풍미가 강력하고 신속발효가 되는 청국장의 우점종인 젖산균 Enterococcus spp.를 발효종균으로 활용하여 재래식 간장모양의 풍미를 가지는 대두발효물을 제조하고자 하였다. 119종의 Enterococcus spp. 중에서 protease 활성이 높은 8종을 선발하여 E. faecium 4종, E. faecalis 3종, E. gallinarium 1종으로 동정하였다. 8종의 항생제에 내성이 낮았고, vancomycin 유전자도 없으며, 5% NaCl 함유 배지에서도 protease 분비가 우수한 E. faecium O24를 발효 종균으로 선정하였다. 증자한 대두 백태에서 생육이 우수하였으며, 발효생성 조미 아미노산 중 80 mg% glutamic acid, aspartic acid를 생성시켰으며, lactic acid와 여러 유기산을 생성하였다. Z. rouxii와 C. versatilis와의 혼합배양으로 간장 고유취인 maltol, guaiacol 등의 향기성분도 합성됨을 확인하였다. 그러므로 청국장 젖산균인 Enterococcus spp.는 신속하게 다양한 향미성분을 생산하여 간장태의 대두 발효의 종균으로 사용이 가능할 것으로 보인다.
본 연구는 일반 개량누룩 1종류(MN)와 시판되고 전통제조방식으로 제조된 4종류의 전통누룩(SH, SS, JJ, and SJ)을 구입하여 단양주를 제조하고 이들 단양주의 발효특성을 비교 분석하고자 하였다. 각 누룩으로 제조한 탁주의 pH는 담금 직후부터 24시간 까지 급격히 감소하는 경향을 보였고, 적정산도는 급격히 증가하였다. Maltose 함량은 담금 직후에는 0.49-2.68% (w/v)였고, glucose의 함량은 1.03-2.07% (w/v)으로 나타났다. T-SH와 T-SS의 ethanol 함량이 7일까지 높은 경향을 나타내었다. 전체적인 ethanol 의 함량은 12시간부터 ethanol의 함량이 증가하기 시작했으며, 발효 7일부터 21일까지 13.08-14.96% (w/v)로 유지되었다. 발효과정 중 유리아미노산 함량 분석 결과 glutamic acid, threonine, serine과 glycine 함량을 각각 T-JJ은 104.157, 42.855, 69.715, and 53.035 mg/100 g으로 가장 높았다. 탁주 유기산으로 lactic acid, citric acid, succinic acid, acetic acid가 주요 유기산으로 나타났으며 유기산총량은 T-SS, T-JJ 가 2286.21 mg/100 g, 1983.5 mg/100 g 순으로 가장 높은 값을 나타냈다. 총균수, 젖산균수, 효모 수 모두 시간이 지날수록 급격히 증가하다가 발효 1일에 감소하다 완만한 증가 후 발효가 끝나는 21일까지 점차 감소하는 비슷한 경향을 나타내었다. 관능검사결과 과일향은 T-SH, 단맛은 TSS, 신맛은 T-SS가 가장 높았으며 알코올향, 알코올맛, 쓴맛은 시료간 유의적으로 차이가 나타나지 않았다. 따라서 대체적으로 전통누룩으로 담근 탁주의 아미노산 함량과 유기산 함량이 개량누룩으로 담근 탁주의 아미노산 함량보다 높은 것으로 보아 전통누룩으로 담근 탁주의 다양성에 대한 잠재력을 확인할 수 있었다. 또한 각 누룩들의 젖산균을 분리동정하였는데 분리된 균들은 대체적으로 Leuconostoc, Weissella, Pediococcus과 Lactobacillus속에 속하였다.
젖산균을 접종하여 감귤 분쇄액을 발효시켜 얻은 감귤발효물의 어류양식 사료 첨가제로의 가능성을 넙치(Paralichthys olivaceus) 양식에서 검토하였다. 김치에서 항균활성이 우수한 젖산균 W-44를 분리한 후 16S rDNA 염기서열 분식을 통하여 Lactococcus lactis W-44로 동정하였다. L. lactis W-44를 이용하여 감귤 분쇄액 발효를 수행한 결과, 생리활성이 우수한 무배당체 flavonoids인 naringenin, hesperitin의 함량이 각각 약 10과 6배 증가함을 확인하였다. L. lactis W-44를 이용하여 발효된 감귤발효액을 양식넙치의 사료첨가제로 투여한 결과, 감귤발효액을 투여하지 않은 대조구의 평균 전장 및 체중 증가율과 현격한 차이가 있었다. 또한 0.2% (v/v)의 감귤발효액을 투여한 실험군에서 넙치의 성장이 가장 우수한 것으로 나타났다. 이러한 결과로부터 젖산균의 감귤발효산물을 넙치 양식에서 기능성 사료첨가제로 사용할 수 있는 가능성을 확인하였다.
저온발효된 김치에서 분리되어 Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides, Leu. mesenteroides subsp. dextranicum, Leu. paramesenteroides, Leu. lactis, Lactobacillus bavaricus 및 Lac. homohiochii로 각각 동정된 저온성 젖산균 60주에 대하여 여러 조건에서의 배양특성들을 조사하였다. 모든 균주들이 $5^{\circ}C,\;10^{\circ}C$ 및 $37^{\circ}C$에서 증식하였고, $45^{\circ}C$에서는 증식하지 못하였다. 최적 증식 온도는 Leu. mesenteroides의 균주들은 $33{\sim}34^{\circ}C$이었고, Lactobacillus속의 균주들은 $34{\sim}36^{\circ}C$이었다. Leu. mesenteroides와 Lactobacillus속의 균주들은 모두 초기 pH 4.8 및 4.2에서 증식하였으나 4.0에서는 증식하지 못하였다. Glucose broth에서의 최종 pH는 Leu. mesenteroides의 균주들은 $3.85{\sim}4.10$이었고, lactobacillus속 균주들은 $3.82{\sim}3.99$이었다. 60균주 모두 litmus milk에서 우유를 응고시키지 못하였고, litmus를 환원시키지도 못하였다. Leu. mesenteroides와 Lactobacillus속의 균주들은 모두 에탄올 7% 함유배지와 NaCl 6.5% 함유배지에서 증식하였고, 에탄올 15% 함유배지와 NaCl 10% 함유배지에서는 증식하지 못하였다. 모든 균주들이 pH 3.5인 인공위액과 40%의 담즙액에서 내성을 나타내었다. 특히 Leu. mesenteroides의 균주들은 모두 pH 3.0인 인공위액에서도 내성을 나타내었다. 본 젖산균들의 생리적인 특성은 여러 점에서 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology에 기재된 내용들과 일치하지 않으므로 더욱 정밀한 조사를 실시하여 분류학상의 위치를 정확히 밝혀 볼 필요가 있을 것으로 생각되었다.
본 연구는 경기도 일대의 배추김치로부터 젖산 생성능이 우수한 젖산균주 분리 및 두유 발효 특성에 대해 조사하였다. 먼저 0.01% bromocresol green이 첨가된 MRS 한천 배지에서 clear zone의 size 측정을 통하여 우수한 젖산 생성능을 갖는 균주를 선발 후 탄수화물 이용성 조사 및 16S rRNA 염기서열 분석으로 L. plantarum Gk04, Ped. pentosaceus Gk07, L. brevis Gk35 및 L. curvatus Gk36이 동정되었으며 특히 99%의 상동성을 갖는 L. curvatus Gk36을 두유발효를 위한 최종균주로 사용하였다. L. curvatus Gk36과 시판 균주 L. actobacillus에 의한 두유 발효 결과 pH는 L. actobacillus에서 유의적으로 더 낮은 것으로 나타났으나 생균수 및 산도 측정 결과 두 균주간에 유의적 차이가 없는 것으로 나타나 L. curvatus Gk36 균주는 두유발효 등 발효제품 제조를 위한 젖산균 균주로 이용이 가능할 것으로 판단되었다.
폴리 젖산의 원료가 되는 젖산은 D-, L의 광학이성질체로 존재하는데 L젖산 폴리머와 라세미 폴리머는 결정성과 녹는점이 다르므로 플라스틱으로서의 만족할 만한 물성을 기대하기 위하여 원료로서 광학적으로 순수한 L-lactic acid가 요구된다. 이를 위하여 한 종류의 이성질체만을 선택적으로 생산하는 젖산균주를 탐색하여 분리함으로써 광학적으로 순수한 산물을 얻을 뿐만 아니라 이러한 발효법에 의한 젖산생산은 자연계에 풍부한 starch나 cellulose, 음식물쓰레기와 같은 재생 가능한 자원을 기질로 사용하여 젖산발효에서 전분의 당화 공정에 필요한 시간과 노력을 최소화하며 젖산 생산에 드는 전체적인 비용을 절감할 수 있다. 전분을 직접 이용하는 것은 젖산균의 일반적인 성질이 아니므로 전분이 풍부한 누룩을 수집하여 직접적으로 전분을 분해하여 젖산발효를 수행하는 균주를 누룩에서 분리하였다. 분리균주는 형태학적, 배양학적,생화학적 특성 및 16s rDNA 분석을 통하여 Enterococcus sp.으로 동정되어 Enterococcus sp. JA-27로 명명하였다. 생육에 따른 L-lactic acid의 최적 생산 조건을 검토한 결과, 최적 배지조건은 탄소원으로 1.5% soluble starch, 질소원으로 3.5% tryptone, 그 외의 다른 조성들은 0.1% $K_2$$HPO_4$, 0.04% $MgSO_4$$.$$7H_2$O, 0.014% $MnSO_4$$.$$4H_2$O, 0.04% $MgSO_4$$.$$7H_2$O이었고 최적 배양조건은 $30^{\circ}C$, pH 8이었다. 대량생산을 위한 기초자료를 제공하기 위하여 회분배양과 유가배양을 실시하였고, 회분배양이 L-lactic acid의 생산수율(0.134 g, L-lactic acid/g, soluble starch)이 더 높게 나타나 효과적이었다. 7 L 발효조 배양시 pH를 control한 결과, L-lactic acid 생산이 삼각플라스크에 비해 1.5배 더 증가하였다. 배지 중의 젖산을 정제하기 위한 방법으로 이온교환 칼럼크로마토그라피(ion-exchange column chromatography)를 사용하였고 일련의 정제 과정을 통하여 배양액 중의 L-lactic acid 정제 수율은 약 85% 정도로 나타났으며 HPLC로 분석한 결과 99.7%의 순도를 확인할 수 있었다.
김치 소비가 증가하면서 공장에서 큰 규모로 만들어지게 되었다. 그래서 상업용 김치의 위생 상태는 주 관심사가 되었다. 충분히 발효되지 않은 상업용 김치로부터 17종의 대장균유사세균(coliform bacteria)을 분리하였다. 16S rDNA 분석에 의하여 Enterobacter intermedius, Ent. cloacae, Ent. amnigenus, Klebsiella terrigena, K. ornithinolytica, K. oxytoca, Hafnia alvei 등의 3속 7종으로 부분 동정되었다. 한편, 오래된 배추김치로부터 Lactobacillus paraplantarum KNUC25라고 부분 동정된 젖산균이 분리되어 그의 항미생물 활성이 보고되었다. 이 균주는 spot-on the lawn test와 세포생존실험을 통하여 본 연구에서 분리한 대장균유사세균과 몇몇 유해한 대장균유사세균에 대하여 항세균 활성을 보여 주었다. 상업용 김치에 있는 대장균유사세균은 L. paraplantarum KNUC25균주 배양 상층액의 첨가에 의하여 효과적으로 억제되었다.
분변과 요구르트에서 10주의 젖산균을 분리하여 이중 6주는 Bifidobactria로 4주는 Lactobacilli로 동정하였다. 이들은 이용하여 8% 증숙밤용액을 발효시켰을 때 발효액의 산도는 요구르트보다는 낮았으나 두유를 비롯한 식물성 요구르트보다는 2배이상 높았다. 산도를 증가시키기 위해 Yeast extract 와 tryptone peptone를 첨가할 때 0.2%와 0.4%의농도에서 가장 높았다. 포도당을 0.5-0.8% 범위의 첨가하였을 때 lactobacilli에 의한 발효액에서는 산생성이 촉진되었으나. bifidobacteria 에서는 그렇지 않았다. 시험된 과일과 채소즙 중에서는 당근즙의 첨가가 가장 큰 촉진 효과를 나타내었다. 25% 밤용액에서는 고지추출액에 의한 가수분해는 젖산생성을 크게 촉진하였으나 가수분해하지 않은 8% 밤용액에서는 젖산생성량과 비교하였을 때 산생성 순증가량은 그다지 크지 않았다.
한방발효음료를 제조하기 위하여 한방감주의 젖산발효를 유도하였다. 이를 위해 각종 시료로부터 다양한 젖산균을 순수 분리하여 발효적성을 검토한 결과 최적균주로서 LAB19 균주를 선별하였다. LAB19 균주는 곶감으로부터 분리하였으며 생리 화학적 특성 및 16S rRNA 염기서열 분석을 통하여 Leuconostoc mesenteroides로 동정되었다. 한방감주에 종배양한 LAB19 균주를 2.5%(v/v) 접종하고 $25^{\circ}C$에서 60시간 발효시켰을 때, 한방감주는 141.3 g/L의 환원당과 5.33 g/L의 유기산, 그리고 1.19 g/L의 가용성 페놀을 함유하고 있었다. 당과 유기산 구성을 살펴보면 당의 약 90%는 맥아당이었으며, 유기산의 58%는 젖산이었다. 수용성 phenolics 성분 등에 기인하는 라디칼 소거 활성은 L-ascorbic acid의 92.4% 보다 낮은 76.6-75.7% 범위를 유지하고 있었다.
본 연구에서는 선행 발효두유에서의 산미 이취를 개선시키기 위해 한국 전통발효식품인 김치로부터 젖산균을 분리 및 동정하였다. 분리된 89주의 균주 중 두유 발효 시 산미 이취를 생성하지 않는 균 3주(Strain No. R53, R83, R84)를 임의로 분리하였다. 생물학적, 형태학적 및 16S rRNA 유전자 염기서열 등과 같은 생화학적 분석 결과 최종적으로 3주의 균은 W. koreensis 동정되었다. 최종적으로 이 3주의 균 중 가장 산미 이취를 적게 생성하는 것으로 판단되는 Strain No. R83을 최종 실험 균주로 사용하였으며 이 균주를 W. koreensis KO3로 명명하였다. W. koreensis KO3을 이용하여 최적 발효두유를 제조하였으며 이화학적 특성을 알아보았다. $30^{\circ}C$에서 12시간 발효시켰을 때 생균수가 $8.71{\times}10^8CFU/ml$로 가장 생육이 뛰어났으며, 이때의 pH와 산도는 각각 6.02, 0.33%를 나타내었다. 일반성분은 수분 94.06%, 조회분 0.18%, 조단백 2.71%, 조지방 1.16%, 조섬유 0.01%로 측정되었다. 아미노산 분석 결과 27종의 아미노산과 유도체들이 확인되었다. 단맛을 가지는 아미노산으로 알려진 serine, glycine, threonine, alanine, aspartic acid 함량이 증가하였고 발효 전에는 검출되지 않았던 ornithine이 생성되었다. 관능평가에 있어서는 선행 발효두유에 비해 모든 항목에서 개선된 평가를 얻었다. 따라서 관능검사, pH 및 산도 그리고 아미노산 분석을 결과를 토대로 볼 때 W. korensis K03로 제조한 발효두유는 음료로서 가능성이 있다고 생각되며 향후 연구를 통해 기능성 성분이 탐색 된다면 새로운 형태의 건강식품개발의 기초 자료로서 활용 가능할 것으로 보인다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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