• 한국가축번식학회지
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• 제24권1호
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• pp.69-76
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• 2000

수정란이식에 필요한 다량의 수정란을 생산하는 수단인 배양액과 적정 수정란의 수는 수정란의 체외발달에 많은 영향을 미치므로 이들 관계를 조사하여 수정란의 체외배양체계를 확립하고자 본 연구를 실시하였다. 도축장에서 채취한 난소에서 미성숙 난자를 채란하여 10% FBS가 첨가된 TCM -199 에 LH(10 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$), FSH(35 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$), estradiol-17 $\beta$(1 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$)가 첨가된 체외성숙배양액에서 24시간 동안 배양 후, 동결정액은 Percoll-density gradients(45 vs. 90%)을 이용하여 700 g 에서 30분 동안 처리한 다음, 체외수정배양액 (IVF-Fert)에서 체외수정을 유도하였다. 수정이 확인된 수정란은 50 ${\mu}\ell$ 배양액에 1, 25 또는 50개의 수정란을 난구세포와 공배양을 하여 9일 동안 배양하였다. 일정한 배양액에서 수정란의 수가 체외수정란의 발달에 미치는 요인을 분석하고, 개별배양 또는 그룹배양 시 난구세포와의 공동배양 효과를 조사한 결과는 다음과 같다. 1. 50 ${\mu}\ell$ 배양액에 1개, 25 또는 50개의 수정란을 수정 후 9일 동안 배양한 결과, 25와 50개의 수정을 배양했을 경우에는 발달율이 36.5 와 26.5%를 보여 1개의 수정란을 배양했을 경우에서의 발달율 6.2% 보다 유의적으로 높은 발달율을 얻었다(P＜0.05). 2. 1, 25, 50개의 수정란을 배양시 수정 후 6일째 발달율은 1.0~3.5%였으나, 수정 후 7, 8, 9 일째의 발달율은 1개의 수정란을 배양하는 것보다 25, 50개의 수정란을 배양한 처리구에서 유의적으로 높은 발달율을 얻었다 (P<0.05). 3. 일정한 배양액에서 1, 25 및 50개의 수정란을 배양 시 수정 후 8일째의 배반포 수정란의 세포수를 조사한 결과, 1개의 수정란을 배양시 배반포 수정란의 수는 93.0개였으나, 25, 50개의 수정란을 배양시는 각각 112개의 세포수를 얻어 유의적으로 높은 세포수를 나타내었다 (p＜0.01). 4. 일정한 배양액에 1개 또는 25개의 수정란을 난구세포와 공배양을 하거나, 하지 않았을 때의 발달율은 각각 15.0와 3.7% 또는 34.5와 9.0%로서 난구세포와 공배양을 하는 것이 유의적으로 높은 발달율을 나타내었다 (p＜0.01 수정 후 8 일째의 배반포 수정란의 세포수도 각각 96.1와 82.0개 또는 116.4 와 96.5개로서 난구세포와 공배양을 한 처리구에서 유의적으로 높은 세포수를 나타내었다 (p＜0.01). 이상의 결과를 요약하면, 수정란의 수가 체외수정란의 체외발달에 중요한 영향을 미친다는 것을 알 수 있었으며, 다량의 체외수정란을 생산하여 수정란 이식에 이용하기 위해서는 체외성숙 / 수정된 체외수정란을 일정한 배양액 (50${\mu}\ell$) 에 25, 50개의 수정란을 난구세포와 공배양하는 것이 높은 배 발달율과 세포 수를 얻 을 수 있을 것으로 사료된다.

• 식물조직배양학회지
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• 제24권1호
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• pp.57-61
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• 1997

Superoxide dismutase (SOD) 고생산세포주로 선발된 토마토(Lycopersicun esculentum) 배양세포를 사용하여 현탁배양에 따른 SOD 활성과 isoenzyme변화를 조사하고 토마토 식물체의 것과 비교하였다. 현탁배양은 세포생중량 2 g을 1 mg/L 2,4-D, 30 g/L sucrose를 함유한 MS 배지 50 mL과 함께 mL flask에서 $25^{\circ}C$암상태로 배양(100 rpm)하였다. 세포생장은 계대배양후 20일에 최고점에 도달한 후, 급격히 감소하며 배양 후 23일부터 세포가 검게 변하였다. 세포 단위무게당 SOD활성(unit/g dry cell wt)은 배양 후 23일부터 증가하여 28일째에 최고활성(52,400 unit)을 나타낸 후 급격히 감소하였다. 세포 밖으로 분비되는 extracellular SOD활성은 배양 후 25일에 최고치(27,800 unit/so mL medium)를 나타낸 후 감소하였다. Flask 전체의 SOD활성은 배양 후 25일에 최대치(35,700 unit)를 나타내었으며 extracellular SOD 활성이 약 75%을 차지하였다. 토마토 배양세포에는 4개의 SOD isoenzyme이 존재하며, isoenzyme의 패턴변화는 세포생장에 따른 효소활성의 변화와 일치하였다. 토마토 식물체는 배양세포에 없는 CuZnSOD가 존재하며 배양세포와 식물체 조직사이에는 서로 다른 isoenzyme 패턴이 존재함을 알 수 있었다.

• Radiation Oncology Journal
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• 제17권2호
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• pp.158-165
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• 1999

목적 : 유방암 환자의 피부 섬유모세포를 이용한 in vitro 배양 실험을 통하여 16 세포집락 비율 분포의 변화를 관찰하여 16 세포집락 비율과 in vitro 세포 노화 및 섬유모세포 공여자의 in vivo 연령과의 연관성을 조사하고자 하였다. 대상 및 방법 :유방암 수술을 받은 3명의 환자로부터 얻은 유방부위 피부를 본 실험대상으로 사용하였다. 각 환자의 유방부위 피부로부터 얻은 피부 섬유모세포 표본의 명칭을 C1, C2, C3a 및 C3b로 분류하였으며 각 표본 공여자의 연령은 C1이 44세, C2는 54세, 그리고 C3a 및 C3b는 동일한 공여자로서 연령은 55세였다. 피부 섬유모세포의 단일세포 부유액은 일차조직 배양법으로 얻었으며 100 개의 세포들을 100m1 의 조직배양 flask에 분주 후 37$^{\circ}C$에서 2주 동안 배양하였다. 5개의 flask에서 배양한 피부 섬유모세포의 16 세포집락 비율을 알기 위하여 crystal violet으로 염색한 후 10 배율의 입체현미경을 이용하여 16개 세포 이상으로 구성된 세포집락수를 1개 이상으로 구성된 세포 집락수로 나눈 수치를 16 세포집락 비율로 나타내었으며 각각 5개의 flask에서 얻어진 16 세포집락 비율 평균치를 각 계대배양에 대한 16 세포집락 비율로 나타내었다. C1, C2의 계대배양 횟수는 각각 12회, 17회 였으며 C3a와 C3b는 14회 계대배양 하였다. 결과 : C1, C2, C3a 및 C3b 피부섬유모세포 모두에서 16 세포집락 비율이 계대배양 횟수의 증가에 따라 감소하는 경향을 보였으며, 집단이배화증가에 따라 감소하였다. 그리고 계대배양 횟수가 증가함에 따라 집단이배화가 증가되는 것이 관찰되었으며 특히 C3a 섬유모세포의 상관계수가 0.954(P=0.0001)로서 가장 강한 상관관계가 있음을 보였다 동일한 지점의 집단이배화에서 16 세포집락 비율이 고연령자인 C3a 공여자보다 저 연령자인 C1 공여자에서 더 높게 나타났다. 결론 : 사람 피부 섬유모세포의 in vitro 배양에서 계대배양 횟수의 증가에 따라 집단이배화는 증가되고, 세포 노화로 인해 16 세포집락 비율은 감소되는 것을 알 수 있었다. 또한 저연령의 피부 섬유모세포일수록 집단이배화 증가에 따른 16 세포집락 비율 감소가 고연령의 경우보다 완만하였다. 따라서 피부 섬유모세포 in vitro 배양에서 관찰되는 16 세포집락 비율은 in vitro 세포노화의 지표로서 유용하며 또한 피부 섬유모세포 공여자의 연령 평가에 이용될 수 있을 것으로 사료된다.

• 한국임상수의학회지
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• 제17권1호
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• pp.21-27
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• 2000

고양이 말초혈액 다형핵백혈구 (PMN)의 유주활성에 있어서 계난백유래물질 (EWD)의 면역증강 효과를 검토하였다. PMN의 유주활성은 EWD 그 자체 및 EWD로 배양한 PMN의 배양상층액에서는 활성이 존재하지 않았다. 그러나 EWD로 배양한 MNC 배양상층액에서는 PMN에 대한 유주활성이 증가되었다. 본 활성은 checkerboard assay를 통해 진성 유주활성으로 밝혀졌다. 이러한 고양이 PMN 유주활성은 human recombinant interleukin-8(hr IL-8)에 의해서도 증가되었다. IL-8의 또 다른 특성인 세포 형태변형 실험에서도 EWD로 배양한 MNC의 배양상층액과 hr IL-8 모두에서 높은 수준의 세포 형태변형효과를 나타내었다. 이와 같이 EWD로 배양한 MNC의 배양상층액과 hr IL-8 모두에서 증가된 PMN의 유주활성 및 세포변형효과는 anti-human IL-8mAb에 의해 농도의존적으로 억제되었다. 이상의 결과로부터 EWD는 고양이 PMN의 유주활성에 있어서 면역증강 효과가 있으며, 이것은 EWD에의해 활성화된 MNC에서 분비되는 IL-8양 유주성 인자에 의해 PMN의 유주활성 증가 및 세포 형태 변형이 일어나는 것으로 사료되었다.

• KSBB Journal
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• 제4권2호
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• pp.143-149
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• 1989

하이브리도마 세포를 고농도 배양하기 위하여 세포 침전장치를 고안하여 사용하였다. 위로 올라갈수록 직경이 넓어지는 침전조는 세포의 침전이 잘 일어나지만 침전된 세포가 침전조 벽에 누적되는 결점을 보였고, 아래 위의 직경이 균일한 침전조는 희석율이 높아질수록 유출되는 세포가 증가하는 문제점을 나타내었다. 특히 유출되는 세포속에는 dead cell 보다 viable cell의 비율이 높아 배양기 내의 dead cell이 급격히 농축되는 현상을 보였다. 그러나 침전조를 적절히 고안하여 세포 누적 현상을 막고 동시에 세포 유출을 완화시킬 경우 세포농도 $5{\times}10^6$ cells/ ml에서 일주일간 배양이 가능했다. cell viability의 측정이 용이하므로 침전조를 이용한 하이브리도마 고농도 배양의 특성을 연구하는데 많은 도움을 줄 수 있을 것으로 판단된다.

• Korean Chemical Engineering Research
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• 제44권1호
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• pp.40-45
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• 2006

원하는 유전자를 배큘로바이러스의 감염에 의하여 초파리 Drosophila melanogaster S2 세포에 도입하는 배큘로바이러스/S2 세포 발현 시스템은 강력하고 안전한 배큘로바이러스의 장점과 세포가 파괴되지 않는 S2 세포의 장점을 접목한 시스템이다. 본 연구에서는 외래 목적 단백질로 발현 모니터링이 손쉬운 녹색형광단백질(green fluorescent protein)을 발현시키는 재조합 배큘로바이러스를 이용하여 S2 세포에의 감염조건들에 대한 영향 연구를 수행하였다. 재조합 배큘로바이러스의 S2 세포에의 감염조건으로는 multiplicity of infection(MOI), 초기 세포 수, 배큘로바이러스 용액이 세포를 적시는 최소 부피, 배큘로바이러스를 첨가한 후 제거하기까지의 배양시간 그리고 배큘로바이러스 제거 후 S2 세포를 혈청이 존재하는 배지에서 키우는 배양시간을 선정하였다. MOI는 일반적으로 크게 하는 것이 높은 발현 수율을 위하여 좋은 결과를 보였으나 세포배양이 길어지는 경우 세포독성의 문제가 심각해 질 수 있고 실제적인 배양에서는 높은 MOI를 유지하는 것이 불가능하므로 사용하는 100 mm 배양접시에서 배큘로바이러스와 S2 세포가 접촉하는 동안의 변수들인 MOI를 적정의 값인 30으로, 배큘로바이러스 배양 시간을 1.5 시간으로 고정함으로써 배큘로바이러스가 숙주 세포인 S2에 대해 미치는 세포독성을 낮출 수 있었다. 또한, 배큘로바이러스 최소 부피는 배양접시에서 사용부피의 2.4％에서 가장 좋은 결과를 보였으며 배큘로바이러스 용액을 10배 농축시킴으로써 이 부피를 맞추기 위해 첨가시키는 새로운 배지의 비율을 높임으로써 결과적으로 배큘로바이러스에 의한 세포독성을 줄일 수 있었다. 이를 통하여 세포 파쇄 및 배양접시 표면에서 탈착되는 것을 막고 높은 생장 상태를 유지해서 감염 효율도 높일 수 있었다. 배큘로바이러스의 감염이 끝난 후의 관여하는 변수들인 감염 후 배양시간은 24시간에서 최대의 녹색형광단백질의 발현을 나타내었다.

• 대한화장품학회:학술대회논문집
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• 대한화장품학회 1996년도 4차 심포지움(Skin Biology Efficacy)
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• pp.52-67
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• 1996

새로운 노화방지 물질로 개발한 3-APPA가 노화에 의해 야기되는 여러 변화들, 특히 세포 증식, 유전자 수준 및 단백질 수준에서의 collagen의 생합성 변화, 면역조직화학염색을 이용한 collagen 생합성의 변화등을 세포배양 및 동물실험을 통하여 측정하였다. MTT assay를 이용한 인체 피부 섬유아세포의 증식 실험에서 3-APPA는 무처치군에 비교해서 최고 2배의 섬유아세포 증식 효능을 나타내었으며, $^3$[H]-proline incorporation 방법을 이용한 단층세포 배양 및 3차원 dermal equivalent 섬유아세포 배양에서 무처치군 및 vitamin C 처리군에 비해 최고 1.5배의 collagen 생합성 증가를 나타내었다. 그러나 type I alpha-procollagen mRNA expression에는 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. H&E 염색을 이용한 hairless mice의 피부에 대한 형태학적 변화 및 type I pM procollagen antibody를 이용한 면역조직화학염색에서, 3-APPA는 collagen 생합성을 증가시키는 것으로 나타났다. 이상의 결과에서 3-APPA는 섬유아세포 배양 및 hairless mouse를 이용한 실험에서 피부 섬유아세포 증식을 촉진시키며 collagen 생합성을 증가시켜 피부노화를 억제 할 수 있는 물질임을 밝혔다.

• 한국생물공학회:학술대회논문집
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• 한국생물공학회 2000년도 춘계학술발표대회
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• pp.65-68
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• 2000

식물배양세포의 항산화기구 이해를 위하여 다양한 식물종에서 유도된 100종의 배양세포주를 대상으로 항산화효소 활성 및 저분자항산화물질을 분석하였다. 배양세포의 SOD와 POD 활성은 식물체에 비해 매우 높았으며, 특히 고구마와 카사바 배양세포는 각각 POD와 SOD 활성이 가장 높아, 항산화효소의 생산 및 항산화기구 해석에 좋은 소재임이 시사되었다. 배양세포의 평균 ascorbate 함량은 식물체에 비해 1/100 수준으로 낮았으며, glutathione 함량은 배양세포가 식물체보다 약 2-3배 높았다. 흥미롭게도 ascorbate와 glutathione의 환원형과 산화형의 비율은 식물종에 따라 큰 차이가 있음이 밝혀졌다. 결론적으로 식물배양세포는 높은 산화적인 스트레스에서 배양되는 것이 생화학적으로 확인되어 항산화물질 생산 및 항산화기구 연구에 좋은 소재임이 시사되었다.

• 한국동물번식학회:학술대회논문집
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• 한국동물번식학회 2003년도 학술발표대회 발표논문초록집
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• pp.88-88
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• 2003

본 연구는 배란후 48시간째 회수된 난소로부터 황체세포를 체외배양 후 progesterone 분비에 대한 LH, IGF-1 및 TGF$\beta$첨가효과에 대해 검토하였다. 축산기술연구소에서 사육중인 돼지(체중 145$\pm$kg) 12두로부터 발정을 유도시켜 배란후 약 48시간째 도축하여 난소를 회수하였다. 회수된 난소로부터 황체를 분리하여 세절한 후 0.25% collagenase용액(0.025mg DNase, 50mM EDTA, 50mM Dithiothreitol)으로 37$^{\circ}C$의 진탕수조에서 30분간 배양하여 황체세포를 분리 회수하였다. 회수된 황체세포는 D-MEM 용액(GIBCO, 10% FCS와 antibiotics 첨가)으로 2회 세정하여 1$\times$$10^{6}$live cell/$m\ell$이 되도록 희석한 후 24 well culture plate(Coming, New Tork 14831)에 분주하여 $CO_2$ 배양기($CO_2$: 5%)에서 12시간 간격으로 배양액을 회수하였으며 48시간까지 배양하였다. 배양액 1$m\ell$당 LH, IGF-I 및 TGF$\beta$1을 단독 혹은 공배양하여 회수된 배양액내의 progesterone 농도를 RIA법으로 분석하였다. 돼지황체세포는 배양후 24시간째에 높은 농도의 progesterone이 측정되었으며 LH를 첨가한 대조구에 비해 유의적으로 높은 progesterone이 측정되었다. 또한 IGF-1 과 TGF$\beta$1을 첨가한 군에서도 높은 농도의 progesterone이 측정되었다 그러나 TGF$\beta$ 혹은 IGF-I 단독으로는 대조구의 결과와 큰 차이가 없었다 따라서 돼지 황체세포에서의 progesterone 분비는 TGF$\beta$ 및 IGF-I 그리고 LH의 황체세포의 progesterone 분비기능을 촉진하는 것으로 나타났다.

• 한국발생생물학회지:발생과생식
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• 제11권2호
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• pp.85-96
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• 2007

중간엽 줄기세포(MSC)를 체외배양할 때 사용하는 소태아혈청 (FBS)의 생물학적 불안전성은 이를 임상적으로 사용하는데 있어 제한점으로 작용한다. 본 연구에서는 소태아혈청 및 인간의 제대혈청을 사용하여 인간의 양막유래 중간엽 줄기세포 (HAM)를 각각 배양한 후, 세포의 성장속도와 유전자 및 단백질의 발현 양상을 비교하였다. 제왕절개 후 얻은 양막으로부터 HAM을 분리하여 10% FBS, 5% HCS 혹은 10% HCS가 각각 첨가된 DMEM 배양액에서 배양하였으며, 초기와 후기 계대의 세포를 얻어 이들의 생물학적 특성을 비교 분석하였다. 역전자 중합효소반응 결과, 혈청의 종류에 상관없이 배양된 세포들은 모두 OCT-4, Rex-1, SCF, FGF-5, BMP-4, nestin, NCAM, GATA-4, HLA-ABC 유전자를 발현하였으며, 이러한 발현은 초기 및 후기 계대의 세포에서도 마찬가지로 나타났다. 세포면역화학 반응 결과, FBS 혹은 HCS를 첨가한 배양액에서 배양된 HAM은 4번째 계대에서 collagen I, II, III, XII, fibronectin, $\alpha$-smooth muscle actin, vimentin, CK18, CD54, FSP, TRA-1-60, SSEA-3, -4, HLA ABC 단백질을 뚜렷하게 발현하였다. 그러나 desmin 단백질은 FBS가 첨가된 배양액에서 배양된 HAM에서만 발현되었고 vWF 단백질은 HCS가 첨가된 배양액에서 배양된 HAM에서만 발현되었다. 결론적으로 유전자와 단백질의 발현양상을 살펴본 결과, HCS가 첨가된 배양액에서 배양된 HAM은 전형적인 인간성체줄기세포의 특징을 나타내고 있으며, FBS가 첨가된 배양액과 비교하여 동등한 성장 촉진 효과를 가지는 것으로 보인다.