• 생명과학회지
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• 제24권3호
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• pp.297-303
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• 2014

대황(Eisenia bicyclis)은 온대 태평양에 서식하며 우리나라에서는 울릉도 일대에서 주로 발견 되는 갈조류이다. 대황은 칼슘 함량이 가장 높고 요오드, 철, 마그네슘뿐만 아니라 많은 미네랄과 비타민을 포함하고 있다. 본 연구에서는 대황 추출물을 이용하여 세포 수준에서 대황의 골 형성에 미치는 영향을 검토하였다. MTT 분석법에 의한 조골세포 증식률에서는 대황 에탄올 추출물 10 ${\mu}g/ml$ 처리하였을 때 128%의 높은 활성을 나타내었다. 반면 열수추출물 첨가군에서는 에탄올 추출물에 비해 유의적으로 낮은 활성을 나타내었고, 첨가 농도가 증가할수록 감소되는 결과를 보였다. 대황 추출물의 농도에 따른 석회화 형성에 미치는 영향을 검토한 결과, 대황의 에탄올 추출물 1~100 ${\mu}g/ml$의 범위에서 시료를 처리 하지 않은 대조군에 비해 높은 골석회화 형성능을 나타내었다. 또한, 적색의 석회화 형성 부위를 현미경을 통해 관찰한 결과, 대황의 에탄올 추출물을 처리 하였을 때, 시료를 처리하지 않은 대조군 보다 붉은 색의 반점이 많이 형성된 것을 확인할 수 있었다. 한편, ALP 활성에서는 에탄올 추출물 50 ${\mu}g/ml$에서 179% 활성을 나타내었다. 파골세포인 RAW 264.7 세포를 이용하여 세포 증식률을 측정한 결과, 대황 열수추출물의 경우 1~200 ${\mu}g/ml$의 모든 농도에서 대조군과 비교하여 유의적으로 감소하여 파골세포의 증식억제 효과가 나타났다. 파골세포의 분화형태를 측정하고자 TRAP 효소 활성을 측정한 결과, 열수 및 에탄올 추출물의 10 ${\mu}g/ml$이상의 농도에서 대조군에 비해 감소하는 경향을 나타내었다. 대황 추출물의 첨가 농도가 증가함에 따라 파골세포의 증식이 감소된 결과와 마찬가지로 파골세포의 분화 지표인자인 TRAP활성 역시 농도가 증가함에 따라 감소함을 알 수 있었다. 이상의 결과, 대황 추출물이 조골세포의 증식, 분화유도와 석회화능을 촉진하고 파골세포의 증식 및 분화를 억제시킨다는 것을 알 수 있었다. 향후 대황 추출물 중의 활성성분들의 규명과 in vivo 연구가 병행된다면 조골세포의 증식과 파골세포의 억제에 관여할 수 있는 기능성 식품의 천연소재로 개발이 가능하리라 사료된다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제38권4호
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• pp.420-427
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• 2010

바이러스 안전성이 보증된 무세포 소 양막 생물창상피복재 제조공정을 확립하고자 하였다. 기질세포를 제거하기 위해 효소(트립신)를 처리하는 공정과 바이러스를 불활화하기 위해 70% 에탄올, 0.05% sodium hypochlorite, 25 kGy 감마선 처리 공정을 포함하는 무세포 소 양막 제조공정을 확립하였다. 무세포 소 양막의 조직학적 분석과 전자현미경 분석 결과 면역거부반응을 일으킬 수 있는 상피층과 기질세포들이 잘 제거되었으며, 소 양막 콜라겐 섬유의 3차원적 구조가 잘 유지되어 있음을 확인하였다. 또한 상처치유효과가 있는 EGF, KGF, FGF와 같은 성장인자를 포함하고 있었다. 바이러스 불활화 효과를 검증하기 위해 국제적 가이드에 따라 4종의 바이러스(BHV, BVDV, BPIV-3, BPV)를 생물학적 지표로 사용하여 소 양막에 각 생물학적 지표를 첨가한 후각 바이러스 불활화 공정을 실시한 다음 각 바이러스를 회수하여 정량한 후 불활화 정도를 비교하였다. 24시간 70% 에탄올 처리 공정에서 BHV, BVDV, BPIV-3, BPV 모두 처리 시간 1시간 안에 검출한계 이하로 완벽하게 불활화되었다. 30분 0.05% sodium hypochlorite 처리 공정에서 BHV, BVDV, BPIV-3 같은 외피 바이러스는 BPV 같은 비-외피 바이러스에 비해 효과적으로 불활화되었다. 25 kGy 감마선 조사에 의해 BHV, BVDV, BPIV-3는 검출한계 이하로 완벽하게 불활화되었고, BPV도 효과적으로 불활화되었다. 3가지 바이러스 불활화 공정에서 BHV, BVDV, BPIV-3, BPV에 대한 log 바이러스 감소인수 합은 각각 ${\geq}$13.30, ${\geq}$14.32, ${\geq}$15.22, ${\geq}$7.57이었다. 이와 같은 결과 본 연구를 통해 확립된 무세포 소 양막 제조공정은 바이러스 안전성을 보증할 수 있는 충분한 바이러스 불활화 능력을 갖고 있는 것으로 판단된다.

• 한국수산과학회지
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• 제30권3호
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• pp.442-450
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• 1997

본 연구는 부경대학교 해양탐사선인 탐양호를 이용하여 1995년 2월 14일에서 17일까지 실시하였다 수온, 염분 및 용존산소를 이용한 T-S diagram 및 $T-O_2$ diagram 으로부터 수괴는 5개의 Type으로 구분되었다. 특히 T-S diagram에서는 잘 구분되지 않았던 Type IV와 Type V는 $T-O_2$ diagram에서 뚜렷이 구분되었다. 하지만 기존 수괴와 명확히 일치하지 않는 것은 본 조사가 동계에 실시되어 표층수온의 감소로 인하여 수괴의 수직혼합이 강하게 일어나서 생긴 현상으로 사료된다. 영양염류의 수괴별 농도분포를 보면, Type I, Type II, Type III은 서로 거의 비슷한 농도를 보였지만 Type IV에서 Type V로 갈수록 증가되었다. 그리고 동일 수괴에서 농도범위가 넓게 나왔는데, 이는 수온약층의 약화로 인하여 발생한 것으로 생각된다. N/P ratio은 모든 water type에서 Redfield ratio 이하로 나타났는데, 이것은 질산염이 식물플랑크톤 성장의 제한인자로 작용하고 있음을 보여주고 있다. chlorophyll $\alpha$의 농도는 $0\~8\;{\mu}g/\ell$의 범위로, Type I에서 최대였고 Type IV와 Type V에서는 거의 검출되지 않았다. 입자성 유기탄소와 유기질소의 농도는 각각 $0.49\~20.03\;{\mu}g-at/\ell$와 $0.09\~5.34\;{\mu}g-at/\ell$ 범위로서, 수심의 증가에 따라 그 농도가 감소하고, 연안에서 외양쪽으로 갈수록 낮아지는 경향이었다. Water type별 농도는 Type I > Type II > Type III > Type IV > Type V의 순서로 수심의 증가에 따라 농도가 증가하는 경향이었다. 즉 이들 입자성 유기물질은 수괴별로 어떤 뚜렷한 경향을 보이지는 않았으며, 수심에 따라서 농도가 변화되는 것으로 생각된다. POC/PON의 원자비는 3.23으로 Redfield ratio 이하로 나타났다. 이것은 POC보다 PON이 더 난분해성이라 침강하는 동안 POC는 분해되지만 수직혼합에 의해 PON은 다시 재부유하기 때문인 것으로 사료된다. POC/chlorophyll $\alpha$의 평균값은 1962로 매우 높은 값을 나타내었으며, non-living detritus가 POC의 대부분을 차지하고 있는 것으로 판단된다.

• 한국수산과학회지
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• 제30권3호
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• pp.319-328
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• 1997

연안해역에서 호기성 광합성 세균 Erythrobacter sp. $S\;\pi-I$I를 분리 및 동정하여 rotifer, Brachionus plicatilis의 먹이로 투여하였을 때 개체수, 체장, 체중 및 지방산 조성과 아미노산 조성을 분석한 결과를 요약하면 아래와 같다. 1. Erythrobacter sp. $S\;\pi-I$ 은 지방산의 함량중 $C_{18:1\omega9}$가 $36.5\%,\;C_{18:1\omega7}$이 $13.3\%\;C_{18:3\omega3}\;8.6\%$ 함유하였고 아미노산은 glutamic acid가 $61.6\;mg\%$, aspartic acid가 $45.2\;mg\%$, alanine이 $43.7\;mg\%$, lysine이 $28.7\;mg\%$ 등 높은 함량을 보였다. 2. Erythrobacter sp. $S\;\pi-I$을 rotifer, Brachionus plicatilis에 투여했을 때 (초기 개체수 5개체/$m\ell$) 개체수는 5일째 9개체/$m\ell$, 9일째 20개체/$m\ell$, 13일째는 43개체/$m\ell$로 증가하였다. 또한 체중은 초기 140ng/개체에서 5일째 280ng/개체, 9일째 560ng/개체, 13일째 610ng/개체로 증가하였으며, 체장은 초기 $150{\pm}7{\mu}m\;(length),\;85{\pm}14{\mu}m\;(width)$에서 5일째 $160{\pm}18{\mu}m\;(length),\;92{\pm}15{\mu}m\;(width)$, 9일째 $170{\pm}17{\mu}m\;(length),\;94{\pm}14{\mu}m\;(width)$, 13일째는 $184{\pm}17{\mu}m\;(length),\;100{\pm}12{\mu}m\;(width)$로 성장하였다. 3. Rotifer 개체당 24시간내에 $10^4\~10^5$개체의 세균을 섭취하였다. 4. Erythrobacter sp. $S\;\pi-I$을 rotifer에 먹이로 투여했을때 EPA, DHA가 증가하였다. 비교실험에 사용한 Chlorella sp. PSB, yeast에 비하여 EPA와 DHA의 함량이 높았다. 특히DBHA는 $S\;\pi-I$과 Chlorella sp.에서만 분석되었으며 $S\;\pi-I$이 높았다. 5. Erythrobacter sp. $S\;\pi-I$과 비교로서 PSB, Chlorella sp., yeast를 rotifer에 먹이로 투여했을 때 $S\;\pi-I$에서 lysine이 가장 높았고, PSB, Chlorellaal sp. 순으로 분석되었다. yeast에서는 검출되지 않았다.

• Journal of Oral Medicine and Pain
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• 제34권4호
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• pp.409-420
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• 2009

2006년 한 해 동안 경북대학교 구강내과에 내원한 하악과두흡수 환자 중에 MRI를 촬영한 42명을 대상으로 임상적 평가와 관절원판의 위치와 과두의 흡수 형태를 조사했으며 그리고 악안면 골격형태를 분석하여 다음과 같은 결론을 얻었다. 1. 임상적 평가 1) 여자가 34명, 남자가 8명으로 여자가 훨씬 많았으며, 이들의 연령분포는 10대가 14명, 20대가 13명, 30대가 7명, 40대가 3명, 50대가 4명 그리고 60대가 1명 이었고 10대와 20대가 대부분을 차지했다. 2) 대부분의 환자가 이상기능활동을 보고했다. 3) 다른 관절의 통증을 호소한 환자는 5명 있었지만 류마티스 관절염과 같은 자가면역질환으로 진단 받은 경우는 없었다. 2. 파노라마와 자기공명영상 소견에 대한 평가 1) 파노라마로 하악과두 골변화 관찰시에 과두의 편평화나 침식, 과두형태의 변형이 초래된 Grade II에 해당된 경우가 대부분이었다. 2) MRI를 촬영해 관절원판의 변위 여부와 과두형태 변화를 관찰 시에 비정복성 관절원판전위소견과 퇴행성 골변화가 동반된 stage IV에 해당된 경우가 대부분이었다. 3. 악안면 골격 형태 평가 1) 여자 환자에서는 SN, SAr, saddle angle의 값이 정상군 보다 유의하게 작은 값을 나타냈고, 남자에서는 SN만이 유의한 작은 값을 보였다. 2) SNA는 정상군과 차이가 없었으며, SNB는 남녀 모두에서 유의하게 작은 값, ANB는 남녀 모두에서 $4.9^{\circ}$로 유의한 큰 값을 보였다. 3) 남녀 모두 SN-GoMe, FMA의 각도가 환자군에서 유의하게 컸으며 FMA는 남자는 평균 $28.9^{\circ}$, 여자는 평균 $31.2^{\circ}$로 여자에서 수직적 성장이 더 크게 나타났다. 4) 총후안면고경(TPFH)은 남녀 모두 유의한 작은 값을 보였다. 5) Ramus height은 남녀 모두 유의하게 작은 값을 보였다. 6) Mandibular body length는 정상군과 차이가 없었다. 이들 결과들로 하악과두흡수는 소인인자로 수직적 악안면 골격형태로 인한 부하의 집중과 이상기능활동 증가로 측두하악 관절에 기계적 과부하가 가해져 과두흡수가 발생하는 것으로 생각하며 이러한 부하는 과두흡수가 발생하기 전에 관절원판을 변위시키고 형태를 변화시키며 이로써 관절은 부하를 받아들이기에 더 취약한 구조가 되어 부하가 가해지면 과두흡수가 촉진되리라 생각한다.

• Maxillofacial Plastic and Reconstructive Surgery
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• 제28권5호
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• pp.375-395
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• 2006

Purpose: Lingual nerve (LN) damage may be caused by either tumor resection or injury such as wisdom tooth extraction, Although autologous nerve graft is sometimes used to repair the damaged nerve, it has the disadvantage of necessity of another operation for nerve harvesting. Moreover, the results of nerve grafting is not satisfactory. The nerve growth factor (NGF) is well-known to play a critical role in peripheral nerve regeneration and its local delivery to the injured nerve has been continuously tried to enhance nerve regeneration. However, its application has limitations like repeated administration due to short half life of 30 minutes and an in vivo delivery model must allow for direct and local delivery. The aim of this study was to construct a well-functioning $rhNGF-{\beta}$ adenovirus for the ultimate development of improved method to promote peripheral nerve regeneration with enhanced and extended secretion of hNGF from the injured nerve by injecting $rhNGF-{\beta}$ gene directly into crush-injured LN in rat model. Materials and Methods: $hNGF-{\beta}$ gene was prepared from fetal brain cDNA library and cloned into E1/E3 deleted adenoviral vector which contains green fluorescence protein (GFP) gene as a reporter. After large scale production and purification of $rhNGF-{\beta}$ adenovirus, transfection efficiency and its expression at various cells (primary cultured Schwann cells, HEK293 cells, Schwann cell lines, NIH3T3 and CRH cells) were evaluated by fluorescent microscopy, RT-PCR, ELISA, immunocytochemistry. Furthermore, the function of rhNGF-beta, which was secreted from various cells infected with $rhNGF-{\beta}$ adenovirus, was evaluated using neuritogenesis of PC-12 cells. For in vivo evaluation of efficacy of $rhNGF-{\beta}$ adenovirus, the LNs of 8-week old rats were exposed and crush-injured with a small hemostat for 10 seconds. After the injury, $rhNGF-{\beta}$ adenovirus($2{\mu}l,\;1.5{\times}10^{11}pfu$) or saline was administered into the crushed site in the experimental (n=24) and the control group (n=24), respectively. Sham operation of another group of rats (n=9) was performed without administration of either saline or adenovirus. The taste recovery and the change of fungiform papilla were studied at 1, 2, 3 and 4 weeks. Each of the 6 animals was tested with different solutions (0.1M NaCl, 0.1M sucrose, 0.01M QHCl, or 0.01M HCl) by two-bottle test paradigm and the number of papilla was counted using SEM picture of tongue dorsum. LN was explored at the same interval as taste study and evaluated electro-physiologically (peak voltage and nerve conduction velocity) and histomorphometrically (axon count, myelin thickness). Results: The recombinant adenovirus vector carrying $rhNGF-{\beta}$ was constructed and confirmed by restriction endonuclease analysis and DNA sequence analysis. GFP expression was observed in 90% of $rhNGF-{\beta}$ adenovirus infected cells compared with uninfected cells. Total mRNA isolated from $rhNGF-{\beta}$ adenovirus infected cells showed strong RT-PCR band, however uninfected or LacZ recombinant adenovirus infected cells did not. NGF quantification by ELISA showed a maximal release of $18865.4{\pm}310.9pg/ml$ NGF at the 4th day and stably continued till 14 days by $rhNGF-{\beta}$ adenovirus infected Schwann cells. PC-12 cells exposed to media with $rhNGF-{\beta}$ adenovirus infected Schwann cell revealed at the same level of neurite-extension as the commercial NGF did. $rhNGF-{\beta}$ adenovirus injected experimental groups in comparison to the control group exhibited different taste preference ratio. Salty, sweet and sour taste preference ratio were significantly different after 2 weeks from the beginning of the experiment, which were similar to the sham group, but not to the control group.

• 한국조경학회지
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• 제38권1호
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• pp.74-83
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• 2010

본 연구는 대천에 위치한 과거 폐광단지의 재개발을 목적으로 환경개선을 통하여 거점관광지를 마련하고 관광소비에 의한 지역 경제 파급효과를 기대하고자 하는 거점형 휴양리조트 단지 개발계획이다. 경제성장과 함께 관광에 대한 국민 의식이 전환되었고, 그와 관련한 관광욕구가 다양한 문화 컨텐츠와 결합하여 위락 공간의 개발과 발전에 영향을 미치게 되었음은 자명한 사실이다. 또한 현대화에 따른 환경문제와 결부된 개발이 주요한 현안으로 떠오르는 시점에서, 관광자원으로서 과거 산업단지의 재발견과 특성화 전략은 생태관광과 더불어 지역자원의 재생이라는 관점에서 개발의 의의를 찾을 수 있다. 그러므로 본 연구의 목적은 폐광지역과 같은 낙후지역의 침체된 지역경제를 활성화시키며 광산개발에 의해 오염된 환경을 개선하기 위한 일환으로 관광개발을 수행하며 이에 적합한 계획에 대한 해법을 찾고자하는 것인데, 연구결과를 요약하면 다음과 같다. 첫째, 지역성을 고려한 리조트 단지의 개발은 환경에 대한 동질감을 조성하는 것이 중요한데, 주변 환경을 포용하며 경관구조상의 이질감을 최소화 하는 것이 요구된다. 이러한 환경적 융합을 통하여 거점 관광자원이 지역에서 요구되는 활동영역으로 자연스럽게 연계되고 이용되어 근린생활권역의 매력인자로 인지되는 효과를 가진다. 그러므로 환경적 융합을 위한 관광자원의 개발은 공간 의 독창성과 함께 관광 및 생활 이용 동선의 차별화를 통하여 공간별 운용 목적을 달성하는 것이 바람직하다. 둘째, 기존 환경자원의 활용은 지역성을 표출하기 위한 기회요소이며, 차별화된 자원을 개발하는 근간을 마련하나, 반면 트렌드에 치중하여 획일적 시설로 변모하는 것을 방지하여야 한다. 따라서 개발계획의 수립 시 기정 기능과 역할에 대한 포괄적인 수용과 변용에 적응하기 위한 방안을 가지는 것이 필요하다. 셋째, 일반적으로 리조트 공간의 위락시설은 단일 규모에 의하여 계획되고 그에 따른 조경시설로 제한되는 문제점을 지니고 있으므로 지역 환경과 융합되며, 개방될 수 있는 특화시설의 도입이 요구된다. 또한 대상지 전체의 주요 경관 자원이 되며 관광 활성화를 위한 핵심시설로서 역할을 담당하도록 하여 관련시설에 대한 파급효과를 전달하여야 한다.

• 한국식품저장유통학회지
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• 제23권5호
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• pp.605-613
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• 2016

세절 도라지의 선도 연장을 위한 연구로 세절 도라지를 마이크로버블을 처리함과 동시에 $55^{\circ}C$ 물에 열수처리하고 저장 기간 연장을 조사하기 위하여 고산소/고이산화탄소 MAP를 처리한 후 10일간 저장하면서 미생물수, 색상 및 관능적 품질 변화를 조사하였다. 마이크로버블-열수처리는 세절 도라지의 일반세균수, 진균류수, 장내세균수, 대장균군수의 감소를 보였으며 특히 장내세균수와 대장균군수는 2 log CFU/g 이상의 감소 효과를 나타냄으로써 미생물 제어 효과가 뚜렷이 나타났다. 저장 중 고산소/고이산화탄소 MAP 포장은 호기성균의 성장은 억제하는 것으로 나타났으나 혐기성균에 속하는 장내세균과 대장균군은 저장기간이 증가할수록 증식하는 것으로 확인되었다. 시판 도라지와 동일한 방법으로서 침지 후 PP 포장한 세절 도라지와 본 연구에서 제안한 OMH 처리 후 고산소/고이산화탄소 MAP 처리한 세절 도라지의 저장 중 표면 색도를 분석한 결과 황색도 b값이 유의적인 변화를 보여주었으며 OMH-MAP 처리한 세절 도라지의 b값은 저장 10일째의 수준이 일반 포장 도라지의 4일째 수준과 유사하였다. 또한 관능적 평가에서, OMH-MAP 처리한 세절 도라지에 대한 관능적 평가에서 향과 종합적 기호도의 변화는 Control 처리구 보다 낮아 품질의 신선도가 기존의 세절 도라지 세척 및 포장방법과 비교하여 3일 이상 연장됨을 확인하였다. 이상의 품질 변화 특징을 종합하여 $5^{\circ}C$에서 저장한 세절 도라지의 기호도와 가장 높은 상관관계를 가지는 인자를 분석한 결과, 향과 대장균군이 가장 높은 상관도를 보였고 OMH-MAP 처리한 세절 도라지의 기호도는 향과 대장균군으로 전체 모형의 94%와 76%를 설명할 수 있었다. 결론적으로 마이크로버블-열수 세척을 하여 세절 도라지를 고산소/고이산화탄소 MAP 포장하는 것이 세절 도라지의 저장유통 중 품질 유지에 효과적임을 확인할 수 있었다.

• Journal of the Korean Academy of Child and Adolescent Psychiatry
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• 제10권2호
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• pp.201-211
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• 1999

본 연구는 범법행위로 인해 검찰에 구속된 청소년들의 특성과 석방 후 6개월간의 재범 여부와 연관된 요인을 알아보기 위해 시행되었다. 검찰청에 구속된 청소년 73명을 대상으로 반구조화된 면담과 범죄기록 검토를 통해 사회인구학적 인자와 범죄관련특성을 알아보았고 다면적 인성검사(MMPI)를 통해 심리적 특성을 평가하였다. 한편, 구속 후 석방된 청소년 65명을 대상으로 6개월 이내에 재범을 행한 군과 행하지 않은 군간의 특성을 비교하였다. 1) 구속된 비행청소년들은 대부분 낮은 사회경제적 수준(77%)의 결손가정(48.9%)에서 성장하였고, 학교에서 탈락된 경우가 많았다(66%). 많은 경우 공범을 동반(77%)하고 있었으며 가장 빈도가 높은 범법행위는 절도(49%)였다. 75%의 구속 청소년이 전과가 있었고 첫 범법행위가 보고된 평균연령은 15.6세였다. 현 범죄내용과 동일한 전과를 갖고 있었던 경우는 78%로 관찰되었다. 2) 재범군은 비재범군에 비해 나이가 어리고 낮은 사회경제적 수준에 속하였으며 결손가정에서 자란 경우가 많았다. MMPI상 나타난 심리적 특성으로 Pa척도가 비재범군에 비해 높게 보고되었다. 범죄관련 특성으로는 재범을 행한 청소년중에서 비재범군에 비해 절도 행위로 인해 구속된 경우와 전과가 있는 경우가 많았으며 최종 전과일로부터 현 범죄발생일까지의 기간이 짧은 경향을 보였다. 상기 결과들은 청소년 비행의 발생과 유지가 청소년 개인 및 가족의 특성, 학교와 사회의 요인들이 상호 작용함으로써 이루어질 가능성을 시사한다. 재범군과 비재범군의 비교를 통해 가정적인 스트레스가 높은 가정에서 자란 청소년과 첫 범죄 발생 연령이 낮고 전과력을 갖고 있는 청소년들이 반복되는 청소년 범죄의 고 위험군임을 알 수 있었으며, 향후 비행 청소년들의 범죄를 예방하기 위해서는 이들에 대한 조기 개입 및 학교/사회적 차원에서의 적응을 돕기 위한 프로그램의 개발이 중요할 것으로 사료된다.

• 대한생식의학회:학술대회논문집
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• 대한불임학회 2001년도 제2차 연수강좌
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• pp.195-205
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• 2001

태반 영양배엽 (trophoblast)은 포유동물의 발생과정 중 가장 먼저 분화되는 세포로서, 자궁환경내에서 배아가 착상, 발생, 및 분화하기 위해서 반드시 필요한 태반을 형성하는 색심적인 세포이다. 영양배엽 세포의 분화과정중의 결함은 배아의 사산이나 임신질환 등의 치명적 결과를 초래한다. 하지만, 영양배엽 세포의 분화를 조절하는 분자생물학적인 메카니즘은 아직 규명되지 않고 있다. 영양배엽 세포의 분화를 조절하는 경로를 규경하기 위한 선결과제는 분화된 영양배엽 세포에서만 발현하는 많은 유전자들이 밝혀져야만 한다. 본 연구팀은 최근에 분화된 영양배엽 세포에서만 발현하는 두 종류의 새로운 유전자들을 찾았다. 한 종류는 homeobox를 보유하고 있는 조절 유전자 Psx이고, 다른 한 종류는 임신호르몬인 태반 프로락틴 라이크 단백질 유전자 PLP-C${\beta}$이다. 본 연구과제의 목표는 이들 유전자의 기능과 조절 메카니즘을 규명함으로써, 영양배엽 세포의 분화를 조절하는 조절경로를 밝히는 것이다. 이를 위하여 다음과 같은 일련의 연구를 수행할 것이다. 1) Psx 유전자가 분화된 영양배엽 세포에서만 발현케 하는 조절 메카니즘을 규명하기 위해 functional assays, in vitro footprinting, gel mobility shift assays, 생쥐형질전화, UV crosslinking, Southwestern blot 등의 방법을 통해 Psx 유전자의 cis-acting 요인과 trans-acting factor를 밝혀 분석한다. 2) 영양배엽 세포의 분화조절 경로를 규명하기 위해 random oligonuclotide library screening, DD-PCR, subtractive screening 등의 방법을 이용하여 Psx 유전자에 의해 조절되는 하부유전자를 밝힌다. 3) Psx 유전자를 knock-out시켜 영양배엽 세포가 발달 및 분화하는데 미치는 역할을 밝힌다. 4) Yeast two-hybrid screening방법을 이용하여 태반 프로락틴 유전자의 수용체를 찾아 이들의 신호전달 기전을 밝힌다. 제1차년 연구결과로서, mouse와 rat으로부터 각각 Psx 유전자의 genomic DNA를 클로닝하여, 유전자 구조를 비교한 결과, mouse Psx (mPsx2)는 4개의 exons으로 이루어져 있는 반면에, rat Psx (Psx3)는 3개의 exons으로 구성되어 있었다. 즉, rPsx3는 mPsx2의 exon1이 없었다. Notrhern blot과 in situ hybridization 분석에 의해 mouse와 rat에서 Psx 유전자가 다르게 발현 조절되는 현상을 밝혔다. 실제로 mPsx2와 rPsx3의 5'-flanking지역을 클로닝하여 염기서열 분석 결과 전혀 homology를 찾을 수 없었다. 또한, 이들 각각 promoter의 activity를 luciferase reporter를 이용하여 조사한 결과 Rcho-1 trophoblast cells에서 각기 다른 activity를 보여 주는 것을 발견하였다. Psx 유전자의 transcription start sites는 Primer extension에 의해 밝혔다. 또한 Psx2 유전자를 knock-out 시키기 위해 targeting vector를 Osdupde1에 제작하였다. 본 과제를 시작할 때 새로운 프로락틴 유전자 하나를 클로닝하여 이 유전자를 PLP-I라고 이름을 붙였다. 이 후 이 유전자 (PLP-I)는 PLP-C${\beta}$라고 이름을 붙이게 되었다. Mouse PLP-C${\beta}$ 유전자의 counterpart를 rat에서 찾아 염기서열을 비교한 결과 mouse와 rat에서 PLP-C${\beta}$유전자의 homology는 약 79% (amino acid level)였다. 본 연구과정을 통해 또 하나의 새로운 PLP-C subfamily member를 mouse로부터 클로닝 하였고, 이 유전자를 PLP-C${\gamma}$라 하였다. PLP-C${\beta}$와 PLP-C${\gamma}$의 발현 유형은 Northern blot과 in 냐셔 hybridization 분석에 의해 태반의 제한된 spongitrophoblast와 trophoblast giant cells에서만 발현하는 것을 밝혔다. 놀랍게도 이들 두 새로운 유전자는 alternative splicing에 의해 두 종류의 isoform이 있음을 밝혔다. PLP family member 유전자로서 splicing에 의한 isoforms을 보여 주는 유전자로는 PLP-C${\beta}$와 PLP-C${\gamma}$가 최초이다. 이들 isoform mRNAs의 발현 유형은 RT-PCR 방법을 이용하여 규명하였다. 또 하나의 새로운 발견은 PLP-C${\beta}$와 PLP-C${\gamma}$가 독특한 유전자 구조를 갖고 있었다. 즉, PLP-C${\beta}$는 exon3의 alternative splicing에 의해 5개 혹은 6개의 exons을 갖는 two isoforms이 생긴다. 반면에 PLP-C${\gamma}$는 exon2가 alternative splcing이 되면서 7개의 exons을 갖거나 6개의 exons을 갖는 isoforms을 만든다. 그리고, PLP-C${\gamma}$의 promoter activity를 trophoblast Rcho-l${\gamma}$ 세포주를 이용하여 PLP-C${\gamma}$ 의 1.5 kb 5'-flanking 지역이 trophoblast-specific promoter activity를 갖고 있음을 밝혔다. PLP-C${\gamma}$ 유전자의 transcription start site는 Primer extension에 의해 밝혔다. 제 1차 년도의 연구결과를 토대로, 2차년에서는 다음단계의 연구를 수행하고자 한다. 즉, 1) mPsx2와 rPsx3의 promoter를 비교분석 함으로서 mouse와 rat에서 Psx 유전자가 다르게 조절되는 메카니즘 규명, 2) Psx와 PLP-C 유전자의 promoter에 있는 cis-acting elements 탐색, 3) Psx2와 Psx3의 단백질을 이용하여 이들이 binding하는 target sequence 규명, 4) 제작한 Psx2 targeting vector를 이용하여 ES cells에서 Psx2 유전자 knock-out, 5) Psx 유전자를 과발현시키는 세포주를 만들고 Psx에 의해 조절되는 유전자 탐색, 6) 새로 밝히 PLP-C members 유전자들의 조절기전을 Rcho-1 세포주를 이용하여 여러 거지 성장인자와 다른 호르몬에 대한 반응을 탐색, 7) Psx와 PLP-C${\gamma}$ 유전자의 chromosomal mapping 등을 밝힐 것이다.