• 한국정보처리학회:학술대회논문집
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• 한국정보처리학회 2001년도 추계학술발표논문집 (상)
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• pp.105-108
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• 2001

cDNA(complementary DNA)를 복제(cloneing)하여 염기 서열화 한 EST(Expressed Sequence Tag) 데이터는 여러 생물체들의 염기서열 정보들과 비교를 통해 유사점을 찾거나 기능적 부위 검색을 통해 유전자 기능을 추정한 수 있어 기능 유전체 연구에 많이 사용되고 있다. EST 데이터를 식물은 특정종(Species)별로, 동물의 경우 종의 조직별로 클러스터링 함으로써 아직 알려지지 않은 종의 유전자를 밝혀낼 수 있음은 물론 유전자의 발현에 따른 단백질의 기능도 알아낼 수 있다. 따라서 이 논문에서는 NCBI에서 flatfile 형태로 제공하는 EST 데이터를 분석하여 관계형 데이터베이스로 모델링하고 구축하였다. 또한 EST 데이터의 효율적인 사용을 위하여 데이터를 특정 종의 조직별로 클러스터링하여 제공하는 시스템을 설계하고 구현하였다.

• 한국식품영양학회지
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• 제15권4호
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• pp.364-369
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• 2002

방선균은 토양 속에 다양하게 존재하는 미생물의 일종으로 그람 양성 진정세균으로 이차대사산물을 생산하는 시기와 포자 착생이 시작되는 세포분화의 시기가 밀접한 관련이 있다. S. griseus는 streptomycin을 비롯한 다양한 종류의 endopeptidase 및 exopeptidase들을 생산한다. 방선균에서의 protease 생산은 많은 경우에 이차대사산물이 형성되거나 형태분화가 유도되는 시기에 동시에 시작된다는 점에서 Pretense가 이차대사물질 생산 및 세포분화에 일정한 기능을 수행할 것이 라는 점을 시사하고 있다. 본 연구에서는 S. griseus IFO 13350에서 클로닝한 SGPD protease가 각 strain에서 형태학적으로나 생리적으로 어떠한 gene dosage 효과를 미치는지 조사하는 것이었다. sprD 유전자가 S.lividans를 숙주로 사용한 시스템에서 대량발현이 성공적으로 되는 것을 확인한 후, 본 유전자를 클로닝한 S. griseus IFO13350 균주와 이의 A-factor 결손주인 S. griseus HH1에 형질전환하였다. S. griseus HH1과 S. griseus IFO13350에서는 protease activity가 벡터만 도입된 대조군과 sprD 유전자가 들어간 형질전환체에서 큰 차이를 보이지 않았다. 또한 S. griseus IFO 13350 및 HH1 모두에서 생리학적·형태학적 분화의 차이를 발견하지 못하였다. Chymotrypsin계열의 pretense를 암호화하는 유전자만이 S. griseus에서 발현이 repression된다는 사실을 본 연구 결과를 통하여 알게 되었다. 이를 바탕으로 sprD유전자와 동일계열의 chymotrypsin 계열의 유전자들이 공통적으로 S. griseus에서 repression 되는 일반적인 기전이 있을 것으로 판단, chymotrypsin계열 유전자들의 promoter부분의 염기 상동성을 조사하였다 번역개시부위 바로 상부 유전자부터 상동성을 조사한 결과 적어도 상당부분의 염기배열이 잘 보존된 지역이 존재함을 알게 되었다. 향후 이들 발현기구의 조절기구를 연구함으로서 protease의 기능을 밝히는데 좋은 단서를 제공할 것으로 판단된다.

• 한국식품영양학회지
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• 제17권1호
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• pp.47-52
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• 2004

Mammaglobin은 uteroglobin 유전자와 상동성을 가지는 분비 단백질로 인체 유방암 조직에서 과발현된다. 이 단백질은 유방암의 진단, 전이 정도의 진단, 또는 수술 및 항암치료 후 재발 정도의 검색을 위한 하나의 표식자로 가능성을 갖는다. 본 연구는 mammaglobin 유전자를 클로닝하여, 대장균으로부터 발현하고, 발현된 mammaglobin 단백질을 분리하고, 분리된 단백질을 이용하여 항체를 생산하고, 분리된 항체가 mammaglobin에 대한 특이 반응을 갖는지를 확인하였다. 유방암 환자의 조직을 얻은 후 이 조직에서 RNA를 분리한다. 이 RNA로부터 RT-PCR법으로 mammaglobin 유전자를 클로닝하였다. 증폭된 유전자를 NcoI 과 XhoI으로 절단한 후 벡터에 끼워 넣은 후 대장균에 형질 전환시키고 DNA 염기 서열을 결정하였고, 기존의 mammaglobin 유전자의 염기서열과 비교한 결과 동일한 유전자임을 확인하였다. Mammaglobin의 세포 내 발현, 신호 펩타이드를 이용한 분비발현을 위해 pET30, pET20, pET32 벡터를 각각 이용하였다. 3개의 발현시스템으로부터 단백질이 과 발현됨을 확인할 수 있었다. pET30 벡터를 이용하여 성공적으로 발현된 mammaglobin 단백질을 분리할 수 있었다. Ni-NTA affinity chromatography에 이은 DEAE-ion exchange chromatography 분리 방법에 의해 수용성 발현 단백질인 thioredoxin-mammaglobin을 정제할 수 있었고 이 융합 단백질로부터 enterokinase를 이용하여 mammaglobin 단백질만을 분리하였다. 토끼에 분리된 mammaglobin을 complete adjuvant와 혼합하여 면역한 후 두 번 boosting하여 polyconal 항체를 얻었다. Westernblot immuno 분석을 한 결과 생산된 항체가 mammaglobin 단백질과 특이적 항원항체반응을 보임을 관찰하였다. 향후 이 항체를 이용하여 진단용 시약의 개발이나 항암제 개발 등을 위해 연구가 진행될 것이다.

• 미생물학회지
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• 제32권2호
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• pp.120-125
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• 1994

Vibrio meschnikovii 균주 RH530의 trpB. trpA 및 3‘ trpC(F) 유전자를 대장균에 클로닝하여 염기서열을 결정하였다. trpB 및 trpA 유전자는 각각 391 및 268 아미노산을 coding할 수 있는 1,173 bp 및 804 bp의 open reading frame을 가졌다. trpB 및 trpA 유전자는 일반적인 ribosome-binding sequence를 가졌으며 1개의 nucleotide만큼 중복되어 있었다. 이는 이들 두 유전자가 trinslation 단계에서 연결되어 있음을 의미한다. trpB 유전자의 개시토돈에서 115 nucleotide 위에 trpC(F)와 trpF의 융합체인 trpC(F)의 3’-말단부위의 불완전한 open reading frame의 존재 하였다. V. metschnikovil RH530의 TrpB, TrpA 및 TrpC(F)의 아미노산 서열은 V. parahaemolyticus의 그것들과 각각 64.2%, 82.4%, 73.7%: S. typhimurium과 58.7%, 72.3%, 54.9%: B. lactoermentum과 42.6%, 54.1%, 12.5%의 유사성을 보였다. 이는 TrpB가 TrpA보다 서열이 잘 보존되어 있음을 나타내며 TrpC(F)는 다를 두 polypeptide에 비해서 서열의 변이가 큼을 나타낸다. 이들 유전자들의 구조, 특히 trpC(F)와 trpB 사이의 noncoding 부위는 Enterobacteriaceae 비롯한 다를 개체들과는 다른 특징을 보였다.

• 한국수산과학회지
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• 제30권5호
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• pp.804-808
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• 1997

한국산 참굴의 유전적 특성을 조사하기 위하여 한국의 지역별 참굴을 대상으로 mtDNA 제한효소 절편분석과 클로닝을 수행하였다. 지역별로 각각 20개체의 mtDNA에 대하여 8가지 제한효소를 사용하여 DNA 절편양상을 분석한 결과 서해안산 참굴에서는 개체간 차이가 없는 단일 양상이었으며 남해안산의 경우는 두 가지 양상을 보였으며 차이는 HindIII 절단양상에서만 나타났다. 그 중 소수 개체들에서 나타난 양상은 서해안산 개체들에서의 양상과 동일하여 남해안에 서해안산 참굴이 유입되어 혼재하는 것으로 추정되었다. 한국산 참굴의 mtDNA를 대장균 E. coli HB101에서 클로닝하여 유전적 분석을 용이하도록 하였다. 전체 mtDNA를 제한효소를 사용하여 세부분으로 나누어 pUC19 유전자운반체에 클로닝하였다. 클로닝된 재조합 DNA를 제한효소들로 절단하여 한국산 참굴 mtDNA의 제한효소지도를 작성하였다. 남해안산과 서해안산 참굴 mtDNA에서 HindIII 적단 양상이 다르게 나타남을 확인하였고 이는 남해안산이나 서해안산에서 염기치환의 돌연변이에 의한 것으로 사료되었다.

• 한국균학회지
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• 제23권2호통권73호
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• pp.129-138
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• 1995

비허용온도인 $37^{\circ}C$에서 삼투감수성을 보이며 베타-1,3-글루칸 합성능이 현저히 손상된 Saccharomyces cerevisiae mutant(LP353)를 YCp50으로 제조한 yeast genomic library로 형질전환시킨 후, 콜로니 자기방사법으로 형질전환체의 선별을 시도한 결과, LP353의 베타-1,3-글루칸 합성능을 부분적으로 회복시켜 주는 약 8.5-kb 크기의 DNA 절편을 클로닝하는데 성공하였다. 클로닝된 8.5-kb의 DNA 절편은 copy 수에 무관하게 LP353의 또 다른 표현형질인 온도의존적 삼투감수성은 회복시켜 주지 못하였으나, 세포벽의 베타-1,3-글루칸 함량과 베타-1,3-글루칸 분해효소인 ${\beta}-glucanase$에 대한 내성은 copy수에 무관하게 증가시켜 주었다. 한편, 8.5-kb의 DNA 절편은 $37^{\circ}C$의 삼투안정제가 첨가된 액체배지에서 잘 자라지 못하는 LP353의 돌연변이 형질을 회복시켜 야생형의 수준에 근접하는 생장양상을 보여 주었다. 이상의 결과로 클로닝된 8.5-kb 크기의 DNA 절편은 S. cerevisiae의 베타-1,3-글루칸 생합성에 관여하는 유전자의 하나인 BGS2를 포함하고 있는 것으로 보여지며, subcloning을 통한 기능부위 분석 결과, 4.8-kb 크기의 BglII-KpnI DNA 절편에 BGS2가 존재하는 것으로 추정되었다.

• 미생물학회지
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• 제40권2호
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• pp.81-86
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• 2004

Streptomyces coelicolor의 전 유전체 청보를 분석한 결과(7), 유전자 ID1103135가 코드 하는 open reading frame SCO7697이 phytase[myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolase상동성 (3-6,8,23)]에 유의하게 유사한 것으로 판단되었다. S. coelicolor A3(2)M의 염색체 DNA를 주형으로 PCR 방법으로 SCO7697 전체를 포함하는 DNA 단편을 클로닝하였다. 두 가지의 서로 다른 길이를 갖는 클로닝 된 ID1103135 DNA 단편을 E. coli 발현용 벡터pET728a(+)에 삽입하여,두 종의 재조합 벡터 pET28-SP와 pET28-LP를 얻었다. pET28-SP 와 pET28-LP를 각각 E. coli BL2l에 도입하여, IPTG로 발현 유도된 단백질을 SDS-polyacrylamide 전기영동으로 확인한 결과, 발현은 성공적으로 이루어 졌으나 대부분불용체를 형성하고 분자량은 예상보다 약간 큰 것으로 나타났다. 불용체 형성은 단백질의 불활성화를 수반 함으로서, 배양 온도를 $37^{\circ}C$에서 $30^{\circ}C$로 변화시켜 배양하는 방법으로 발현된 단백질을 가용화 시켰다. 발현된 단백질을 추출하여 조추출물 또는 정제한 상태로 phytase활성을 측청하였으나 효소활성은 관찰할 수 없었다. 대장균 시스템에서의 발현이 효소 활성의 소실을 초래했을 가능성이 있으므로, ID1103135 유전자를 자신의 promoter를 함유하도록 PCR 클로닝하여, E. coli - Streptomyces의 shuttle vector인 pWHM3에 삽입하고, 이를 방선균 호스트인 S. lividans에 도입하였다. 형질 전환체의 세포조추출액 및 세포배양액의 phytase 활성을 측청하였으나, 역시 활성을 확인할수 없었다. 이와 같은 결과는 SCO7697이 아주 높은 확률(E value; $6e^{-89}$)로 phytase일 것으로 annotation 되었으나, 실제는 이와는 다른 기능을 함유하고 있음을 시사하고 있다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제31권2호
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• pp.103-110
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• 2003

그람 양성세균에서 PyrR단백질에 의하여 피리미딘의 생합성이 조절된다는 발견을 바탕으로 하여, Synechocystis sp.PCC6803과 Haemophilus influenzae의 PyrR orthologue 유전자를 Bacillus subtilis에서 형질전환 시켜 피리미딘 생합성의 조절 유무를 조사하였다. Synechocystis sp.PCC6803과 H. influenzae의 PyrR orthologue유전자를 pUC19과 T-vector에 클로닝 한후 pKH1, pKH2, pHPSK1, pHPSK2으로 각각 명명하였다. 이것을 다시 Escherichia. coli와 B. subtiius용 shuttle vector인 pHPS9에 클로닝 하여 pKH3, pKH4, pHPSK3, pHPSK4로 각각 명명하였다. B. subtilis DB104Δ PyrR에 pKH3, pKH4, pHPSK3, pHPSK4을 형질전환후 ATCase 활성을 측정결과 pHPSK3을 가진 균주만 피리미딘에 의한 조절작용이 일어난다는 사실을 통하여, H. influenzae의 PyrR orthologue 유전자의 선도 부분에 조절에 관여하는 미지의 부분이 있음을 예측할 수 있었다. 서로 다른 유래의 PyrR orthologue단백질을 정제하기 위하여 pET14b에 클로닝후 pKH5, pHPSK5으로 각각 명명하였다. SDS-PAGE로 분석한 결과 각각 약 18 kDa과 21 kDa의 분자량을 나타내었다. 정제된 PyrR orthologue 단백질의 UPRTase 활성을 측정한 결과 H. infuenzae의 PyrR orthologue 단백질은 UPRTase 활성을 나타내었으며 다양한 pH에서 측정한 결과 pH 5에서 가장 높은 활성을 나타내었다. 반면에, Synechocystis sp. PCC6803의 PyrR orhologue 단백질은 UPRTase 활성을 나타내지 않았다. 여러 가지 균주의 PyrR 아미노산 서열을 비교한 계통수 분석은 PyrR 단백질의 조절기작과 어느 정도 연관됨을 시사해 주었다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제30권1호
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• pp.1-7
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• 2002

토양으로부터 phytate 분해능이 뛰어난 phytate를 생산하는 균주를 분리 동정한 결과 Escherichia coli로 동정되었고, E. coli WC7으로 명명하였다. 이 균주가 생산하는 phytase를 ammonium sulfate 침전, Phenyl-Sepharose, DEAE-Sepharose, CM-Sepharose, Resoure S, Mono S 컬럼 크로마토그래피를 이용한 분리정제를 수행하여 정제도 1,250 배, 수율 30%로 정제하였고 640 Unit/mg의 비활성을 얻었다. 또한 정제된 phytase는 SDS-PAGE에서 분자량 45kDa인 단일 subunit로 이루어진 단일효소임을 확인하였다. E. coli WC7 phytase의 최적 pH는 5.0, 최적 온도는 $60^{\circ}C$였으며, pH 2.0-12까지 안정하였다. 열안정성에서는 $60^{\circ}C$이상에서 급격한 활성의 감소를 보여 초기 활성의 20% 활성만을 나타내었다. Phytase의 N-말단 아미노산 서열은 Ser-Glu-Pro-Clu-Leu-Lys-Leu-Glu-Ser-Val-Val이었으며 이는 E. coli 유래의 pH 2.5 acid phosphatase와 아주 큰 유사성을 보였다. S. coli WC7 phytase의 유전자를 확보하기 위해 E. coli acid phosphatase의 DNA sequence를 바탕으로 한 primer들을 이용하여 PCR 클로닝을 수행하였으며 증폭된 PCR fragment를 pUC19 벡터에 클로닝 하고 DNA 염기서열을 결정하였다. 그 결과 1.2 kbp의 WC7 phytase 유전자의 ORF를 확인하였으며 432개의 아미노산으로 이루어진 분자량 44,716 Da의 단백질을 확인 할 수 있었다. 대부분의 acid phosphatase 효소들의 active site라고 추정되는 active site motif인 RHGXRXP가 N-terminal 쪽에 존재하고 있었다. pUEP를 이용하여 E. coli XL1-Blue에서 phytase를 발현시켰을 때 효소의 생산량이 17.5 U/ml로서 원균주의 23배 활성을 가졌으며,효소의 비활성 및 pH 안정성 측면에서 높은 산업적 이용가능성을 볼 때 사료첨가제 효소로의 개발을 기대할 수 있을 것이라 판단된다.

• 생명과학회지
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• 제22권4호
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• pp.437-446
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• 2012

한우의 반추위에서 게놈 DNA를 분리하여 메타게놈 은행을 구축한 다음 섬유소분해효소를 암호화하는 유전자를 클로닝 및 유전자를 선별하였다. 선별된 유전자의 DNA 염기서열 및 아미노산 서열을 분석하고 유전산물의 생화학적인 특성을 조사하였다. $cel$5C 유전자는 1,125 bp로 374개의 아미노산 잔기를 가진 단백질을 암호화하였으며 이 단백질 분자량은 42 kDa이었다. 이 효소의 최적 pH는 4 근방이었으며 최적 온도는 $50^{\circ}C$ 부근이었다. $cel$5C 유전자의 internal primer를 사용하여 인공적으로 배양할 수 있는 49종의 반추세균에서 분리한 게놈 DNA을 주형으로 PCR 분석한 결과 해당하는 밴드를 확인할 수 없었다. Cel5C는 현재로서는 배양할 수 없는 반추 미생물로 추정된다.