본 연구에서는 까마귀쪽나무열매추출물(LJF-HE)의 흰쥐모델에서 인도메타신으로 유발되어지는 위염에 대한 억제효과를 확인하고자 하였다. 까마귀쪽나무열매추출물 투여그룹(LJF-HE-L, LJF-HE-M, LJF-HE-H)에서 염증길이와 위액량이 control 그룹에 비하여 통계적으로 유의하게 감소한 결과를 얻었다. 또한 위액량의 유의적인 감소효과로 위산분비가 억제되어 공격인자 작용이 약해지는 원인과 펩신의 활성도를 낮추는 원인으로 인하여 위염발생을 억제하는 것으로 판단되어진다. 까마귀쪽나무열매추출물(LJF-HE)의 위산 분비 억제 기능은 gastrin 및 histamine에 의해 발현되는 CCK-2r와 H2r 유전자의 발현을 억제하여, gastrin 및 histamine에 의한 위산 생성 단계를 조절하여, proton pump인 H+/K+ ATPase 유전자 발현을 억제시키며, 그 결과로 인하여 위산 분비를 억제하는 것으로 판단되어진다. 그리고 까마귀쪽나무열매추출물은 점액을 증가시켜 위 점막을 보호하는 PGE2의 함량을 높여, 위 점막 보호 기능을 나타내고 있으며, 더불어 염증성 cytokine인 TNF-${\alpha}$와 IL-$1{\beta}$의 생성을 낮춰주어 염증 매개반응을 저해하는 것으로 판단되어진다. 이와 같은 결과를 종합하면 까마귀쪽나무열매추출물(LJF-HE)이 인도메타신으로 유발되어지는 위염에 대한 억제효과가 있는 것으로 판단되었다.
왕쥐똥나무잎(Ligustrum ovalifolium H.) 추출물의 세포독성을 살펴보기 위하여 RAW264.7 대식세포를 이용하여 세포의 생존율을 살펴본 결과 물 추출물 및 에탄올 추출물 모두 0.2 mg/mL의 농도까지 전혀 독성을 나타내지 않았다. 또한 왕쥐똥나무잎 추출물의 항염증 효과를 LPS에 의해 활성화된 RAW264.7 대식세포에서의 NO 생성억제 및 ROS 소거능과 염증관련 단백질 발현의 변화를 통하여 확인하였다. RAW264.7 대식세포에 LPS를 처리한 결과 NO의 함량이 11 ${\mu}M$ 수준으로 증가하였으나, 왕쥐똥나무잎 에탄올 추출물(0.05, 0.1, 0.2 mg/mL)을 처리하였을 때 NO의 함량이 7.03, 6.74, 6.64 ${\mu}M$로 농도 의존적으로 감소하였다. 왕쥐똥 나무잎 추출물이 LPS를 처리하여 생성되는 활성산소종에 미치는 영향을 확인한 결과, LPS를 처리한 대조군은 ROS가 36.55%로 증가하였으나, 왕쥐똥나무잎 에탄올 추출물(0.05, 0.1, 0.2 mg/mL)을 처리한 군은 세포내 활성산소종을 농도 의존적(23.86, 8.55, 5.48%)으로 감소시켰다. 또한 왕쥐똥나무잎 에탄올 추출물은 NO 생성과 연관 있는 iNOS 단백질의 발현을 농도 의존적으로 저해하였으며 이는 NO 생성 억제가 iNOS의 발현저해를 경유한 것으로 사료된다. 또한 다수의 항염증 약물들의 작용기전이 되는 COX-2의 생성억제를 살펴본 결과 왕쥐똥나무잎 에탄올 추출물은 LPS에 의해 발현되는 COX-2 단백질의 발현을 유의성 있게 억제하였음을 확인할 수 있었다. 이상의 결과를 요약하면 왕쥐똥나무잎 추출물이 LPS로 유도된 RAW264.7 대식세포내 활성산소종(ROS)과 산화질소 라디칼(NO)을 억제함으로써 염증을 억제하는 것으로 보이며, 이는 선행연구에서 나타난 왕쥐똥나무잎 추출물의 높은 라디칼 소거능 및 항산화능과 관련이 있는 것으로 판단된다. 또한 염증과 관련된 iNOS, COX-2 발현을 저해함으로써 왕쥐똥나무잎 추출물이 염증억제 효과를 나타내는 것으로 사료된다. 따라서 본 연구는 항염증 물질의 연구에 기초 자료로 활용이 가능할 것으로 기대된다. 또한 염증과 관련된 cytokine 및 단백질 발현 메커니즘에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 판단된다.
양파(노란색, 붉은색, 흰색)의 열수 추출물이 DNCB로 감작된 4주령 BALB/c mouse 암컷에 유도된 접촉성 피부염의 억제효과를 조사하였다. 림프절, 비장 및 흉선의 무게는 양파 투여군이 DNCB 대조군보다는 낮게 나타났다. 양파 추출물을 투여한 군에서 귀의 무게는 양파 추출물의 농도가 높을수록 감소하는 경향을 보였으며, 대조군과 비교하여 무게에 함량 변화가 있었다. 양파추출물을 1,000 mg/kg 농도로 투여하면 귀의 무게는 대조군과 유사한 수준까지 낮아졌으며, 귀의 두께는 양파추출물을 투여한 군에서 시간이 경과할수록 두께가 감소하는 경향을 나타내었다. MDA 함량은 DNCB대조군과 양파 투여군을 비교하였을 경우에, 간 조직에서 차이가 나타나지 않았으나, 염증이 발생한 귀 조직에서는 차이가 나타났으며, NO 함량은 모든 양파그룹에서 염증이 억제되어 대조군에 유사하게 측정되었다.
국민소득 증대에 따른 사회경제 수준의 향상과 의학발달에 의해 평균 수명이 연장되었다. 이로 인한 인구의 노령화로 노인관련 질환 즉, 류마티스성 관절염, 심장질환 등과 같은 만성 퇴행성질환과 암 등 영양섭취의 불균형과 관련된 질병이 급증되었다. 최근 ROS(reactive oxygen species), PGs(prostaglandins), 및 NO(nitric oxide)가 각종 염증성 질환, 순환계 질환 및 암화 과정에 밀접한 연관이 있기 때문에 이들을 조절할 수 있는 식품류가 각종 질환의 예방을 목적으로 각광을 받고 있다.(중략)
본 실험에서는 primary culture된 연골세포 in vitro 실험모델과 MIA로 유발한 골관절염 in vivo 실험모델을 이용하여 보스웰리아 추출물의 골관절염 예방 효과를 확인하였다. 먼저 MTT 시험법을 통해 세포 사용 적정농도를 $20{\mu}g/mL$ 이하로 결정하여 연골세포 사멸 억제를 확인하고, 이를 근간으로 골관절염 동물실험 모델에서 골관절염 예방 효과를 확인하였다. $H_2O_2$ 처리에 따른 산화적 독성으로 연골세포 사멸을 유도한 실험에서 보스웰리아 추출물은 유의적으로 세포사멸을 억제하였으며 이러한 효과는 $5{\sim}20{\mu}g/mL$ 사이농도에서 비교적 높게 나타났다. 세포실험에서는 골관절염 발병에 따라 관절연골에 영향을 미치는 염증인자에 대한 기전연구를 진행하였으며, 연골세포에 LPS를 처리하여 염증을 유도한 후 보스웰리아 추출물의 효과를 확인한 실험 결과 면역과 염증반응을 조절하는 nuclear transcription factor ${\kappa}B(NF{\kappa}B)$, 염증관련 cytokine IL-6, TNF-${\alpha}$의 발현이 모두 보스웰리아 추출물 처리 시 유의적으로 감소하는 것으로 나타났으며 특히 $20{\mu}g/mL$ 농도에서 가장 효과가 뚜렷하고 일관되게 확인되었다. 또한 이들 cytokine에 의해 생성되는 COX-2 발현과 COX-2에 자극 받아 생성이 촉진되는 PGE2 생성을 확인한 결과 역시 $20{\mu}g/mL$ 농도에서 가장 효과적으로 생성이 억제되어 염증을 조절하는 것으로 나타났다. 특히 보스웰리아의 기능성분으로 알려진 보스웰릭산(boswellic acids)에 의해 억제되는 5-LO의 경우, 염증반응 유발의 핵심인자를 생성하는 효소로 알려져 있으며 이를 직접적으로 저해하는 것으로 알려진 보스웰리아의 효능을 확인 하고자 실험을 진행하였다. 실험 결과 염증을 유도한 연골세포에서 보스웰리아 추출물의 처리에 따라 5-LO 활성이 감소하였으며, 이는 곧 보스웰리아 추출물이 염증을 유발 핵심효소인 5-LO 활성을 효과적으로 억제함으로써 연골세포 보호 효과를 나타낸 것이다. 세포실험에서의 기전 결과를 바탕으로 골관절염을 유발한 동물모델에서의 보스웰리아 추출물의 섭취에 따른 효과가 나타날 것으로 기대되어 관절염 유발 동물모델에서 보스웰리아 추출물의 효능검증 실험을 진행하였으며, 세포실험 결과 및 기존의 연구내용을 참고하여 동물에서 보스웰리아의 섭취 농도를 50 mg/kg, 100 mg/kg 및 200 mg/kg으로 결정하고 AIN-93G diet에 보스웰리아 추출물 분말을 섞어 보스웰리아 diet를 제작하여 실험기간 동안 제공하였다. 골관절염 유발 동물모델을 만들기 위해 SD rat의 관절강에 MIA를 injection 하였으며, 보스웰리아 추출물 섭취에 따른 관절염 예방 효과를 관찰하기 위해 관절염 유발 2주일 전부터 제작된 식이를 제공하고 유발 후 3주간 지속적으로 식이 제공 및 관찰하였다. 연골의 주요 구성 성분인 collagen 및 aggrecan은 골관절염 발병 시 여러 인자에 의해 분해되는 것으로 알려져 있으며, 골관절염 유발동물모델에서 collagen type I, collagen type II 및 aggrecan 유전자 발현을 실시간 정량 PCR로 측정하여 변화를 살펴보았다. 그 결과 골관절염 유발 sham군에 비해 보스웰리아 추출물 섭취군에서 유의적으로 collagen type I, collagen type II 및 aggrecan 발현이 증가하였으며, 특히 BW200군에서 CLX 약물대조군과 비슷한 수준으로 발현이 증가하여 관절연골의 보호 효과가 가장 좋은 것으로 확인되었다. 교원질 합성을 억제하고 분해를 촉진시키는 MMPs(MMP-3, MMP-9, MMP-13)의 발현을 실시간 정량 PCR로 측정하여 발현 변화를 살펴보았다. 그 결과 앞선 다른 실험 결과와 마찬가지로 보스웰리아 섭취군에서 MMPs 유전자 발현이 유의적으로 낮아졌음을 살펴볼 수 있었다. 특히 BW200군에서 MMPs 발현이 유의적으로 감소하였으며, 관절염에 효과적으로 사용되는 약물인 CLX 투여 양성대조군과 비슷한 수치를 나타내었다. 이상의 결과를 통하여 보스웰리아 추출물은 골관절염에서 관절연골의 보호 효과가 있으며, 이는 골관절염 발생 시 나타나는 염증발현의 기전적인 측면뿐만 아니라 골관절염 유발 동물에서 섭취 효능까지 모두 일관되게 나타나 골관절염에서의 기능성 소재로써 개발가능성이 충분할 것으로 생각된다. 또한 추후 실험을 통해 골관절염이 유발된 동물에서 보스웰리아 추출물 섭취 시 관절연골의 형태학적인 변화 및 골상태의 분석과 더불어 관절염 유발 동물의 관절연골 및 혈액학적 분석을 진행하여 동물에서 기전적 측면을 보완하고 보스웰리아 추출물 효능에 대한 추가적인 검증을 하고자 한다.
목적 : 만성 염증성 질환에 대한 전침효과를 알아보기 위해 complete Freund's adjuvant (CA) 유발 관절염 모델에서 염증관련 단백질의 변화를 살펴보았다. 방법 : Sprague-Dawley계 흰쥐의 족부에 CFA를 주사한 다음 3일 간격으로 2 Hz, 15 Hz 및 120 Hz 전침 자극을 주며 부종 형성여부를 plethysmometer로 측정하여 판정하였으며 30일 째 거퇴관절을 취하여 4% paraformaldehyde에 고정하고 EDTA용액에서 탈회시켜 파라핀연속 절편을 얻어 $NF-{\kappa}B$를 비롯한 5종의 염증관련 단백질의 발현을 면역조직화학적으로 살펴보았다. 결과 : 관절연골내 면역반응 중 연골기질은 반응이 없거나 약하고 연골세포는 $NF-{\kappa}Bp65,\;I-{\kappa}B{\alpha},\;iNOS$반응이 강하며 특히 유리연골층에서 더 현저하였으나 염증 및 전침자극에 따른 변화는 없었다. 관절낭에서 면역반응을 살펴보면 염증유발시 활액세포의 면역반응세포는 $I-{\kappa}B{\alpha}$가 감소한 반면 iNOS, $IL-1{\beta}$는 증가하며 특히 iNOS 증가가 현저하였으며 전침자극에 의해 iNOS가 감소하였다. 활액막조직에서 모든 면역반응이 증가하며 특히 $NF-{\kappa}Bp65,\;I-{\kappa}B{\alpha},\;iNOS$ 반응이 현저한데 전침자극에 의해 $IL-1{\beta}$를 제외한 모든 반응이 감소하였다. 결론 : 만성 염증성 동물모델의 거퇴관절 내 염증관련 단백질은 관절연골보다 관절낭에서 큰 변화를 보이며 전침처치에 의해 이들 단백질 발현이 억제되는 것으로 보아 전침이 만성 염증성 질환에 효과적임을 알 수 있다.
간섬유화는 지속적인 간세포 손상에 대한 수복현상으로 일어나며, 급성 염증반응과 같은 손상이 주어진 후에는 간세포의 괴사 및 세포외기질의 축적이 일어나게 된다. 간섬유화에 대한 새로운 치료방법을 모색하기 위하여 본 연구에서는 간섬유화 과정에서 염증 반응과 관련된 NF-$\kappa$B와 세포외기질의 축적과 관련된 Sp1전사인자를 동시에 조절하여 간섬유화 억제효과를 관찰하고자 하였다. 전사인자인 Sp1과 NF-$\kappa$B를 동시에 억제하기 위하여 한 분자 내에 Sp1과 NF-$\kappa$B의 전사인자와 결합하는 부위를 가지는 Chimeric (Chi) decoy oligodeoxynucleotide (ODN)을 제작하였다. Chi decoy ODN은 활성화된 간성상세포에서 간섬유화 와 관련된 유전자 발현을 억제시켰으며, 섬유화 동물모델에서도 간 조직의 염증 반응 및 섬유화 관련 인자의 발현을 현저히 억제시켰다. 따라서 Chi decoy ODN은 간섬유화 및 활성화된 간성상세포의 활성을 억제할 수 있는 유전자 치료제로 고려될 수 있을 것으로 사료된다.
급성 폐손상시 아스피린이 나타내는 염증 억제작용의 기전을 이해하기 위하여 쥐에서 장 허혈-재관류에 의한 급성 폐손상을 유발하여 phospholipase $A_{2}$ 억제제인 mepacrine과 아스피린의 효과를 비교하였다. 내독소 처치시 A549 세포와 RAW264.7 세포에서 cyc1ooxygenase-2 (COX-2)의 발현이 증가했는데, RAW264.7 세포의 반응이 더 크게 나타났다. 장의 허혈-재관류에 의해 장관 및 폐장조직에서 myeloperoxidase 활성도가 증가하여 염증성 호중구의 침윤이 증가했음을 보여 주었다. 조직 소견상에서도 조직 손상과 염증세포의 침윤이 관찰되었으며, 이는 아스피린 또는 mepacrine 전처치 시 억제 되었다. NADPH oxidase 억제작용이 있는 apocynin과 p38 MAPK 억제제인 SB203580은 A549 세포와 RAW264.7 세포의 LPS에 의한 COX-2 발현을 억제시켰으며 RAW264.7 세포에서 더 크게 억제되었다. 이상의 결과를 통해서 아스피린이 급성 폐손상의 예방목적으로 사용될 수 있다고 보여지며, RAW264.7 세포와 A549 세포에서 COX-2 발현은 다른 특성을 보여서 다른 조절기전이 있을 것으로 생각된다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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