• 한국수정란이식학회지
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• 제16권2호
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• pp.107-115
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• 2001

본 연구는 최근 형질전환동물의 생산 및 복제동물 생산에 이용되고 있는 핵이식 기법을 시행할 때 재조합된 핵이식란의 활성화를 위해 널리 적용되고 있는 6-dimethylaminopurine (DMAP)의 활성화 효율과 근래에 제기되고 있는 단위발생란의 비정상적인 염색체 및 핵형에 대해 알아보고 적합한 활성화 유도물질을 찾고자 시행되어졌다. 도축장 유래의 난소에서 채란한 난자를 10% 거세한 수소혈청이 포함된 TCM-199배양에서 22시간동안 체외 성숙을 시킨 후 제 2감수분열 중기의 난자만을 선별해서 5$\mu$M ionomycin에서 5분간 처리하고 1.9 mM 6-dimethylaminopurine (DMAP)와 10$\mu\textrm{g}$/mL cycloheximide (CHX)에서 각 3시간동안 처리하여 활성화를 유도하였다. 활성화가 유도된 난자를 18시간 동안 체외 배양시 전핵 형성, 제 2 세포기까지 분할속도, 배 반포까지의 발달을 및 활성화 및 체외수정 후 108시간에 평균 세포수와 염색체를 분석하여 활성화 물질의 효율뿐만 아니라 문제점을 알아보고자 하였다. 1. 활성화 자극에 따른 난자의 전핵 형성은 ionomycin 처리 후 DMAP을 처리한 난자에서는 1PN 형성율이 9.1%로 ionomycin를 단독 처리하거나 ionomycin 처리 후 CHX를 처리한 난자에서의 1PN 형성율인 77.8와 79.0%보다 유의적 (P<0.05)으로 낮게 나타났으나, 3PN 형성율은 45.5%로 유의적 (P<0.05)으로 높게 나타났다. 따라서 ionomycin 처리 후 DMAP으로 활성화를 유도한 난자는 비정상적인 핵형을 가지지만 CHX로 활성화를 유도하였을 때는 정상적인 전핵 형성이 이루어지는 것으로 보인다. 2. 활성화 자극을 가한 난자의 체외 발달율은 ionomycin을 처리하고 DMAP으로 활성화 자극을 가하였을 때 분할율이 85.5%로 체외 수정한 대조군의 72.5%와 유사하였다. 그러나 ionomycin을 단독 처리하거나 ionomycin 처리 후 CHX로 활성화 자극을 가한 실험군의 분할율인 30.3와 57.9%에 비해 유의적 (P<0.05)으로 높게 나타났다. DMAP 처리군의 분할율은 대조군과 유사하였지만 배반포까지의 발달율은 12.3%로 대조군의 27.8%와는 유의적인 차이는 없으나 발달율이 낮은 경향으로 나타났다. 3. Ionomycin으로 처리 후 DMAP로 활성화 자극을 가한 실험군에서 난자의 발달속도는 활성화 자극 후 18시간 경과하였을 때 28%의 배분열율을 보여 분열속도가 가장 빨랐으며 활성화 자극 후 24~48시간동안 체외 배양을 하였을 때에도 ionomycin 단독 처리하거나 ionomycin 처리 후 CHX로 활성화 자극을 준 실험군에 비해 DMAP으로 활성화 자극을 가한 실험군이 유의적 (P<0.05)으로 빠른 발달속도를 보였다.

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제28권2호
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• pp.119-126
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• 2004

본 실험은 돼지체외수정란을 생산하는데 적합한 배양액과 산소조건을 구명하기 위하여 NCSU(North Carolina State University)-23, PZM(Porcine Zygotes Medium)-3, PZM-4 및 TCM(Tissue Culture Medium)-199 배양액과 5% 산소조건(39, 5% $O_2$, 5% $CO_2$ , 90% $N_2$ 및 포화습도) 및 20% 산소조건(39, 5% $CO_2$ 및 포화습도)에서 돼지 미성숙난포란의 체외성숙과 체외배발달을 실시하였다. 본 연구에서 얻어진 결과를 요약하면 다음과 같다. 1) 돼지 난포란을 5 및 20% 산소조건하에서 NCSU-23, PZM-3, PZM-4 및 TCM-199 배양액에 44시간 동안 성숙을 유도한 결과 난핵포붕괴율과 핵성숙률에 있어서 산소조건 및 배양액간 유의적(p>0.05)차이는 없었다. 2) 체외수정을 실시한 결과 정자 침투율, 자ㆍ웅전핵형성률, 다정자 침입률 및 평균정자수에 있어서 산소조건 및 배양액간에 유의적인 차이가 없었다. 3) 체외수정을 실시한 후, 5 및 20% 산소조건의 NCSU-23, PZM-3, PZM-4 및 TCM-199 배양액에서 배양하여 배발달에 미치는 영향을 조사한 결과, 난할률에 있어서는 유의적(p＜0.05)인 차이가 없었으며. 배발달 7일째 배반포기 발달률에 있어서 5% 산소조건에서는 PZM-3 배양액이, 20% 산소조건에서는 NCSU-23 배양액이 유의적(p＜0.05)으로 높은 결과를 나타냈다. 4) 배발달 7일째 배반포기 배의 세포수를 조사한 결과, 내부세포괴세포수와 총세포수는 산소조건과 배양액간에 통계적인 유의성이 인정되지는 않았으나, 5% 산소조건에서 PZM-3 배양액(36.8$\pm$6.5개)이 다소 높은 총세포수를 나타냈다. 위의 결과를 종합하면 돼지체외수정란의 생산에는 5% 산소조건에서 PZM-3 배양액에서 배발달을 유도하는 것이 배반포기 발달률과 세포수에 있어 효과적이라고 판단된다.

• 한국어류학회지
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• 제22권2호
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• pp.90-95
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• 2010

파랑점자돔(Blue devil, Pomacentrus caeruleus, 혼용되고 있는 학명으로 Chrysiptera cyaneus)은 인도양과 태평양에 널리 분포하는 어종으로 전 세계 해수관상어 시장에서 가장 대중적으로 유통되고 있다. 그러나 파랑점자돔의 인공 생산 기술은 개발되어 있지 않다. 이 연구에서는 파랑점자돔의 성공적인 종묘생산 기술 개발을 목적으로 산란생태에 대한 연구를 수행하였다. 확인된 산란 행동은 태양력과 태음력을 기준으로 분석하였다. 사육조건은 수온 $27^{\circ}C$, 염분 30 ppt 전후이며 사육수조의 수용량은 80에서 125 L의 크기였다. 성공적으로 이루어진 인공번식 기술개발 과정에서 파랑점자돔은 1마리의 수컷과 2마리 이상의 암컷이 하렘(harem) 을 형성하는 것이 관찰되었으며 12월부터 10월까지 11개 월간에 2무리의 파랑점자돔 하렘으로부터 44회의 산란이 확인되었고 113,580개의 수정란을 수거할 수 있었다. 특히 5월과 6월에 산란횟수와 산란량이 크게 증가하였다. 그리고 태음력의 달의 위상(모양)에 따라 파랑점자돔의 규칙적인 산란생태가 관찰되었는데 대조에 해당되는 삭과 망에는 전혀 산란행동이 관찰되지 않았지만 소조에 해당되는 상현과 하현에는 가장 높은 산란량과 산란횟수가 관찰되었다.

• 한국어류학회지
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• 제32권2호
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• pp.78-83
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• 2020

수온은 양식 대상어의 종자생산에 영향을 미치는 중요한 환경 요인이다. 본 연구는 최근 급격한 자원 감소를 보이고 있는 한해성 어종인 명태의 안정적인 종자생산을 위한 기초자료로 활용하기 위해 수온이 명태의 부화 및 초기 자어 성장에 미치는 영향을 조사하였다. 수정란의 생존율은 5℃가 8℃와 11℃에 비하여 높게 나타났으며, 부화율은 8℃에서 가장 우수하게 나타났다. 그러나 첫 부화, 50% 부화 및 완전 부화까지의 소요 시간은 11℃가 5℃와 8℃에 비하여 빠르게 나타났다. 12주간의 사육기간 동안 자어의 생존율은 5℃가 8℃와 11℃에 비하여 높게 나타났으나, 성장은 11℃가 5℃와 8℃에 비하여 높게 나타났다.

• 한국패류학회지
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• 제28권4호
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• pp.313-319
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• 2012

2001년 8월 8일부터 12월 5일까지 말백합 대량 인공종묘 생산 실험을 실시하였다. 채란은 평균각장 $65.8{\pm}8.4mm$의 어미 100 개체로부터 공기노출과 수온상승자극 방법으로 채란 하였으며, 수정란에서 D형유생까지 발생 소요시간은 수온 $27^{\circ}C$에서 17시간 40분, 발생률은 6.1%, D형유생은 각장 $131.4{\pm}2.6{\mu}m$였다. D형유생은 4일간 사육하여 각장 $190.2{\pm}7.5{\mu}m$의 침착기 유생으로 성장하였고, 생존율은 48.1%였다. 이후 침착기 유생 130,000 개체를 저면 모래순환여과 방법으로 침착시켜 사육하였으며, 46일째 평균각장 $3.1{\pm}0.8mm$, 87일째 $6.6{\pm}1.8mm$, 그리고 114일째에 $10.5{\pm}0.9mm$로 성장하였다. 치패의 각장 (SL) 에 대한 각고(SH) 의 상대성장식은 SH = 0.8501SL + 0.0196 ($R^2=0.9987$)로 나타났다. 초기 침착치패인 각장 3.1 mm 이하에서 대량폐사가 일어났으며, 생존율은 사육 46일째 53.8%, 87일째 43.6%, 그리고 114일째에 51,000 개체가 생존하여 생존율 39.2%를 나타냈다.

• 한국수산과학회지
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• 제35권6호
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• pp.614-620
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• 2002

본 연구는 3년생 양식 가두리산 어미를 실내 수조로 옮긴 뒤 연중 생식소와 호르몬의 주년 변화를 파악하기 2년 동안 매달 샘플을 실시하였다. 형태학적 내분비학적 분석 결과 수컷은 암컷에 비해 앞서 성숙이 진행되고, 산란은 1월말에서 3월 사이에 이루어졌다. 산란기 이후 다음해 1월까지 모든 암컷은 난황형성 이전 단계에 머물러 있었고, 수컷 중 일부는 정자형성 활성을 다시 나타내기 시작했다. 10월에 접어들면서 일조량의 감소와 함께 성장 중인 난모세포에서 cortical alveoli이 나타나기 시작하고, 정자 형성이 점차 늘어났다. 10월과 2월 사이 암컷은 vitellogenesis, 수컷은 spermatogenesis가 일어나며, 난소 성숙지수는 암컷이 4.3$\~$$24.1\%$, 수컷은 $6\%$ 이상으로 증가하였다. 그리고 산란력 평가를 통해 농어는 다른 해산어류와 유사한 산란 전략을 지니고 있었으며, 다회산란의 특성을 지니고 있었다. 또한 농어의 생식기 과정동안에 이루어진 성호르몬인 testosterone (T)과 estradiol-17$\beta(E_{2})$ 의 분석 결과 생식기 발달에 따른 농도의 변화가 있는 것으로 확인되었다. 특히 11월에서부터 2월까지 높은 혈중 T와 $E_{2}$의 농도는 이 시기 수컷의 정자형성과 난소의 성숙란 형성에 있어 이들 호르몬의 관련성이 확인되었다. 이상의 결과로 양식산 농어의 생식기능은 실내 수조에서 발현이 되며, 따라서 인공종묘생산에 필요한 수정란 생산이 실내 수조에서 가능하다고 할 수 있다.

• 한국임상수의학회지
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• 제12권1호
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• pp.877-886
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• 1995

The recycling nuclear transplantation(NT) technique has the powerful potential of producing a large number of genetically identical embryos and offsprings from one embryo. Multiple generational cloning by this technique utilizes the NT embryo itself as the donor for the next generation of cloning. In this experiment, we have produced the third generational cloned embryos by recycling NT. Further we examined comparatively the electrofusion rate and in vitro developmental potential in the cloned embryos of the first second and third generations. The embryos of 16-cell stage were collected from the mated does by flushing oviducts with Dulberco's phosphate buffered saline containing 10 % fetal calf serum(FCS) at 47 hours after hCG injection. In the first generation NT, the nuclear donor embryos were synchronized in the phase of Gl/S transition of 32-cell stage. The first and second generation NT embryos developed to 16-cell were used as donor nuclei for second and third generation. The recipient cytoplasms were utilized the oocytes collected at 14 hours after hCG injection, following revoming the nucleus and the first polar body by micromanipulation. The separated blastomeres were injected into the enucleated recipient oocytes by micromanipulation and were fused by electrical stimulation. The electrofusion rate was seen to be 78.0, 88.0 and 90.3 % in the first second and third generation NT rabbit embryos, respectively. The fused oocytes were co-cultured with a monolayer of rabbit oviductal epithelial cells in M-199 solution containing 10 % FCS for 120 hours at 39$^{\circ}C$ in a 5% $CO_2$ incubator. The in vitro developmental potential to blastocyst stage was significantly(P<0.05) decreased in the third(7.2 %) generation NT embryos compared to the first(53.1 %) and second(16.1 %) generation NT embryos. Following in vitro development to blastocyst stage, they were stained with Hoechst 33342 dye for counting the number of blastomeres by fluorescence microscopy. The mean blastomere numbers and cell cycle numbers of NT embryos during the culture period were significantly(p<0.05) decreased in the second(93.9 cells and 6.55 cylces) and third(81.5 cells and 1.35 cylces) generation, compared to the first(189.9 cells and 7.55 cylces) generation.

• 한국가축번식학회지
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• 제24권4호
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• pp.429-437
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• 2000

본 연구는 retrovirus vector system 에 의해서 EPO와 EGFP 유전자가 전이된 소 태아세포를 이용하여 핵치환된 소 난자에서의 이들 유전자의 성공적인 도입을 조사하였다. Non-starved 소 태아세포는 탈핵된 소 난자의 위란강내로 주입되었다. 소 태아 세포와 난자는 세포간 전기자극에 의해 융합시켰으며, 이후 calcium ionophore와 6-dimethylaminopurine를 이용하여 난활성을 유도하였다. 핵치환에 의해 재구성된 난자는 8일 동안 CRlaa 배양액에서 소 난관상피세포와 함께 공배양하였다. 핵치환에 의해 재구성된 187개와 210(EPO, EGFP)개의 소 난자 중에서, 149개와 158(EPO : 80.0%, EGFP : 75.2%)개의 난자가 분할되었고, 이들 분할된 난자 중 36개와 35(EPO : 24.2%, EGFP : 22.2%)개의 난자가 배반포까지 발달하였다. 이들 배반포에서, EPO 유전자는 PCR에 의해 36개의 모든 난자에서 삽입을 확인하였고, EGFP 유전자의 발현은 형광현미경 하에서 35개의 모든 난자에서 확인하였다. 이 결과는 외래유전자가 삽입된 소 태아 세포를 이용하여 핵치환된 난자는 배반포까지 성공적으로 발달할 수 있다는 것을 나타낸다. 더우기, 이러한 방법은 효율적인 형칠전환 소를 생산하는데 이용될 수 있으리라 사료된다.

• 한국가축번식학회지
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• 제25권4호
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• pp.305-315
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• 2001

본 연구의 목적은 외래 EGFP 유전자를 분화이전의 웅성생식세포에 도입한 후 이를 난모세포내에 미세주입하여 형질전환동물을 생산하는 기술을 개발하는 데에 있다. 이를 위하여 반수체 정자세포에서 특이적으로 발현하는 생쥐의 mTP1과 햄스터의 hPrm2 유전자 발현 시기를 RT-PCR로 조사한 결과 그시기는 생쥐와 햄스터에서 각각 18일령과 20일령으로 확인되었다. 이에 따라 외래 유전자의 침입이 용이한 감수분열 직전단계인 17일령의 생쥐와 19일령의 햄스터 정자세포를 EGFP 유전자가 포함된 배양액에 부유시킨 다음, 전기자극을 부여한 결과 0.18 ㎸/cm의 전기자극을 가한 후 72시간 배양한 정자세포의 28.5%와 32.1%에서 EGFP 유전자가 발현되는 것으로 확인되었다. EGFP유전자가 도입된 반수체 정자의 수정 및 발달 능력을 검증하기 위하여, 이들 정자세포를 햄스터 난자 내에 미세주입 하였으나, 형광현미경하에서는 EGFP유전자의 발현은 관찰할 수 없었다. 이에 이들 난자를 공시하여 PCR분석을 실시한 결과, 약 44%의 수정란에서 EGFP 유전자의 존재가 확인되었다. 이러한 결과로 보아 반수체 정자세포는 외래 유전자를 난자 내에 도입하기 위한 운반체로 이용될 수 있을 것으로 생각된다.

• 한국양식학회지
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• 제13권4호
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• pp.277-284
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• 2000

제주 연안에서 주로 어획되는 연안 정착성 고급 어종인 흰점독가시치, S. canaliculatus 양식 기술개발을 목적으로 부화 자어의 먹이 섭취, rotifer와 Artemia nauplii에 대한 섭식 생태 등 종묘생산을 위한 기초적인 연구와 자어 사육 시스템의 개선과 새로운 먹이생물을 적용하여 대량 종묘생산을 실시하였다. 흰점독가시치 자어의 먹이 계열별 생존율 실험은 부화후 1일째부터 참굴의 trochophore 유생과 B. rotundiformis를 공급한 실험구에서 부화 후 10일째까지 평균 3.3%가 생존하였으나, rotifer와 ciliata를 공급한 실험구 및 rotifer와 N. oculata를 공급한 실험구에서는 정상적으로 섭식하지 못하고 부화 후 5일과 6일째 모두 사망하였다. 자어의 성장에 따른 rotifer의 1회 섭식량은 부화 후 5일째에는 평균 11개체, 부화 후 9일째에는 43개체, 부화 후 15일째에는 167개체로 급격히 증가하여 19일째에는 239개체를 섭식하였다. Artemia nauplii의 일간 섭식량은 부화 후 12일째 평균 43.5개체, 부화 후 15일째부터는 섭식량이 급격히 증가하여 438개체를 섭식하였으며, 부화 후 24일째에는 자어 1마리가 하루에 평균 3,000개체를 섭식하였다. 대량 종묘생산은 야외수조(23$M^3$)에서 규조류를 번식시키고 나서 N. oculata를 첨가하면서 1주일간 물 만들기를 실시하였다. 그 이후부터는 B. rotundiformis (136${\mu}$m)와 copepoda 류를 배양한 상태에서 수정란을 수용하여 부화된 자어를 50일간 사육하였다. 또한 바윗굴의 trochophore 유생(58~62${\mu}$m)을 자어의 대량 폐사가 발생하는 위험기(부화 2~7일)에 공급하여, rotifer로의 먹이전환이 원활하게 이루어졌다. 부화 후 5일까지의 생존율은 14.9%, 부화 후 10일까지의 생존율은 11.1%였으며, 최종 사육 기간동안 생존율은 10.7%, 치어의 평균 전장은 65.5${\pm}$0.4mm 이었다.