• Journal of Embryo Transfer
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• v.21 no.4
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• pp.323-330
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• 2006

본 연구의 목적은 3주 동안 장기간 냉각상태로 보관된 개 정자의 기능적 특성을 알아보고자 두 종류의 정자 희석액, Glucose-BSA(G-BSA), Dimitropoulos-II(BIMI)가 정자의 기능적 특성에 미치는 영향을 알아보고자 한다. 개 정액을 수지법에 의해 채취하여 원심분리한 후 정장은 제거하였다. 정자를 G-BSA나 DIMI으로 희석하여 최종 농도를 $100\times10^6$ sperm/ml로 하였다. 희석된 정자를 정자 운송 시스템을 이용하여 루지애나 주립 대학에서 뉴올리언즈 실험실까지 운송하였다. 정자 운송 시스템은 $20^{\circ}C$에서 $9^{\circ}C$까지 분당 $0.08^{\circ}C$ 냉각율로 설정하였다. 희석된 정자는 $4^{\circ}C$에서 3주간 보관하였다. 보관 1일부터, 매주 단위로 정자의 활력, 정자 원형질막 고유성(생존성), 정자 첨체의 고유성을 검사하였다. 또한 체외조건하에서의 정자 번식 능력을 평가하기 위해 zona binding assay를 실시하였다. 실험 결과 냉각 상태로 3주 동안 보관된 개 정자는 여전히 정자의 기능적 특성을 나타냈다. 냉각기간이 길어질수록 정자의 활력 및 생존성은 감소하였으며(P<0.01), 첨체의 고유성은 냉각기간에 따라 감소하였으나 유의성은 없었다. 정자의 특성 중 활력이 다른 특성에 비해 냉각처리에 민감한 반응을 보였다. G-BSA배지에 보관된 정자의 활력 및 생존성이 DIMI에 비해 높게 나타났으며, 1 주 동안 보관된 정자의 생존성의 비교시 유의성이 높게 나타났다(P<0.05). 그러나 첨체의 고유성은 1일 동안 DIMI에 보관된 정자에서 높게 나타났다(P<0.05). 3주 동안 냉각상태로 보관된 개 정자는 여전히 난자의 투명대에 결합하는 능력을 보였으며, G-BSA에 보관된 정자의 경우 난자에 부착되는 평균 정자 수가 보관일수에 따라 유의적으로 감소하였다(P<0.05). 그러나 희석액 종류에 따른 난자에 부착되는 평균 정자 수의 유의적 차이는 없었다. 정자의 활력 및 생존성과 난자의 투명대에 결합하는 정자 수와의 상관관계를 본 결과, 활력 및 생존성이 높은 정자일수록 난자의 투명대에 많이 결합하여 정자의 잠재적 번식력이 증가함을 보였다. 결론적으로 G-BSA나 DIMI의 희석액으로 희석된 후 $4^{\circ}C$에서 냉각 보관된 정자는 3주 동안 정자의 기능적 특성을 유지하였으며 냉각 보관 2주까지 좋은 성적의 정자 특성을 나타냈다. 개 정자 냉각 보존에 대안적인 희석액으로 G-BSA도 사용 가능한 것으로 사료된다.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• v.36 no.1
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• pp.45-53
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• 2009

Objectives: To determinate the optimal culture condition to maintain lifespan in human sperm, we evaluated the effect of different temperature on sperm motility and viability up to 5 days in normal specimens. Methods: Ejaculated semen samples with normal semen parameters were gently washed in HEPES buffered Tyrod's-Albumin-Lactate-Pyruvate (HTALP) media. Each 5 ml of HTALP + 0.3% albumin with $1{\times}10^6$ sperm/ml was incubated for 5 days in $37^{\circ}C$, $22^{\circ}C$, and $4^{\circ}C$. The sperm motility and kinematics were analyzed using computer assisted sperm analysis (CASA), membrane integrity was assessed by hypoosmotic swelling test (HOST), and capacitation status was evaluated by chlorotetracycline (CTC) fluorescence pattern. Each parameter was measured on day 1, 3, and 5, respectively. Results: The motility, viability and live/uncapacitated pattern were demonstrated significantly in temperature- and time-dependent difference (p<0.05). While the sperm cultured for 1 day in each temperature was not significantly different, the sperm cell kept in $22^{\circ}C$ after 3 days were preserved sperm motility, viability, membrane integrity, and F pattern better than in other culture temperatures. Conclusions: HTALP can be used a basic medium for culture and longevity preservation, and sperm cell kept at $22^{\circ}C$ is beneficial for assisted reproductive techniques.

• Journal of Embryo Transfer
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• v.14 no.1
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• pp.69-77
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• 1999

본 연구는 돼지 정액의 동결과정동안 flow cytometric 분석에 의한 정액내 생존정자의 비율을 조사하여 주관적으로 평가되는 활력 및 정상첨체율(normal apical ridge ; NAR)과 비교하여 정자의 손상과 생존성에 대한 적절한 평가법을 찾기 위하여 실시하였다. 동결과정 중 정액채취, 냉각, 예비동결 및 동결융해 후에 flow cytometric 분석에 의한 정자 생존율은 각각 93.0$\pm$3.6, 85.1$\pm$3.9, 28.9$\pm$6.8 및 26.1$\pm$5.9%이었다. 동결처리동안에 생존율은 예비동결 및 동결융해 후 가장 많은 정자사멸로 동결상태 이전의 생존율보다 유의적으로 낮게 나타났다. (p<0.05). 평가기법으로 정액 채취시 활력, NAR율 및 생존율을 조사한 결과 각각 91.0$\pm$4.2, 96.8$\pm$2.5 및 92.2$\pm$3.2%로 NAR율이 생존성 및 활력보다 높게 평가되었으며, 생존율이 활력보다 다소 높게 평가되었다. 그러나 동결융해 후에는 각각 44.0$\pm$8.9, 49.0$\pm$7.9 및 35.6$\pm$9.7%로 활력이 생존율보다 다소 높게 평가되었다. 전체적으로 NAR율은 활력은 생존율보다 높게 평가되었으며, SYBR-14 / PI(propidium iodide) 이중형광염색법에 의한 flow cytometric 평가법으로 생존율은 동결되지 않은 정액에서의 활력 및 NAR 평가보다 다소 민감하게 나타났다. 이러한 결과로 미루어보아 SYBR-14 / PI 형광염색에 의한 flow cytometry의 생존성 평가는 동결되지 않은 정액의 평가방법으로는 적절하지만 동결된 정액의 생존성 평가는 부적절한 것으로 사료되었다.

• Journal of Veterinary Clinics
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• v.28 no.1
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• pp.13-19
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• 2011

Semen cryopreservation induces the formation of reactive oxygen species (ROS), and the ROS cause sperm damage. We aimed to investigate the effects of the antioxidative enzyme catalase (CAT) on sperm quality and ROS during cryopreservation. Sperm rich fractions collected from five Duroc boars were cryopreserved in freezing extender with (200 or 400 U/mL) or without CAT (control). After thawing, sperm motility, viability, normal morphology, plasma membrane integrity, mitochondrial function and intracellular ROS were evaluated. CAT significantly improved total sperm motility at a concentration of 400 U/mL (P < 0.05), but didn't improve progressive sperm motility, viability, morphological defects, plasma membrane integrity and mitochondrial function in frozen-thawed boar sperm. In evaluation of ROS, CAT had no effect on reduction in ${\cdot}O_2$, but scavenged $H_2O_2$ in viable frozen-thawed boar sperm at concentrations of 200 and 400 U/mL (P < 0.05). In conclusion, CAT was not enough to improve quality of frozen-thawed sperm, but can reduce $H_2O_2$ generation in viable boar sperm during cryopreservation.

• Journal of Veterinary Clinics
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• v.24 no.4
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• pp.486-492
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• 2007

Seminal plasma(SP) is usually removed from semen that is to be cryopreserved. However, some reports indicate that SP has beneficial effects on spermatozoa during chilling and freezing. The purpose of this study was to determine the effect of SP on sperm survival by adding SP to the extender before cooling and freezing canine spermatozoa. In replicate experiments, ejaculates obtained from four healthy dogs(1-4 years old) of various breeds were pooled, centrifuged at $300{\times}g$ for 10 min at $25^{\circ}C$, and the supernatant of seminal plasma was decanted. Spermatozoa were suspended in egg yolk-Tris(EYT) buffer. The study comprised two experiments: [Exp 1] Sperm were suspended in EYT extender containing either 0, 20, 40, 80 or 100% SP and were slowly cooled to $4^{\circ}C$ for 2h or held at $25^{\circ}C$ as controls. Sperm concentration was adjusted to $2{\times}10^8/ml$. [Exp II] Sperm samples, each of which contained $1{\times}10^8/ml$, were assigned to nine groups to be frozen. In the first four groups, sperm in EYT containing either 20, 40, 80 or 100% SP were cooled to $4^{\circ}C$, then diluted to contain final concentrations of EYT+0.6M glycerol and then were frozen. The final concentrations of SP were 10, 20, 40 or 50%. In the other four groups, sperm in EYT alone were first cooled slowly to $4^{\circ}C$, then diluted to contain final concentrations of EYT+0.6M glycerol plus 10, 20, 40 or 50% SP and then were frozen. Spermatozoa, which chilled in EYT alone and diluted to contain final concentrations of EYT+0.6M glycerol without seminal plasma, and then frozen, was regarded as control. Spermatozoa were frozen at $25^{\circ}C/min$ of cooling rate in plastic straws that were suspended above liquid nitrogen and thawed in water at $38^{\circ}C$ for 1 min. Sperm survival was assayed by determining progressive motility and integrity of plasma and acrosome membranes. Progressive motility was determined by microscopic examination at $200{\times}$ magnification. Membrane integrity was assessed by use of a double fluorescent dye, and acrosome integrity by staining sperm with Pisum sativum agglutinin. The results of the first experiment showed that adding SP did not improve motility of spermatozoa compared to those incubated without SP regardless of temperature. The results of the second experiment showed that spermatozoa suspended in EYT+0.6M glycerol containing SP exhibited the higher progressive motility before being frozen(P<0.05). However, frozen-thawed spermatozoa that had suspended in EYT+0.6M glycerol containing SP showed the similar or lower viability(P<0.05). In summary, although seminal plasma did not affect spermatozoa that were chilled in EYT without cryoprotectant(CPA), addition of seminal plasma to EYT containing CPA did significantly improved progressive motility of canine spermatozoa that were chilled.

• Journal of Veterinary Clinics
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• v.32 no.1
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• pp.45-48
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• 2015

The purpose of this study was to select high-quality boar semen after the glass wool filtration of extended boar semen. After collecting boar semen, its concentration, morphology, viability, and motility were examined according the glass wool's height and time. After glass wool filtration, the sperm concentration decreased, but the proportion of normal sperms and the sperm viability increased. Nevertheless, the sperm motility showed no changes. The above results showed that the glass wool filtration of boar semen is a method of obtaining sperms with relatively low abnormal rates and high viabilities.

• Proceedings of the KSAR Conference
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• 2002.06a
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• pp.3-3
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• 2002

본 연구는 개의 동결정액제조 시 동결보호 희석액 내에 첨가되는 당의 종류와 조합이 동결융해 후 정자의 생존율 및 운동성에 미치는 영향과 정자동결 시 straw size, 예비동결 시 액체질소표면으로부터 straw까지의 거리 및 융해온도가 생존율에 미치는 영향에 대하여 조사하고자 실시하였다. 포유류의 경우 부생식선의 정낭선에서 분비되는 정장내에는 정자의 체외사출 후 정자의 영양물질인 fructose 가 분비되는데, 동결정액제조 시 회석액내에 첨가되는 당 성분은 fructose 및 glucose를 일반적으로 사용하고 있다. (중략)

• Korean Journal of Animal Reproduction
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• v.25 no.3
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• pp.201-206
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• 2001

This study was carried out to investigate the effects of spring (March~May) and summer (June~August) influencing semen characteristics, frozen-thawed sperm viability and serum testosterone concentration in Yorkshire boars. Results of this study were as follows: 1. There were no significant differences in the semen volume, pH and sperm concentration of sperm-poor fraction of Yorkshire boars between spring and summer. However, sperm concentrations of sperm-rich fractions in spring were higher than those in summer (P＜0.05). 2. Sperm motility and normal acrosome of raw semen in Yorkshire boars did not differ significantly between spring and summer, However, motility and normal acrosome of frozen-thawed sperm were higher in spring season than in summer season (P＜0.05). 3. Serum testosterone concentrations in Yorkshire boars were 4.04 ng/$m\ell$ in spring and 2.85 ng/$m\ell$ in summer. Serum testosterone concentrations in spring were higher than those in summer (P＜0.05). 4. In conclusion, when serum testosterone concentrations in Yorkshire boars were higher, frozen-thawed sperm viability was higher.

• Journal of Embryo Transfer
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• v.21 no.1
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• pp.77-83
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• 2006

본 연구는 개 동결 정액 융해 시 straw 크기 및 융해 속도가 융해 정자의 질(quality)에 미치는 영향을 조사하고 최적의 융해 조건을 조사하는데 그 목적이 있다. 정상적인 번식능을 가진 비글 수컷 5마리에서 정액을 채취하여 원심 분리하여 정장을 버리고 남은 정자에 동결보호제인 glycerol이 첨가된 tris-glucose-egg yolk extender를 첨가하여 동결하고 액체질소에 보관한 후 융해하였다. 동결 융해 조건에 따른 효과를 알아보기 위해 straw는 0.25 ml과 0.5 ml크기를 사용하였고 융해 조건은 $75^{\circ}C$에 10초, $55^{\circ}C$에 12초 및 $37^{\circ}C$에서 120초로 하여 융해 후 정자의 활력도(vigor), 운동성(motility), Hypo-osmotic test(HOS test)를 이용한 생존성(viability) 및 $SperMac^{\circledR}$ 염색을 하여 정자의 membrane integrity를 비교 조사하였다. 조사 결과 0.5 ml 크기의 straw를 사용한 경우 $37^{\circ}C$ 융해가 $55^{\circ}C,\;75^{\circ}C$ 융해보다, 0.25 ml 크기의 straw를 사용한 경우에는 $37^{\circ}C,\;55^{\circ}C$ 융해가 $75^{\circ}C$ 융해보다 유의적으로 높은 활력 지수 및 생존성을 보였다(P<0.05). Straw크기에 따라 비교하였을 경우 0.5 ml 군에서 유의적으로 높은 활력도, 생존성 및 membrane integrity를 보였다(P<0.05). 결론적으로 개 정액이 동결 및 융해 시 0.5ml straw를 이용하여 동결한 후 $37^{\circ}C$에서 120초 동안 융해하는 것이 최적의 조건임이 사료된다.

• Journal of Embryo Transfer
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• v.19 no.3
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• pp.301-306
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• 2004

본 연구는 개의 신선 및 동결 정소상체 정액과 정소상체 정액을 saline가 tris-buffer액으로 희석하고 원심분리에 의해 정장성분을 제거한 정액의 성상과 및 동결보존 시의 생존성 및 난포란과 정소상체 정자의 체외수정 후 체외수정율과 분할율에 대해 조사하였다. 개 정소상체 정액을 saline으로 희석한 정액을 20분간 배양했을 때 정자농도는 3.50$\pm$0.80${\times}$l0$^{6}$ cells/$m\ell$, 정자의 활력은 72.45$\pm$4.55%, 기형정자 수는 7.40$\pm$1.20%로 나타났으며, 대조군인 사출정액의 정자농도는 5.45$\pm$0.50${\times}$$10^{6}$cells/$m\ell$, 정자의 활력은 92.55$\pm$4.65%, 기형정자 수는 3.25$\pm$0.45%와 비교할 때 정자농도와 활력은 낮았으며, 기형정자 수는 많았다. 개 정소상체 정액과 tris-buffer로 희석한 정액을 20분간 배양했을 때 정자농도는 3.80$\pm$0.36${\times}$$10^{6}$ cells/$m\ell$, 정자활력은 78.45$\pm$3.50%, 기형정자 수는 5.54$\pm$0.85%였으며, 희석하지 않은 정소상체 정액의 성상에 비해 약간 높게 나타났다. Tris-buffer로 희석한 개 정소상체 정액을 동결 융해했을 때 생존율은 57.50$\pm$4.20%, 활력은 52.70$\pm$5.50%였으며, 희석하지 않은 대조군의 생존을 74.50$\pm$6.25%와 활력 78.50$\pm$5.20%에 비해 현저히 높게 나타났다. 개 난포란과 신선 몇 동결 정소상체 정자와 체외수정시켰을 때 체외수정율은 각각 63.10$\pm$6.45%, 49.50$\pm$4.28% 및 42.84$\pm$5.90%, 22.30$\pm$5.60%로서 신선 정자에 비해 동결 정소상체 정자로 수정시킨 군의 분할율이 유의하게 낮았다.