• Journal of Embryo Transfer
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• v.9 no.1
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• pp.53-63
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• 1994

소 체외수정란의 체외 발육에 $CO_2$와 $O_2$의 농도가 미치는 영향에 대하여 두가지 배양액과 서로 다른 Co-culture 체계를 이용하여 검토하였다. 체외 수정후 40~44시간에 회수간 2~8 세포기 수정란을 여러가지 gas조건하의 다른 배양조건에서 무작위로 옮겨 실험을 수행하였다. 5% $CO_2$와 $O_2$,10% $O_2$및 20% $O_2$조건에서 배양을 실시한 결과, 상실배가 이상 발육된 체외 발육성적은 각각 22.1% 15.0% 및 21.1%였다.(p<0.05). 한편 배양액에 따른 헤외 배양성적은 KOSM배양액(19.1%)의 경우가 Menezo's B2 배양액(13.7%)에서 배양한 경우보다 더 높은 성적을 얻었다.(p>0.05,Table 1). 2~8세포기 수정란을 5% $CO_2$또는 10% $CO_2$와 5%, 10% 및 20%의 $O_2$조건 하에서 체외 배양을 실시한 경우 각각 15% 와 8%의 체외 발육 성적을 얻었고(P>0.05), $O_2$조건의 경우 10% $O_2$(17%)와 20% $O_2$(20%)의 배양조건을 이 5% $O_2$(26%)보다 낮은 성적을 나타냈다. (P<0.05), (Table2). 체외 수정 후 얻은 2~8세포기 수정란을 단순 배양액 과 두개의 다른 공동 배양체계를 이용하여 5% $CO_2$와 5% 및 20% $O_2$의 배양 조건하에서 체외 배양을 실시한 결과 상실배와 배반포기 까지 발육된 체외 발육 성적은 배양액과 공동배양 체계에 따른 차이는 인정되지 않았다(p>0.05). 그러나 $O_2$의 농도는 소 체외 수정란의 체외 발육성적에 영향을 미치는 것으로 나타났다.(Table 3). 본실험은 $CO_2$와 $O_2$의 농도가 소 체외수정란의 체외 배양할때 배양체계에 따라 다른 영향을 미치는 것으로 나타났다.

• Journal of Embryo Transfer
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• v.7 no.1
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• pp.1-12
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• 1992

본 연구는 소의 난포란의 체외성숙과 체외수정에 영향을 미치는 요인을 구명하기 위하여 미숙 난포란을 채취하여 형태적 분류를 통해 우수한 란을 공시한 후 난포의 크기, 정액의 형태, 수정능득법, 혈청, 호르몬, 난포액, 난구세포등을 첨가한 TCM-199 배양액에서 배양하면서 체외성숙 및 수정율을 조사하였는 바 그 결과는 다음과 같다. 1. 소 난포란을 채취하여 배양을 통해 형태적 분류를 했을때 A형란은 61.4%, B형란은 12.1%, C형란은 19.2%, D형란은 4.2%였으며 발생중지 또는 퇴화란은 3.0%였다. 또한 A, B, C형란을 배양액에 배양했을때 난포란의 체외성숙율은 각각 89.1%, 78.0%, 52.6%였으며, 수정율은 각각 78.1%, 66.1%, 33.3%였다. 2. 소 난포의 크기를 1-2mm, 3-5mm 및 5mm이상으로 분류하여 채취한 난포란의 수는 각각 67개, 98개, 63개 였으며, 이를 TCM-199 배양액에서 배양했을때의 체외성숙 및 수정율은 각각 56.7%와 44.8%, 82.5%, 72.4%와 46.0%와 28.6%였다. 3. 소 난포란의 체외수정에 있어서 정소상체 미부정자, 희택정액 및 동결정액을 이용하여 매정하였을때 체외수정율과 분할율은 각각 63.3%, 73.3%, 70.0%와 32.7%, 37.8%, 38.3%였다. 4. 소 난포란의 체외수정에 있어서 m-KRB 처리법, HIS처리법, Ca-IA처리법, BFF처리법 및 heparin처리법으로 각각 수정능획득을 유기하였을때 체외성숙 및 분할율은 각각 53.1%, 28.1%, 33.9%와 17.7%, 50.8%와 26.2%, 48.1%와 22.8% 및 58.8%와 32.8%로서 heparin 처리법이 가장 높았다. 5. 소 난포란의 체외성숙과 수정에 있어서 각 농도의 우태아혈청과 FSH, HCG, $\beta$-estradiol을 첨가한 TCM-199배양액에서 배양했을때의 체외성숙 및 수정율은 각각 76.0-82.3%와 26.2-70.0%로서 무첨가에 비해 첨가가 높았다. 6. 발정우혈청 및 우태아혈청 5-20%를 첨가한 배양액에서 배양했을때의 체외성숙율은 각각 71.7-76.9%, 74.0-80.6%였으며 체외수정율은 51.9-58%와 26.2-30.0%로서, 체외수정율의 경우 발정우혈청의 첨가가 우태아혈청의 첨가에 비해 높았다. 7. 난포액20-30%를 첨가한 배양액에서 배양했을때의 난포란의 체외성숙율은 각각 68.0%와 64.6%, 수정율은 각각59.6%와 60.4%로서 난포액10%, 50%를 첨가한 배양액에서 배양시의 체외성숙율과 수정율에 비해 높았다. 8. 1$\times$10 6 /ml의 난구세포를 첨가한 배양액에서 배양했을때의 난포란의 체외성숙율과 수정율은 각각 76.5%와 61.7%로서 FCS 10%와 1$\times$10 4 -10 5/ml 와 1 $\times$10 8/ml난구세포를 첨가한 배양액에서 배양시의 체외성숙율과 수정율에 비해 높았다.

• Proceedings of the KSAR Conference
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• 2003.06a
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• pp.72-72
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• 2003

대부분의 동물에서 체내 또는 체외수정란의 체외 배양 시 일정한 발육 단계까지 발달한 후 발육지연이나 정지가 되는 체외 발육억제 현상이 나타나게 된다. 특히 돼지에서는 타 가축들과는 달리 4 세포기에서 체외 발육억제 현상이 일어나기 때문에 체외에서의 발육율이 매우 낮아 수정란 생산이 제한되고 있다. 따라서 본 연구는 이러한 돼지 체외발육 억제 현상을 극복하고 돼지 체외 수정란의 체외배양 체계의 기초 자료를 얻고자 돼지 미성숙 난자를 체외에서 성숙, 수정시킨 뒤, 체외 수정란의 배양 시 성장인자와 6탄당의 첨가에 따른 체외 발육율을 검토하였다. 난자의 핵 성숙과 세포질 성숙 및 세포 기능에 영향을 미치는 것으로 알려져 있는 성장인자로는 Insulin-like growth factor-I(IGF-I)과 Epidermal growth factor(EGF)를 사용하였고, 여러 종의 번식기관에 존재하여 배반포 형성을 촉진시키는 것으로 알려진 glucose, mannose, galactose 및 fructose가 6탄당으로 사용되었다. 체외수정란의 발육을 위한 기본 배양액인 NCSU-23에 각각 0, 1, 5, 10 및 20ng/ml의 IGF-I과 EGF를 각각 첨가하여 농도의 차이에 따른 발육율을 검토하였다. 또한 5.56mM의 glucose, mannose, galactose 및 fructose에 5ng/ml의 IGF-I 또는 10ng/ml의 EGF 첨가 유, 무에 따른 초기배 발육율을 검토하였다. 마지막으로, 각각의 6탄당에 위와 같은 농도의 IGF-I와 EGF 공동 첨가 유, 무에 따른 초기배 발육율을 검토하였다. 그 결과 돼지 체외 수정란의 체외 발육 시 배양액 내에 서로 다른 농도의 IGF-I과 EGF를 첨가하였을 때 IGF-I은 5ng/ml(12%)에서, EGF는 10ng/ml(10%)의 실험구에서 가장 높은 배반포기 배의 발육율을 나타냈다. 또한 각각의 6탄당과 IGF-I 또는 EGF 유, 무에 따른 초기배 발육율을 검토한 결과 IGF-I과 EGF 모두 glucose 첨가 시 타 첨가구에 비해 초기 발육 단계의 수정란 발육뿐만 아니라 배반포까지의 배발육(10～11%)이 타 첨가구(3～8%)에 비해 높게 나타났다. 한편, 각각의 6탄당이 첨가된 배양액 내에 IGF-I파 EGF 공동첨가 유, 무에 따른 초기배 발육율을 검토한 결과 모든 실험구에서 EGF와 IGF-I 첨가 시 무첨가보다 높은 초기 배 발육율을 나타냈으며 특히 초기 분열단계 수정란에서는 발육의 차이가 크게 나타났다. 본 연구 결과 성장인자와 6탄당의 첨가는 돼지 수정란의 체외배양 시 초기배 배발육에 효과적인 영향을 미치는 것으로 사료되며, 이는 체외 발육율이 타 가축에 비해 낮은 돼지의 수정란 생산에 있어 체외배양체계의 개선을 위한 기초자료가 될 수 있을 것이라 기대된다.

• Korean Journal of Animal Reproduction
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• v.24 no.4
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• pp.347-356
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• 2000

포유동물의 난소 내에는 많은 수의 primordial follicles 과 preantral follicles 이 존재하고 있으며, 이것은 수정란을 체외생산하기 위한 잠재적인 난자의 공급원이 될 수 있다. 생쥐 preantral follicles 내에 존재하는 난자의 체외성장과 발달을 위하여 몇몇 배양체계가 개발이 되었으며, 적당한 배양조건에서 감수분열 능력이 없는 preantral follicles 내의 난자가 체외배양을 통하여 난자 직경이 증가하고 완전한 핵성숙을 하는 것으로 나타났다. 또한, 체외성장 및 성숙된 난자로부터 생쥐 산자의 성공적인 생산은 preantral follicles 내의 난자가 체외배양을 통해서도 완전한 발달능력을 얻을 수 있음을 입증하였다. 그렇지만, 생쥐 preantral follicle로부터 수정란의 체외생산능력은 매우 낮은 것으로 보고되고 있다. 한편 사람을 비롯한 돼지, 소와 같은 중ㆍ대가축의 경우에는 pre antral follicle의 체외배양을 통하여 감수분열능이 있는 단계의 난자로까지의 발달이 아직 보고가 되지 않고 있다. 따라서 지금까지의 연구결과들을 종합해 볼 때, preantral follicles의 체외배양조건을 개선하거나 새로운 배양체계를 개발에 대한 많은 연구가 요구되고 있다. 사람과 중ㆍ대가축의 preantral follicles의 체외배양체계의 확립은 우수한 형질을 가진 동물의 확장, 희귀동물 혹은 멸종위기 동물의 보존에 이용될 수 있을 것이며, 그리고 암치료를 위하여 화학적, 방사선 치료를 받아야 하는 여성에게서 향후에 불입치료를 위한 방법으로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

• Proceedings of the KSAR Conference
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• 2004.06a
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• pp.255-255
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• 2004

본 연구는 한우 체세포 복제수정란의 발달에 있어서 난자가 체외성숙 된 시간이 미치는 영향을 확인하고, 또한 체외성숙 시간별 성숙난자의 MPF 활성도 변화를 조사함으로서 소 복제수정란 생산을 위한 적정 체외성숙 조건을 살펴보는데 목적이 있었다. 도축된 한우로부터 채취된 난소로부터 미성숙 난자를 채취하여, 1 ㎍/㎖ FSH와 1 ㎍/㎖ E2가 첨가된 TCM-199 배양액에서 18, 20, 22시간 체외성숙 후에 각각 성숙난자를 회수하여 22시간째 제핵을 실시하였다. (중략)

• Proceedings of the KSAR Conference
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• 2003.06a
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• pp.58-58
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• 2003

포유동물 체외 수정란의 체외 발육율을 향상시키기 위해서는 배양액내에 생성되는 free radical을 제거하는 것이 한가지 요인으로 지적되고 있다. 체외 배양액내에 생성되는 free radical을 제거하기 위하여 여러 종류의 항산화제 첨가 배양이 많이 이용되어 체외발육성적을 향상시키고 있다. 포유동물의 번식에 있어서 Melatonin은 광주기 조절 작용에 기여하는 호르몬으로서 혈중 Melatonin의 농도는 번식 작용에 중요한 역할을 하며, 또한 수정란의 세포분열과 세포주기에 영향을 미치며 배양액내의 free radical을 제거하여 수정과 초기 수정란 발달에 영향을 미쳐 항산화 기능이 있는 것으로 보고되고 있다.

• Korean Journal of Animal Reproduction
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• v.22 no.3
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• pp.207-211
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• 1998

본 연구는 소 미성숙 난자의 동결에 있어서 미성숙 난자의 1, 2, 4, 8 시간 성숙배양한 다음 동결 융해 후 체외배양하였을 때 체외수정율과 생존율을 조사하고저 수행하였다. 미성숙 난자들 1∼8시간 성숙배양후 동결융해 및 체외수정시켰을 때 수정율은 12.8∼30.9%로서 단시간의 체외성숙 배양이 높게 나타났으며(23.8∼28.8%), 또한 체외배양시 생존율은 11.8∼29.9%를 나타냈다.

• Journal of Embryo Transfer
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• v.19 no.3
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• pp.275-282
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• 2004

This study was carried out to examine the effects of development media and those change on in vitro development (IVD) of porcine oocytes matured and fertilized in vitro. Putative embryos, which were matured in vitro in modified NCSU-23 (mNCSU-23) supplemented with 10％ porcine follicular fluid (pFF) and were fertilized in mTBM, were developed in vitro as the experimental scheme. The results are as follows. When porcine putative embryos were cultured in vitro in NCSU-23 or CZB/Pig-MEM, the percentage of oocytes cleaved was not different between two systems, but the percentage of blastocysts in NCSU-23 was significantly higher than in CZB/Pig-MEM (P<0.05). And when porcine putative embryos were cultured in vitro in NCSU-23 during 7 days with or without changing media at day 5, which was supplement with or without 10％ fetal bovine serum(FBS), the percentage of oocytes cleaved, blastocysts at day 6, and the cell number of ICM, TE and total of blastocysts at day 7 were not different among three treatments. As a result of this study, it is supposed that NCSU-23 be more favorable, to develop porcine embryos derived from IVM/IVF, than CZB/Pig-MEM, but that demonstration on the effects of changing medium with fresh one stand in need of the more experiments.

• Journal of Embryo Transfer
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• v.18 no.1
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• pp.15-25
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• 2003

발생학에서 키메라(chimera)는 2개 이상의 다른 유전자형의 세포, 또는 다른 종의 세포로부터 만들어진 1개의 생물개체를 뜻하는 말로, 이는 초기 수정란의 발달과 포유류의 분화를 연구하는데 이용되고 있다. 키메라를 만드는 방법에는 할구와 내세포괴를 응집시키는 방법과 배반포 내에 여러 종류의 세포를 주입하는 방법이 있다 본 실험에서는 서로 다른 두 가지 방법의 활성화 처리법, 즉, ionomycin 처리 후 Cycloheximide (CHX) 또는 6-Dimetylaminopurine (6-DMAP)에 따른 단위 발생란의 분할과 단계적인 발달율을 살펴 보고자 하였으며, 서로 다른 방법에 의해 생산된 단위발생란 유래의 할구와 체외수정란 유래 할구를 응집하여 키메라 수정란(chimeric embryo)를 만든 후 체외수정란과 발달율을 비교해 보았다. 도축장 유래의 난소에서 난자를 채취하여 체외에서 22~24시간 성숙시킨 후 난구세포를 제거하고 metaphase II 단계의 난자를 5 $\mu$M ionomycin에 4분간 처리한 후, 10 $\mu$g/ml CHX/5 $\mu$g/ml cytochalasin B (CCB)에 5시간 또는 1.9 mM 6-DMAP에 4시간 처리하여 분할율과 배반포기 발달율을 비교 조사하였다. 난자 분할율에서는 체외수정란과 6-DMAP처리 단위 발생란에서 각각가 83.7 와 85.5%로 CHX/CCB 처리 단위발생란의 57.9%보다 유의적으로 높게(P<0.05) 나타났으며, 배반포기 발달율에 있어서는 체외수정란의 발달율이 27.8%로 6-DMAP처리 활성란 12.3%와 CHX/CCB 처리 활성란 5.3%보다 유의적으로 높게 (P<0.05) 나타났다. 키메라 수정란(chimeric embryo)은 서로 다른 두 가지 처리에 의해 생산된 단위발생란의 할구 2개와 체외수정란 유래의 할구 2개를 빈 투명대 내에서 응집시켜 제조하였다 빈 투명대 내에 키메라 수정란(chimeric embryos)의 8 세포기까지의 발달율은, 체외 수정란 할구 2개와 CHX/CCB 처리에 의한 할구 2개를 응집한 그룹은 46.1%, 체외 수정란 할구와 6-DMAP 유래 할구 2개를 응집한 그룹은 52.8% 였으며, handled control은 54.7%로 체외 수정란 77.7%에 비해 유의적으로 낮게(P<0.05) 나타났다. 배반포기까지의 발달율은 체외 수정란과 CHX/CCB에 의해 생산된 키메라 수정란(chimeric embryo)은 12.8%, 체외 수정란과 6-DMAP에 의한 키메라 수정란(chimeric embryo)은 18.8%로 handled control의 21.4%에 비해 유의적으로 낮았으며(P<0.05), 이들 키메라 수정란(chimeric embryos)은 체외 수정란의 34.9%에 비해 유의적으로 낮게(P<0.05)나타났다. 6-DMAP 처리 단위발생이 유기된 수정란 할구 2개와 체외수정란의 할구 2개의 응집에 의한 키메라 수정란(chimeric embryos)의 발달율이 CHX/CCB와 체외수정란의 응집에 의한 키메라 수정란(chimeric embryos)에 비해 다소 높게 나타났으나, 유의적인 차이는 없었다. 본 실험의 결과 서로 다른 방법에 의한 단위 발생란 유래의 할구와 체외 수정란 유래의 할구가 응집에 의한 재조합이 가능하였고 이들을 체외에서 배양하여 배반포기의 수정란까지 발달시켰다.

• Proceedings of the Korean Society of Developmental Biology Conference
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• 2003.10a
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• pp.115-115
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• 2003

아미노산은 수정란의 체외생산에 있어서 배발달에 유효하게 작용한다. 이러한 이유로 체외배양 단계에 아미노산 첨가에 관한 보고는 많지만, 체외성숙 단계에서의 아미노산 효과와 관련된 보고는 소수이다. 본 실험에서는 먼저 체외성숙 배지에 NEAA와 EAA군들의 첨가 농도가 PB 출현율, 배발달율 그리고 생산된 배반포의 세포수에 미치는 영향과 더불어 새로운 아미노산원으로 LAH의 효과를 검토하였다. 체외성숙을 위한 난포란은 도축 한우 난소에서 2-8mm의 가시난포로부터 회수하였다. 체외성숙용 배지는 10% FBS가 첨가된 CRlaa 용액을 사용하였고, 실험1에서는 NEAA와 EAA(20$\mu l$/ml)군을 각각 $\times$l (NEAA:10$\mu l$/ml, EAA:20$\mu l$/ml), $\times$2 및 $\times$4를, 실험2에서는 LAH를 각각 1, 5 및 10 mg/ml를 첨가하였다. 체외수정은 fer-TALP 용액을, 체외배양은 CRlaa 용액을 배양 2일째까지는 0.3% BSA를, 그 이후에는 10% FBS와 난관상피세포를 첨가하여 사용하였다. 그리고 배양 8일째 확장배반포의 세포수를 조사하기 위하여 이중형광염색을 실시하였다. 통계분석은 $X^2$-test를 이용하였다. 실험 1에서 NEAA와 EAA 첨가 농도에 따른 PB 출현율은 $\times$l 첨가군(46.6%)이 대조군(29.9%)에 비하여 유의적으로 높았다. 수정을, 8세포기 및 배반포까지 발달율은 비슷한 경향이었으나, $\times$l 첨가군이 가장 높았다. 한편 ICM 세포수가 아미노산 첨가 농도의 높을수록 증가하는 경향이었고, 특히 $\times$4 첨가군($23.9 \mu 3.9$)이 대조군($14.8 \mu 2.5$)에 비하여 유의적(P<0.05)으로 높았다. 실험 2에서 LAH 첨가에 따른 핵성숙율은 5mg 첨가군, 배반포까지 발달율은 1mg 첨가군(25.9%)이 각각 가장 높았다. 배양 8일째 배반포의 세포수에 있어서 총세포수와 TE 세포수는 차이가 없었으나, ICM 세포수가 l0mg 첨가군에서 가장 높았다. 본 실험 결과에서 체외성숙 배지에 NEAA와 EAA 첨가가 배발달율에는 효과가 없었지만, 첨가농도의 증가에 따라 ICM 세포수가 증가하였다. 한편 체외성숙 배지에 LAH 첨가는 첨가 농도가 높을수록 배발달율은 낮았지만 ICM 세포수는 증가하였다.