세포외 다당류를 분비하는 새로운 methylotrophic bacteria를 분리하여 세균의 특징과 그 세균이 생산하는 세포외 다당류의 물리 화학적 특성을 조사하였다. 분리균주는 그람음성의 간균으로 편모가 없는 비운동성 세균이며, DNA의 G+C 함량은 53-56%이었고, plasmid를 가지고 있지 않았다. 메탄올과 메틸아민만을 기질로 이용하였으며, 탄소동화경로로는 ribulose monophosphate pathway를 이용하는 절대 methylotrophic bacteria이었다. 성장을 위한 최적온도와 pH는 각각 $35^{\circ}C$와 6.5이었고, 0.5%(v/v)의 메탄올이 포함된 배지에서 가장 빨리 성장하였다(세대시간=2.4시간). 분리균주는 절대 호기성 세균으로 질소원과 산소가 결핍된 조건에서 다량의 세포외 다당류를 분비하였다. 다당류 생산을 위한 최적온도와 pH는 각각 $30^{\circ}C$와 6.5이었고, 1.0%(v/v)의 메탄올이 포함된 배지에서 배지내의 탄소 대질소비가 57.4일 때 가장 많이 생산되었다. 정제된 다당류는 포도당과 galactose로 이루어져 있었다. 에탄올 처리전의 다당류는 낮은 pH에서 더 높은 점도를 보였고, 온도와 염류농도의 변화에도 비교적 안정하였다. 에탄올 처리후의 다당류는 xanthan gum보다 높은 점도를 나타내었고, pH, 온도, 염류농도의 변화에 대해 점도변화가 크지 않았다. 냉동건조된 다당류를 전자현미경을 이용하여 관찰하였을 때, 에탄올 처리전의 다당류는 얇은 막이 겹친 구조를 하고 있었고, 에탄올 처리후의 다당류는 굵은 섬유상의 모습을 띠고 있었다.
Methylomonas mucosa를 이용하여 세포외 다당류의 생산을 알아보았다. 본 미생물은 성장을 위해 메탄올을 탄소원으로 이용하여 세포외 다당류를 생산한다. 효과적인 발효 공정 시스템의 개발올 위해 회 분식, 유가식, 연속식 배양을 수행하여 각각의 당류 에 대한 생산성을 알아보았다. 플라스크 배양에서 메탄올이 약 1 % (v/v) 이상에서 다당류의 생산과 세포의 성장은 저해되었다. 1% (v/v)에서 최대 비성장속도를 나타내었고 C/N 비율이 높을수록 다당류의 생산은 많았다. 다당류의 생산에 $Mg^{2+}$ 이온 농도가 크게 영향을 줌을 확인할 수있었다. 유가식 배양에서는 다당류의 농도가 회분식에 비 해 4배 이상 높았으나 수율은 오히려 감소하였다. 연속주입을 통한 유가식 배양은 간헐적 주업방법보다 생산성이 높았다. 이는 간헐적 주입에서 나타날 수 있는 메탄올에 의한 제한이나 저해가 없었기 때 문으로 보여진다. 연속조엽은 산소 제한을 피하기 위해 순수산소를 공급하였다. 희석률이 O.21h-1까지 증가하여도 수융 과 생산성은 증가하였다. 생산된 다당류 용액의 점도는 다당류의 증가에 따라 지수적으로 증가하였다.
pullulan은 maltotriose를 기본 단위로 하여 .alpha.(1.rarw.4), .alpha.(1.rarw.6)결합으로 구성된 일종의 .alpha. glucan으로, 'black yeast'로 알려진 Aureobasidium pullulans에 의해 세포외로 생산되는 다당류이다. pullulan은 다른 다당류에서 볼 수 없는 많은 우수한 성질이 있어, 식품에서 접착, 증점, 안정, 품질 개량 효과등의 이용을 비롯하여, 산소 불투과성 필름, 가식성 필름, 플라스틱 결착제, 코오팅제 등 여러가지 무공해 재료로써 광범위한 분야에 그 이용 가능성이 모색되고 있다. 본 고에서는 A. pullulans를 이용한 pullulan 생산의 연구 현황과 그 특성 및 응용 가능성에 대해 고찰해보고자 한다.
본 연구는 표준균주 S. mutans KCTC3065를 이용하여 자일리톨에 내성을 가지는 자일리톨 내성균주 (XR)를 형성하고, 이들을 자일리톨이 존재하는 상태에서 배양하며 성장과 산생성, 세포외 다당류 합성관련 유전자 gtfB와 gtfD의 mRNA 발현 변화를 확인하고자 하였으며 다음과 같은 결론을 얻었다. 1. 장기간 자일리톨에 반복 지속 배양한 XR의 경우 1%의 자일리톨을 첨가된 TYE에 배양하여도 성장과 산생성이 억제되지 않았으므로, 형성된 XR은 자일리톨에 대한 내성을 잘 유지하는 것을 확인하였다. 2. XR과 XS를 각각 0%, 0.1%, 1%의 자일리톨을 첨가하여 성장과 산생성의 변화를 관찰한 결과 XS는 자일리톨에 농도 의존적으로 성장과 산생성이 농도 의존적으로 억제되었으나, XR은 XS와 다르게 첨가된 자일리톨의 농도와 상관없이 성장과 산생성 모두 비슷한 패턴을 보였다. 3. 첨가된 자일리톨의 농도에 따른 XS와 XR의 세포외 다당류 합성관련 유전자 gtfB와 gtfD의 mRNA 발현은 XR의 경우에는 성장이나 산생성과 마찬가지로 유전자의 발현의 차이가 거의 없는데 비해, XS의 경우에는 첨가된 자일리톨에 농도 의존적으로 gtfB와 gtfD의 mRNA 발현이 감소하는 것이 확인되었다. 이상의 실험 결과를 종합하면 XR의 일반적인 특징은 자일리톨에 의해 성장과 산생성이 억제되는 XS와 많이 다른 것으로 확인되었으며 자일리톨 농도에 따라 세포외 다당류 합성관련 유전자 gtfB와 gtfD의 mRNA 발현의 차이가 나타나지 않았으며 추후 세포외 다당류 합성을 실증할 수 있는 보충실험을 통해 보다 자세한 메커니즘을 분석하도록 하겠다.
토양에서 분리한 세포외 다당류 생산균주 PS-12는 형태학적, 생리학적, 화학적 분석에 의하여 Bacillus sp.에 속하는 균주로 동정되었으며, 분리균주 PS-12는 Bacillus sp. PS-12로 명명하였다. Bacillus sp. PS-127가 생산하는 세포외 다당류는 에탄올 침전, cetylpyridinium chloride (CPC) 침전과 gel permeation chromatography를 이용하여 정제하였으며, 정제된 다당류 PS-12의 당조성은 glucose, mannose, galactose와 fucose가 7:3.2:2:1의 몰비로 구성되어있었다. Bacillus sp. PS-12로부터 분리된 다당류 PS-12를 이용하여 면역증강효과를 확인하였다. TNF-${\alpha}$ 및 lL-6 측정은 RAW264.7 대식세포주를 사용하였으며 cytokine 정량을 위하여 ELISA kit를 이용하였다. RAW264.7 세포주에 대한 PS-12의 세포독성을 확인하기 위하여 세포독성이 10% 미만을 나타내는 농도인 2 ${\mu}g$/ml을 PS-12의 최대농도로 측정하였다. PS-12는 ${\mu}g$/ml에서 TNF-${\alpha}$를 정상세포보다 50배 이상 높은 수치로 생산하였다. 또한 lL-6의 생산을 농도 의존적으로 증가시켰다. 이러한 결과로부터 PS-127가 면역세포에 대해 세포독성을 거의 나타내지 않는 농도에서 대식세포로부터 TNF-${\alpha}$와 11-6의 cytokine 생산을 함으로써 면역증강효과를 나타낸다는 것을 확인하였다.
능이버섯(Sarcodon aspratus)의 무름병소에서 분리한 MK1 균주는 절대호기성 타가영양 세균으로 거식세포의 활성을 유도하는 균체외다당류를 다량 생산한다. MK1의 최적 성장 조건과 MK1이 생산하는 균체외다당류의 몇가지 물리적 성질을 알아보았다. MK1은 glucose, galactose, fructose, sucrose를 탄소원으로 잘 이용하나 MK1의 lactose 이용은 다소 저조하였다. 한편 potato starch와 dextrin을 이용하지 못하였다. MK1은 pH 7.0, $30^{\circ}C$, 200 rpm, 2% glucose, 0.05~0.2% $(NH_4)_2SO_4$에서 최적 성장을 보였다. 최적 성장조건에서 얻은 균체외다당류($EPS_{opt}$)는 탄소(37.1%), 질소(2.2%), 산소(49.3%), 수소(6.4%)로 구성되었으며, 황(S)은 검출되지 않았다. 그리고 아미노당과 산성 당을 함유한 이종다당류로 여겨지며, SDS-polyacrylamide gel elctrophoresis로 분석한 $EPS_{opt}$의 분자량은 14.8~47.9 kDa였다. Glucose 배지에서 생산된 균체외다당류($EPS_{glu}$)의 점도를 측정한 바, pH 6.0과 7.5에서 얻은 것들(0.1 g/ml)의 상대 점도($\acute{\eta}_{rel}$)는 각각 1.23과 1.39이었다. 또한 형태 또는 질감에도 차이가 있었는데, 배지의 pH가 낮을수록 미세결정형을, pH가 높아질수록 끈끈한 질감을 보였다. 따라서 배지 pH가 균체외다당류의 물리적 성질에 영향을 주는 것으로 사료된다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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