목적: 인간간엽줄기세포를 연골세포로 분화유도하는 성장인자 규명 및 주사침 크기 차이에 따른 세포증식 증진 비교이다. 연구 재료 및 방법: 인간간엽줄기세포를 연골세포유도배지에서 14, 21, 28일 배양하여 BMP-2, BMP-4, BMP-6, BMP-7, BMP-13, FGF-2, FGF-18, IGF-1, TGF-β1. TGF-β2, TGF-β3를 투여한 군들과 대조군에서 SOX-5, SOX-6, SOX-9 및 FOXO1A의 발현량을 분석하였다. 18, 21, 26 게이지(G) 주사침을 사용하여 배양접시에 인간간엽줄기세포를 접종하고 24, 48, 72시간 후 각각 세포증식을 측정하였다. 결과: 기존에 알려진 FGF, IGF-1, TGFβ1와 함께, BMP-2, BMP-4, BMP-6, BMP-7 등 BMP family 성장인자들에 의하여 연골세포분화 전사인자 유전자들인 SOX-5, SOX-6, SOX-9, FOXO1A의 유전자발현이 증가하였다. 48시간에서는 가장 작은 주사침인 26G군이 대조군 및 18G군에 비하여 유의한 세포증식 증진을 보였으며, 72시간에서도 가장 작은 주사침인 26G군이 대조군에 비하여 유의한 세포증식 증진을 보였다. 결론: 인간간엽줄기세포의 연골세포분화 유도능을 가진 성장인자들을 고찰할 수 있었고 주사침 크기에 따른 세포증식 변화를 규명할 수 있었다.
Conjugated linoleic acid (CLA)는 전지방세포의 증식 및 분화를 억제시키므로서 포유동물에서 지방의 축적을 감소시키는 것으로 알려져 있다. 논 연구의 목적은 diglyceride(DG), CLA, 및 DG-CLA가 전지방세포의 증식 및 분화를 억제시키는지를 알아보고자, 세포생존측정, glycerol-3-phosphate dehydrogenase (GPDH) 활성측정, 지방축적에 대한 Oil red O 염색을 실시하였다. DG, CLA, 및 DG-CLA의 처치는 전지방세포의 증식을 농도 의존적으로 감소시켰으며, 그러한 효과는 CLA에서 가장 강하게 나타났다. 이들 시험물질의 $100 {\mu}g/ml$ 농도에서 DG, CLA, DG-CLA는 유의적으로 GPDH의 활성을 낮추었으며(p<0.05), 이러한 결과는 전지방세포의 분화를 억제하는 것을 의미한다. 더불어 이들 시험물질은 전지방세포의 분화과정 중에 지방축적을 효과적으로 억제시켰다. 더욱이 DG-CLA가 DG 혹은 CLA보다 분화 및 지방축적에 대해 더 강한 효과를 보였다. 이러한 결과로부터 DG-CLA의 섭취는 사람에서 체중조절의 유용한 효과를 얻을 수 있을 것이다.
항암 화학요법제의 하나인 5-Fluorouracil 이 과상돌기의 성장에 미치는 영향을 연구하기 위하여 20두의 백서를 반씩 나누어 실험군에는 동약물을 체중 kg당 25mg씩 2일간 복강내주사하고 대조군에는 생리식 염수를 주사한 후 각각 제1,3,7,14 및 21일에 두 마리씩 도살하여 과상골디연골부의 조직학적 변화를 관찰하였다. 또한 도살 2시간 전에 5μCi/kg mM 의 ³H-thymidine을 주사하여 표본의 일부는 자기방사법적으로 처리 관찰 하였다. 관찰 결과는 다음과 같다.
1. 과상돌기 연골부의 후경에 상당한 감소가 일어났으며 제7일에서 가장 현저하였다.
2. 이러한 영향은 연골제거대와 세포증식대에서 가장크고 그 다음이 비대층이었다.
3. 제 7일의 변화 증식대엣는 기질 호 염색성의 증가, 핵 형태의 난원형화가 오고 소와내의 세포수는 1~2개였다. 비태층의 소와는 현저하게 작아지고 기질의 호염기성이 뚜렷하며 세포의 배열은 츹어지고 약간의 핵은 그 배 열이 불규칙하며 숫자고 대조군보다 적었다.
4. 위와같은 변화는 제 14일에서 감소하고 점차 회복적인 조직소견을 보여 제21일에는 성장이 거의 대조군에 근접한 조직상을 보였다.
5. 자기방사법적으로 세포증식대 및 연골제거대에서 세포분열에 대한 억제효과를 관찰한 바 제 7일 에서 가장 시하였고 특히 연골제거대에서 심하였다.
대체적으로 자기방사법적 관찰소견은 조직학적 소견과 일치하였다. 결론적으로 하악골 과상돌기의 성장은 5-Fluorouracil의 영향하에서 세포의 증식 및 분화상태로 보아 일정기간동안 저해되며 제 7일의 극기를 지나 점차 회복되어감을 나타내었다.
본 연구에서는 감국 에탄올 추출물이 조골세포의 증식 및 분화에 미치는 영향을 분석하여 골다공증 관련 식물성 에스트로젠으로써의 이용 가능성을 확인하고자 하였다. 감국 에탄올 추출물은 30~100 ${\mu}g/mL$ 농도 범위에서 조골세포의 증식을 유의적으로 증가시켰으며, 100 ${\mu}g/mL$ 농도에서 대조군 대비 최대 122% 세포성장을 나타내었다. 이러한 세포증식 유도는 estrogen antagonist인 tamoxifen 처리 시 상쇄되어 estrogen 유사효과에 의한 것으로 사료되었다. MC3T3-E1 세포의 분화에 미치는 영향을 살펴보고자 대표적 분화지표인 ALP 효소활성, collagen 함량, mineralization 수준을 측정한 결과, 10, 30 ${\mu}g/mL$ 농도에서 ALP 활성의 유의적 증가와 200 ${\mu}g/mL$ 농도에서 collagen 함량과 mineralization의 유의적인 증가를 확인하였으며, ALP 활성, collagen 함량 모두 tamoxifen 처리에 의해 증가 효과가 상쇄되어 estrogen 유사작용에 의한 것으로 사료된다.
다양한 생체 재료들을 이용한 마이크로 및 나노 크기의 표면 구조 모사는 조직공학에서 세포의 성장 및 분화에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 특히, 마이크로-나노 구조가 공존하는 계층적 표면 구조는 골 아세포의 증식과 분화에 탁월하여 뼈 조직 재생에 응용되어 왔다. 기존에는 화학적 처리 기법을 이용하여 마이크로 표면 구조가 제작 되었으나 미세 거칠기 및 계층적 표면 구조의 제어가 어려웠다. 현재 이러한 문제점들을 극복하기 위해 플라즈마를 이용한 애칭 기법이 주로 이용되고 있으나 높은 온도 공정 환경에 의한 재료 선택의 한계점 및 오랜 공정 시간에 의한 플라즈마 처리 효율이 감소되어 원하는 표면구조 및 거칠기를 얻을 수 없다는 단점이 있다. 본 연구에서는 이러한 문제점들을 극복하기 위해 마이크로/나노 주조 기법 이용하여 생체적합성 합성고분자 poly(${\varepsilon}$-caprolactone) (PCL) 위에 연꽃잎 구조를 모사한 후 플라즈마 애칭 기법을 이용하여 마이크로-($3.01-3.07{\mu}m$)와 나노크기 ($97{\pm}16nm$)를 동시에 갖는 계층적 구조를 제작하였다. 제작된 구조의 효능을 관찰하기 위해 조골세포를 배양한 결과 평평한 PCL 구조보다 제작된 계층적 구조가 높은 세포성장률 (>2.9배)및 세포 분화도(>2.1배)를 보였다. 이러한 결과는 새로운 표면 공학적 모델로서 손상된 뼈 및 치아조직 재생을 위한 적합한 거칠기 및 표면적인 환경을 제공해 빠른 재생 능력과 더불어 치료기간의 단축을 가져 올 수 있을 것으로 사료된다.
연골세포 분화기구 연구의 기초단계로서 미세 세포배양법을 정립하였으며, 세포의 응집정도와 연골분화의 관계를 조사하기 위하여 계배 limb bod 간충직세포를 여러가지 농도로 micromass 배양하면서 세포농도에 따른 세포증식정도와 proteoglycan에 결합된 alcian blue의 양 및 [35 S] sulfate의 sulfate proteohlycan에 표지되는 속도를 측정하고, 면역조직화학법을 이용하여 type II collegen의 발현을 관찰하였다. 각 농도별로 배양한 Hambruger-Hamilton stage 23/24 간충직세포 중 5. $\times$ 106 cells/ml 이상의 농도로 배양한 세포는 연골세포로 분화하였으나, 저농도로 배양한 세포는 분화하지 않았다. 반면에 stage 18/19 간충직세포는 분화단계 중에서 동일세포들끼리 응집되는 단계이며 stage 23/24 간충직세포 이 단계를 지나 분화능을 갖는 세포응축의 단계인 것으로 생각된다. 본 연구 결과 세포응집 및 분화능은 간충직세포의 발생시기에 따라 다르며, 분화능을 갖기 위해서는 세포응집이 선행조건이고, 그 적정 미세 배양 농도는 5-10 $\times$ 106 cells/ml임을 알았다. 한편, hyaluronidase의 활성은 stage 23/24세포 배양 전 과정에서 비교적 일정한 것으로 나타나 이 시기의 세포분화에는 별로 중요하지 않는 것으로 보인다.
골다공증은 호르몬의 변화와 무기질 감소에 의해 골밀도의 감소를 유발하여 골절의 위험을 높이는 질환이다. 최근 보고에 의하면, 간염바이러스 및 에이즈 치료제로 사용되고 있는 Adefovir dipivoxil (ADV)의 장기적 복용에서 골다공증 부작용이 유발할 수 있음이 보고 되고 있다. 이에 대한 연구수행을 위해 골모세포주 hFOB1.19와 혈관내피세포 HUVEC을 이용하여 ADV에 대한 생물학적 연관성을 평가하였다. 우선적으로 ADV를 농도별로 처리한 후 각 세포와 핵의 형태학적 분석을 위해 DAPI와 crystal violet 염색을 시행하였다. 또한 세포 증식에 대한 약물 효과를 평가하기 위하여 CCK-8분석과 골모세포에 대한 분화유도 및 억제 효과를 확인하기 위하여, ALP 염색을 진행하였다. 그 결과, ADV는 hFOB1.19 세포와 HUVEC 세포에서 농도 의존적으로 세포의 비대 현상을 유발하였고, 세포의 증식이 억제되었다. 이러한 원인들을 규명하기 위해 TGF-${\beta}$발현을 조사하였을 뿐만 아니라 이러한 발현 감소에 의한 생물학적 영향이 골모세포로부터 골세포로의 분화 과정에 관여하고 있음을 확인 할 수 있었다. 결론적으로, 본 연구에서는 ADV 약물이 골모세포와 혈관내피세포의 TGF-${\beta}$의 발현을 억제하여 핵의 크기 증가와 세포형태의 비대증을 유발하며, 세포의 증식억제 및 골모세포 분화능에 영향을 줌으로서 골다공증을 유발할 수 있는 가능성을 확인하였다. 이러한 결과는 ADV 복용에 따른 골다공증 발병 원인을 이해하기 위한 기초 연구 및 이를 이용한 임상영역에 활용 될 수 있을 것으로 사료된다.
감초산이 인체 치은 섬유모세포에 미치는 영향을 세포의 성장과 증식, 총 교원질 합성 및 인체 치은 섬유모세포 핵내 acridine orange 결합으로 추적조사하였다. 조절이 되지 않는 성장을 해결하기 위하여 세포분화인자인 감초산이 배양 치은 섬유모세포의 활성에 미치는 효과를 검색하였다. 감초산 존재하의 배양 인체 섬유모세포의 세포성장 및 증식, 교원질 합성 및 세포 핵내 acridine orange 결합을 각각 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT)법, 4-hydroxyproline, 유식세포분석기를 이용한 acridine orange 결합으로 검색하였다. 형태학적으로 $100\;{\mu}g/ml$의 감초산으로 처리한 섬유모세포는 모양이 둥글게 되었다. 감초산은 $50\;{\mu}g/ml$ 이상의 농도에서 치은 섬유모세포의 성장과 증식을 억제하였다. 감초산 존재 시에 세포내 총 교원질 양이 감소하였고, 세포외배지내의 교원질 총 양이 증가하였다. 인체 치은 섬유모 세포를 $100\;{\mu}g/ml$의 감초산과 함께 24 시간동안 배양하였을 때, 80 채널 이상의 평균형광을 갖는 diploid 세포가 감소하였고, 80 채널 이하의 형광을 갖는 acridine orange결합이 증가하였다. 이러한 연구 결과 감초산은 인체 섬유모세포에서 세포성장 및 증식, 교원질합성 및 DNA 분절화를 유도함이 제시하였다.
쇠비름(portuaaca oleracea L.)의 줄기절편체로부터 캘러스유도를 위한 적정배지는 BAP 0.1 + 2,4-D 1.0 mg/L., 30g/L sucrose 및 10 g/L agar를 첨가한 MS배지로 나타났으며, 액체배양에 의한 세포의 증식에는 BAP 0.1 + 2,4-D 0.5mg/L가 함유된 MS배지가 효과적이었다. 장시간 건조처리는 세포는 활력과 재생 및 재분화율이 강하게 억제되나, 1시간 및 2시간동안의 단시간 건조처리한 세포의 재분화율은 각각 83및 80%로 나타나나 무처리 61%에 비해 높았다. 0.6% NaCl의 2일간 전처리는 세포의 재분화율에는 영향을 미치지 않으나, 세포활력 및 재생률에는 억제작용을 나타내었다. Sucrose 70및 100 g/L를 전처리한 쇠비름세포의 재분화율은 각각 80및 81%로 무처리에 비해 높았다.
대황(Eisenia bicyclis)은 온대 태평양에 서식하며 우리나라에서는 울릉도 일대에서 주로 발견 되는 갈조류이다. 대황은 칼슘 함량이 가장 높고 요오드, 철, 마그네슘뿐만 아니라 많은 미네랄과 비타민을 포함하고 있다. 본 연구에서는 대황 추출물을 이용하여 세포 수준에서 대황의 골 형성에 미치는 영향을 검토하였다. MTT 분석법에 의한 조골세포 증식률에서는 대황 에탄올 추출물 10 ${\mu}g/ml$ 처리하였을 때 128%의 높은 활성을 나타내었다. 반면 열수추출물 첨가군에서는 에탄올 추출물에 비해 유의적으로 낮은 활성을 나타내었고, 첨가 농도가 증가할수록 감소되는 결과를 보였다. 대황 추출물의 농도에 따른 석회화 형성에 미치는 영향을 검토한 결과, 대황의 에탄올 추출물 1~100 ${\mu}g/ml$의 범위에서 시료를 처리 하지 않은 대조군에 비해 높은 골석회화 형성능을 나타내었다. 또한, 적색의 석회화 형성 부위를 현미경을 통해 관찰한 결과, 대황의 에탄올 추출물을 처리 하였을 때, 시료를 처리하지 않은 대조군 보다 붉은 색의 반점이 많이 형성된 것을 확인할 수 있었다. 한편, ALP 활성에서는 에탄올 추출물 50 ${\mu}g/ml$에서 179% 활성을 나타내었다. 파골세포인 RAW 264.7 세포를 이용하여 세포 증식률을 측정한 결과, 대황 열수추출물의 경우 1~200 ${\mu}g/ml$의 모든 농도에서 대조군과 비교하여 유의적으로 감소하여 파골세포의 증식억제 효과가 나타났다. 파골세포의 분화형태를 측정하고자 TRAP 효소 활성을 측정한 결과, 열수 및 에탄올 추출물의 10 ${\mu}g/ml$이상의 농도에서 대조군에 비해 감소하는 경향을 나타내었다. 대황 추출물의 첨가 농도가 증가함에 따라 파골세포의 증식이 감소된 결과와 마찬가지로 파골세포의 분화 지표인자인 TRAP활성 역시 농도가 증가함에 따라 감소함을 알 수 있었다. 이상의 결과, 대황 추출물이 조골세포의 증식, 분화유도와 석회화능을 촉진하고 파골세포의 증식 및 분화를 억제시킨다는 것을 알 수 있었다. 향후 대황 추출물 중의 활성성분들의 규명과 in vivo 연구가 병행된다면 조골세포의 증식과 파골세포의 억제에 관여할 수 있는 기능성 식품의 천연소재로 개발이 가능하리라 사료된다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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