6.0{\sim}69.2{\pm}5.3%$으로 각 처리구 간의 유의적인 차이가 없었다(p>0.05). 체외 수정 후 배반포로의 발달율은 $5{\mu}M$ 첨가구에서 $20.4{\pm}2.6%$의 발달율을 나타내어 타 처리구에 비하여 유의적으로(p<0.05) 높게 나타났으며, $10{\mu}M$ 첨가구에 있어서는 분할율과 배반포로의 발달율이 타 처리구에 비하여 유의적으로(p<0.05) 낮게 나타났다. 정상 수정율은 $59.3{\pm}9.6{\sim}73.0{\pm}7.3%$로 처리구간에 차이가 없었다. 다정자 침입율은 처리군 간에 유의차는 인정되지 않았다(p>0.05). 배반포로의 발달 후 세포수를 비교한 결과 대조구($29.8{\pm}1.0$)에 비해 $5{\mu}M(37.0{\pm}1.6)$ 첨가구에서 유의적으로(p<0.05) 많은 세포수를 나타내었다. 체외 배양액에 retinol을 첨가한 후 발달율을 조사한 결과, 난할률, 상실배 및 배반포로의 발달율에서 모두 효과를 나타내지 못하였으며, 특히, $10{\mu}M$의 처리구에서는 대조구를 비롯한 타 처리구들보다 유의적으로(p<0.05) 발달율이 낮게 나타났다. 체외 성숙 배지와 체외 배양액 모두 retinol을 첨가한 결과 배반포로의 발달율에 있어서 각 처리구간의 유의적인 차이는 없었다. 이상의 결과를 종합할 때, 돼지 체외 성숙 배양액에 5 uM의 retinol의 첨가는 발달율과 세포수에 있어서 유의적으로(p<0.05) 효과적이었으며 10uM에서는 유해한 결과를 나타내었다.

• 한국가축번식학회지
• /
• 제23권3호
• /
• pp.263-270
• /
• 1999

본 연구는 체외성숙배 양액에 L-ascorbic acid 와 selenium을 첨가 배양, 돼지 미성숙 난포란의 체외성숙, 체외수정 및 체외배발달에 미치는 영향을 검토코자 수행하였다. 배양액내 L-ascorbic acid를 0. 62.5. 100 그리고 30 $\mu$Ml 첨가 40~44시간동안 배양한 성적은 난핵포 붕괴율이 각각 86.8%, 92.9%, 91.7%, 그리고 92.6%였으며 핵성숙율은 각각 44.7%. 57.1%, 52.8%, 그리고 53.7%로 첨가구에서 유의적으로 높았다 (p＜0.05). 체외성숙배양액내 L-ascorbic acid와 selenium을 첨가 배양 후 체외 수정 유기 결과, 웅성전핵 형성율은 유의적으로 높았고 (p＜0.05) 다정자 침입율은 유의적으로 낮게 나타났으며 (p＜0.05), 체외수정 후 난할율, 상실배와 배반포배 발달율도 첨가구에서 유의적으로 높게 나타났다 (p＜0.05). 이러한 결과는 체외성숙 배양액내 L-ascorbic acid와 selenium을 첨가 배양했을 때 돼지 미성숙난포란의 체외 성숙율, 웅성 전핵 형성율 그리고 돼지 체외수정란의 배발달율을 향상 시킬 수 있으리라 사료된다.