현대 유전체학 기술의 진보는 생물학적으로 중요한 의미를 갖는 생물들의 유전체 서열의 규명 genome sequencing)에 힘입은 바 크다. 기존의 유전체 서열결정법은 주로 염기변이율이 낮은 생물들에 초점을 맞추어 왔다. 하지만 염기변이율이 높은 생물들의 유전체 염기서열을 결정할 필요가 높아짐에 따라 이를 위한 방법론에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 염기변이율이 높은 생물들의 이배체 (diploid) 유전체 서열이 효과적으로 결정될 수 있을 경우 기존의 유전체 서열비교의 방법론에도 변화가 요청되고 있는 실정이다. 기존의 유전체 서열비교 (whole-genome alignment) 방법론은 반수체 (haploid) 유전체들의 서열비교을 위해 개발되었지만, 염기변이율이 높은 생물들의 유전체 서열비교에는 반수체 유전체들 비교에 특화된 도구들이 필요하다. 또한 현재 서열비교를 시각화하는 소프트웨어들도 반수체 유전체 비교를 위해 개발된 실정이다. 본 논문의 목표는 이배체 유전체 서열을 비교하는 방법론을 개발을 용이하기위해 이배체 유전체의 서열을 생성하는 도구를 개발하는 것이다. 개발된 도구는 실제 일어날 수 있는 염기변이와 genomic rearrangement를 사용자의 입력을 받아 다수의 생물들의 유전체 서열을 생성해 낸다. 이를 통해 이배체 유전체 서열을 비교하는 도구의 개발을 용이하게 하는데 초첨을 맞추고 있다.
우리나라 주요 담수어종인 미꾸라지(Misgurnus mizolepis)를 어류 염색체 조작 모델로 개발하기 위한 연구의 일환으로 동일 종내 웅성발생성 이배체 유도 조건을 개발하고 유도된 웅성발생성 이배체의 생존능력을 평가하였다. 자외선(UV; $10,800\;ergs/mm^2$)을 이용하여 난자의 유전물질을 불활성화시키고 인공수정 28분 후(제1난할 중기)에 온도처리(고온 자극 $40.5\;^{\circ}C$ 120초 후 저온 자극 $1\;^{\circ}C$ 45분)를 통해 제1난할을 억제하였다. 본 온도처리를 통해 생존력 있는 웅성발생성 이배체들이 유도되었고(평균 부화율, 26.9%), 부화 후 1주일째를 기준으로 평균 웅성발생성 이배체 수율은 최초 처리난의 7%내외로 나타났다. 그러나 웅성발생성 이배체 유도 효율은 cytoplasmic donor의 질에 크게 영향을 받음이 관찰되어 사용한 암컷 친어별로 큰 편차가 관찰되었다. Flow cytometry 분석에 의해 생존력 있는 웅성발생성 개체들의 이배체 복원이 확인되었으며 아울러 형질전환 표지를 이용하여 동형접합성 개체 유도의 가능성이 확인되었다. 웅성발생성 이배체들은 일반대조군 이배체에 비해 낮은 생존능력을 보였으며 특히 부화 후 1개월까지 유의적으로 낮은 생존율을 나타내었다. 그러나 후기 생존능력은 일반 이배체군과 유사하였다.
본 연구는 이전에 이배체와 삼배체를 교배하여 얻은 이수체 사과 나무의 생장과 과실 특성을 알아보고자 수행하였다. 이수체 사과나무의 화분발아율, 영양생장, 과실의 특징을 조사하였다. 그 결과, 이수체 사과 나무 간의 화분발아율의 차이가 크고, 모든 이수체 사과 나무의 화분 발아율이 이배체 '홍로' (82.4%) 보다 낮은 것으로 나타났다. 이수체 사과 나무 과실의 평균 크기와 중량은 이배체 '홍로'보다 작고 가벼운 것으로 나타났다. 또한 이수체 사과 나무 과실의 길이와 너비에 의해 이수체 JF3942빼고 다른 이수체 과실의 외형이 조금 납작했다. 거의 모든 이수체 사과 나무 과일의 당 함량은 이배체 '홍로' 보다 높았다. 본 실험에서 얻은 이수체 사과의 산 함량은 이전에 대부분의 연구자의 이배체 사과 결과와 완전히 달랐다. 이수체 사과의 시트르산하고 타르타르산 함량은 사과산 함량보다 더 높은 것으로 나타났다. 이수체 사과 나무의 수고와 폭은 이배체 '홍로'보다 짧았다. 대부분 이수체 사과 나무의 수고는 폭보다 길지만 네 나무는 반대로 나타났다. 잎의 길이와 너비에 의해 이수체 사과 나무 잎의 크기가 이배체 '홍로'보다 작았다. 이수체 사과 나무는 이배체보다 잘 자라지 않는 것으로 나타났다.
Trimorphomyces papilionaceus dikaryon 으로부터 자영적인 돌연변이에 의해 분리한 이배체를 대상으로 생장속도, U. V. 광 조사 후의 생존율, U. V. 분광광도계와 Hoechst 33258 핵염색에 의한 DNA 함량등을 monokaryon 및 dikaryon 과 비교하여 결정하였다. 이배체는 dikaryon 핵의 DNA 양과 비슷하였고 monokaryon 핵의 DNA 양의 2배 정도가 되었다. Glyoxalase II 의 band 양상에서 monokayon은 한 개의 isozyme band 만을 보인 반면, 이배체와 dikaryon은 같은 위치에서 두개의 isozyme band 가 관찰되었다. 이원전개한 전기영동실험에서 dikaryon 특이 단백질은 분자량이 66.000 보다 컸으며 분자량 24,000-29,000 사이에서 이배체 특이 단백질이 존재한다.
대농갱이, Leiocassis ussuriensis의 유도된 자성발생성 이배체의 초기 생존율, 초기 성장 및 성비를 분석하였다. 대농갱이 자성발생성 이배체는 일반 대농갱이 이배체 대조군과 비교 시 부화 180일까지 생존 및 성장 형질에서 모두 차이를 나타내지 않았다(P>0.05). 자성발생성 이배체는 부화 10주째 암수 판별이 용이한 수준의 난모세포 발달 정도를 보였고 일반 대농갱이 암컷과 난소 발달에 있어 유사하였다. 부화 10주째 생식소 조직학적 분석 결과 일반 대농갱이 이배체 자손들은 1:1의 암수 비율을 나타낸 반면, 자성발생성 이배체 자손들은 모두 암컷으로 판별됨으로써 본 어종의 성 결정 기구는 XX-XY를 기본으로 하는 암컷 동형접합형인 것으로 나타났다.
동아시아에서 이배체의 유성생식과 무수정결실로 번식하는 민들레속의 종 분화 연구를 위해 한국산(2종4집단), 일본산(2종 4분류군 6집단), 대만산(1종 3집단)의 이배체 민들레 종의 두화형질을 측정하여 유집분석을 실시하였다. 두화형질은 두화의 크기, 외총포편의 형태와 길이, 외총포편 선단돌기 등의 식별형질을 포함하여 15개의 형질을 측정하였다. 이들 형질은 하나의 개체군내에서도 변이의 폭이 크고, 집단사이, 종들 사이에 있어서도 변이가 중첩되어 나타났다. 형태형질을 이용한 유집분석 결과 4개의 군(한국산과 T. japonicum군, T. platycarpum아종군, T. formosanum군, T. platycarpum subsp. hodoense군)으로 유집되었다. 한국산 좀민들레(이배체)와 산민들레(이배체, 삼배체)가 일본의 간사이 지방에 분포하는 T. japonicum과 같은 군으로 유집되었다는 것으로 보아 이들은 서로 가까운 유연관계를 가짐을 추측할 수 있다.
Trichoderma koningii ATCC26113으로부터 얻어진 영양요구성 돌연변이주간의 종내 원형질체 융합을 시도하여 생성된 융합체의 유전자형을 완전평판배상에서 분석하였다. 생성된 융합체 중 모균고 다른 독립영양형 균주에서 섬유소 분해능이 증진된 융합체를 얻었으며 이들이 이배체(혹은 이수체)임을 확인하였다. 또한 이들 이배체(혹은 이수체)의 독립영양청 잡종의 원형 질체 융합을 통하여 유전자의 교환 및 재조합에 의하여 자연분리되므로써 형성됨을 확인하였다.
연초의 약배양에 의해서 반수체를 유기하고 형성된 반수체와 이배체의 캘러스로부터 식물체 분화과정에서 일어나는 생리적 차이점을 비교하고자 효소의 활성도와 페놀화합물의 함량을 비교 조사하였다. 반수체의 형성은 화아가 중간정도된 크기를 이용하여 IAA가 1.0 mg/L kietin이 0.5mg/L 조합 처리되고 활성탄이 3 mg/L 함유된 배지에서 가장 양호하였다. 캘러스의 유도는 이배체 및 반수체 공히 2,4-D의 농도가 0.5 mg/L 첨가된 배지에서 양호하였으며, 캘러스로부터 재분화는 BAP 농도 2.0 mg/L에서 효과적이었다. 재분화시 변화되는 효소의 활성도와 페놀화합물의 함량은 처리된 BAP의 농도와 사용한 식물체에 따라 차이가 있었다. Peroxidase의 활성도는 이배체 및 반수체 공히 BAP 농도가 2.0 mg/L일때 가장 높았으며, catalase의 활성도는 BAP의 농도가 1 mg/L일때 가장 높은 경향을 보였다. IAA oxidase 및 catalase의 활성도는 이배체에 비해 반수체에서 더 높은 경향을 보였으나 peroxidase의 활성도는 이배체가 더 높은 경향을 나타내었다.
대농갱이, Leiocassis ussuriensis의 유전육종학적 연구의 일환으로 자성발생성 이배체 유도 기법을 최적화하였다. 대농갱이 반수체 유도를 위해 다양한 농도의 자외선 조사를 통해 대농갱이 및 동자개 정자의 유전학적 불활성화 실시하였으며 최적 자외선 처리 조건은 4,800 $ergs/mm^2$로 나타났고, 이 때 Hertwig effect와 함께 97% 이상의 반수체 유도가 가능하였다. 반수체 대농갱이는 전형적인 반수체 증후군(haploid syndrome)을 보였으며, 반수체 대농갱이를 이배체로 복원시키기 위해 $4^{\circ}C$ 또는 $6^{\circ}C$에서 인공 수정 후 3, 5 및 7분 후에 30, 40 및 50분 간의 처리를 수행한 결과, 가장 높은 생존율(38.6%)과 이배체 복원률(87.9%)은 수정 5분 후 $4^{\circ}C$에서 40분간 처리 조건에서 관찰되었다.
인삼은 세계에서 가장 중요한 약용식물 중 하나이다. 본 연구실에서는 국립종자원에 최초로 등록된 인삼 품종 '천풍'을 이용하여 대략 3Gbp의 완성도 높은 유전체 서열과 60,000여개의 유전자를 동정하여 공개하였다. 인삼속 근연종들과의 비교유전체연구를 통해 종의 분화 시기 등을 추정하였고, 이를 통해 고려인삼의 기원과 두 번의 대륙이동을 통한 인삼속의 진화와 분포모델을 확립하였다. 인삼속 18종 중 2종 (고려인삼, 화기삼)은 24쌍의 염색체를 가지는 사배체 식물이며 나머지 16종은 12쌍의 염색체를 가지는 이배체 식물이다. 인삼속과 두릅나무속은 두릅나무과에 속하는 가장 가까운 식물로서 약 8백만년 전에 분화하였다. 인삼속은 약 6백만년 전 베트남 등의 동남아시아에서 러시아와 같은 동북아시아에 이르는 지역의 깊은 숲 속 서늘한 기후와 숲 속의 음지조건에 적응하며 음지식물로 진화했다. 그 기간은 빙하기와 간빙기가 반복되는 시기로 월동 능력이 없는 이배체 인삼종은 대부분 동북아시아 지역에서 멸종하였고 이 과정에 이배체간 종간 교잡종인 이질사배체가 약 2백만년전 만들어졌으며 한반도를 위시한 동북아시아를 중심으로 월동능력을 가진 고려인삼이 태동되었다고 추정된다. 북미에 분포하는 화기삼은 동북아시아 전역에 분포하던 고려인삼이 약 1백만년전에 빙하의 이동과 더불어 대륙간 이주를 통해 새로운 생태 환경에 적응하면서 분화되었다고 판단된다. 반면 대부분의 이배체 인삼종은 고온을 견디지 못하고 월동능력도 없어 동남아시아 지역에서 1,600미터 이상의 고산 지역으로 쫓겨 올라가 연중 서늘한 기후에서 생존하고 있다. 유전체 해독 정보는 인삼의 기원과 진화기작을 추정하는 학문적 성과 뿐 아니라 인삼산업을 보호하고 우수 인삼을 개발하기 위한 실용적인 분자육종 수단에도 매우 효율적으로 활용될 수 있다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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