• 한국발생생물학회:학술대회논문집
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• 한국발생생물학회 2007년도 전기 24차 학술대회
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• pp.6-7
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• 2007

• 한국발생생물학회지:발생과생식
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• 제12권1호
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• pp.1-8
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• 2008

배아줄기세포는 다양한 분화 유도 방법을 통해 신경계세포로 분화시킬 수 있을 뿐만 아니라, 보다 더 엄격한 선발조건을 적용함으로써 특정 종류의 신경세포만을 확보할 수도 있게 되었다. 세포사멸연구를 포함한 신경생리학적 연구의 대상으로써 중요한 요건은 이렇게 확보한 배아줄기세포 유래의 신경계세포들이 정상적인 신경생리학적 특성을 갖고 있어야 하며, 동시에 그런 신경생리학적 특성이 체외에서 일정기간 동안 이상 자연적인 세포사멸없이 유지되어야 한다는 것이다. 생쥐 배아줄기세포를 retinoic acid로 처리한 후, astrocytes monolayer 위에서 신경계세포로 분화시키면 장기간 생존이 가능한 다수의 신경계세포를 손쉽게 확보할 수 있을 뿐만 아니라, 면역세포화학적 방법을 통해 신경세포의 생사를 개별세포 수준에서 추적할 수 있다. 배아줄기세포 유래의 신경계세포는 glutamate agonist들에 대해 수용체 특이적 흥분성 신경독성 반응을 보이며, 이 반응은 신경계세포로의 분화가 진행될수록 더욱 뚜렷해지는 양상을 보인다. 신경계세포의 발생분화, 생존에 관여하는 Neurotrophin, GDNF 계열의 신경계 작용 성장인자들의 수용체가 배아줄기세포 유래의 신경계세포에서 발현되고 있으며, 이들에 의해 신경계세포로의 분화과정에서 세포의 생존능 및 신경독성처리에 대한 세포사멸반응이 조절될 수도 있다. 따라서 배아줄기세포 유래의 신경계세포는 신경세포의 생존과 사멸, 그리고 세포손상으로부터의 보호와 같은 신경약리학적 연구를 위한 중요한 특성을 나타내고 있기에 관련 연구를 위한 새로운 연구시스템이 될 수 있는 것이다. 특히 일반적인 신경세포는 유전적 변형이 어려워 다양한 신경약리학적 연구에 많은 제약을 받아 왔으나, 이제 유전자 변형 배아줄기세포로부터 얻은 신경세포를 활용하여 연구할 수 있게 됨으로써, 보다 복합적인 신경약리학적 기초연구도 가능하게 되었다. 특히 최근 인간 배아줄기세포 유래 신경계세포도 유사한 신경독성 반응을 보이고 있음이 확인됨으로써(Schrattenholz & Klemm, 2007), 이제 배아줄기세포는 신경약리학적 기초 연구만이 아닌, 나아가 대량의 약물 스크리닝과 같은 제약산업에도 활용될 수 있는 가능성을 제시하고 있다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제18권3호
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• pp.243-248
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• 2003

1. 생쥐 고환으로부터 얻은 세포를 배양하여 군집을 형성하는 것을 관찰할 수 있었으며, AP, SSEA-1, -3, -4과 Integrin $\alpha$6, $\beta$1 및 Oct4의 발현을 확인하였다. 2. 생쥐 생식줄기세포를 3-5일정도 배양하게 되면, 여러 층으로 이루어진 군집을 이루게 되는데 이는 생쥐 배아줄기세포나 배아생식줄기세포의 형태와 같은 것이었다. 3. 생쥐 생식줄기세포를 체외에서 효과적으로 분리, 배양할 수 있는 조건을 확립하였다.

• 한국발생생물학회지:발생과생식
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• 제12권1호
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• pp.77-86
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• 2008

본 연구에서는 LIF의 첨가가 분리된 할구 유래의 생쥐 배아줄기세포 확립에 미치는 영향을 살펴보았다. 과배란 유도된 BDF1 생쥐로부터 2-세포기의 배아를 회수하여 각기 LIF가 첨가되지 않은 배양액과 1,000, 2,500, 5,000 U/mL의 LIF가 첨가된 배양액에서 포배기 배아까지 배양하였다. 배양된 포배기 배아는 차별화 염색 방법을 이용하여 내세포괴와 영양외배엽의 수를 계수하였다. 2,500 U/mL의 LIF 첨가 시 대조군($21.0{\pm}4.0$ vs. $15.9{\pm}5.0$, P<0.01)과 1,000 U/mL의 LIF를 처리한 군($21.0{\pm}4.0$ vs. $16.6{\pm}4.9$, P<0.05)에 비해서 내세포괴의 수가 유의하게(P<0.05) 증가하였다. 배아줄기세포주 확립 배양액으로는 FBS 대신 20% KSR과 0.01 mg/mL의 ACTH를 사용하였다. 2,500 U/mL의 LIF를 첨가 시 배아줄기세포 확립 효율이 36.7%(11/30)로 가장 높은 효율을 나타내었다. 이러한 배양 조건을 기본으로 하여 2-와 4-세포기 배아의 단일 할구를 분리하여 각기 21.4%(3/14)와 4.0%(1/20)의 효율로 단일 할구 배아줄기세포주를 확립할 수 있었다. 단일 할구로부터 확립된 배아줄기세포주와 이들에서 분화된 배아체는 세포면역학적 염색 방법과 RT-PCR 방법을 통해 그들의 미분화 특성과 삼배엽성 분화 특성을 확인할 수 있었다. 결론적으로 배양액에 LIF를 첨가하여 포배기 배아의 내세포괴 수를 증가시킬 수 있었으며, 분리된 할구의 배아줄기세포주 확립 효율을 향상시킬 수 있었다.

• 대한생식의학회:학술대회논문집
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• 대한불임학회 2001년도 제41차 추계학술대회
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• pp.104-104
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• 2001

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제31권3호
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• pp.215-220
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• 2007

본 연구는 소 배반포의 내부 세포괴로부터 다능성(pluripotency)을 지닌 배아 줄기 세포(embryonic stem cell) 또는 그 유사 세포를 분리 및 배양함으로써 줄기 세포 관련 분야의 기반 기술을 확립하고자 하였다. 소 체외수정란을 $10{\sim}12$일간 체외배양하여 생산된 부화 배반포를 세포분열이 불활성화된 생쥐 태아 섬유아 세포(mouse embryonic fibroblast, MEF) 위에서 배양하여 콜로니 형성을 유도하였으며, 이들로부터 내부 세포괴 유래의 형태를 지닌 것만을 광학현미경 하에서 물리적으로 분리하여 약 $5{\sim}7$일 간격으로 계대배양을 실시하였다. 이러한 방법을 통하여 배아 줄기 유사 세포의 특성을 40계대 이상 유지하는 2개의 세포주를 확립하였다. 각각의 세포주들은 높은 alkaline phosphatase(AP) 활성을 지니고 있었으며, 형광 면역 염색법과 PCR 기법을 사용하여 Oct-4, Nanog, STAT3, SSEA3 및 SSEA4의 발현을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과를 종합하여 볼 때, 본 연구에서는 소 배반포로부터 배아 줄기 세포주를 확립하는 제반 기술이 확립되었다고 판단되며, 향후 관련 분야 연구에 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

• 한국발생생물학회지:발생과생식
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• 제6권1호
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• pp.55-66
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• 2002

배아줄기세포(embryonic stem cell, ESC)는 미분화상태로 지속적인 계대가 가능하며, 정상 핵형과 전 분화능(pluripotency)을 가져 생체내-외에서 분화 유도시 삼배엽성의 모든 세포로 분화 가능하다. ESC를 feeder 세포 없이 부유배양하면 배아체(embryoid body, EB)를 형성하고, 초기 배아 발생과 유사한 분화 양상을 갖는다. ESC의 분화 유도가 초기배아 발생처럼 생식호르몬(GTH: FSH, LH; steroids)의 영향을 받는지는 불명하다. 본 연구는 ESC가 분화과정중 생식호르몬처리에 의해 그들 수용체가 발현되는가를 알아보고자 하였다. 순계혈통 생쥐인 C57BL/6J에서 과배란 유도후 포배를 수획하고, 유사분열적으로 불활성화된 feeder 세포와 공배양하여, 계대배양 하는 중 배아줄기세포주(JHYl)를 확립하였다. JHY1의 alkaline phosphatase 활성과 SSEA-1, 3, 4 발현을 통해 ESC임을 확인하였다. Feeder 세포 없이 ESC를 계대배양 후 호르몬처리(FSH LH E$_2$, P$_4$, T)하에서 5일 동안 부유배양하여 배아체를 형성시키고, 이후 7일 동안 부착배양하여 분화를 유도하였다. GTH와 스테로이드의 수용체 발현 실험에서 ESC에 E$_2$ 처리에 의한 LHR의 발현 증가를 제외한 나머지 호르몬 처리군에서 ESC보다 낮은 생식호르몬의 수용체 발현이 관찰되었다. 생식호르몬을 농도별 수용체 발현 정도는 증감되지 않았다. 미분화 ESC 표지유전자인 Oct-4는 호르몬 처리군에서도 발현되었다. 각 배엽의 표지유전자들(영양세포, handl; 외배엽성, keratin와fgf-5; 중배엽성, enolase와 $\alpha$ -globin; 내배엽성, gata-4와 $\alpha$ -fetoprotein) 등의 발현 양상을 조사한 결과 호르몬 처리후 내배엽성 표지유전자외에는 발현 증가가 관찰되지 않았다. 즉 생식호르몬에 의해 gata-4, $\alpha$-fetoprotein의 발현이 증가되는 것으로 보아 내배엽성 계열로의 분화 유도가 이루어진 것으로 사료된다.

• 한국발생생물학회지:발생과생식
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• 제9권1호
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• pp.33-41
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• 2005

배반포 단계의 난자에서 차이 나게 발현하는 유전자의 발굴을 통해 초기 동물 발생과 분화에 관한 기전을 알 수 있다. 본 연구에서는 새로운 차별발현 역전사효소중합법, 이름하여 에닐링 콘트롤 프라이머(ACP) 방법에 의해 생쥐 배반포에서 차이 나게 발현하는 유전자를 줄기세포와 비교하여 발굴하였다. 총 100개의 ACP를 사용하여 26개의 유전자 단편을 확인하였고, BLAST 탐색에 의해 유전자 정보 은행(GeneBank/EMBL)에 저장된 유전자와 동일하다는 것을 알았다. 이들 유전자 중에 15개의 유전자를 선별하여 역전사효소중합법에 의해 조사한 결과, 배반포에서 차이 나게 발현함을 재확인하였다. 이러한 결과는 ACP 방법이 특정 발달 단계에 있는 소량의 배아 샘플로부터 전사되는 유전자를 확인하는데 실용적으로 사용될 수 있다는 것을 보여주고 있다.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제33권4호
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• pp.265-272
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• 2006

목 적: 본 연구는 생쥐 포배기 배아로부터 내세포괴를 분리하는 방법과 지지세포의 종류와 mitomycin C 처리 시간이 내세포괴 colony 형성률에 미치는 영향을 관찰하기 위해 시행되었다. 연구방법: 일반적인 면역절제술, 주사바늘을 이용한 부분 영양막세포 절개법, 포배기 배아 공배양법으로 내세포괴를 분리한 후, 상업적으로 구입이 가능한 STO 또는 직접 제조한 생쥐 배아섬유아세포 (pMEF)를 지지세포로 이용하여 배양하였다. 또한, mitomycin C를 1, 2, 3시간 동안 처리한 각각의 지지세포에서 7일 동안 배양한 후, 내세포괴 colony 형성률을 살펴보았다. 결 과: STO 지지세포에서는 부분 영양막세포 절개법을 사용한 경우 (52%)가 면역절제술 (12%)이나 포배기 배아 공배양법 (16%)을 사용한 경우보다 내세포괴 colony 형성률이 유의하게 높았다 (p<0.05). pMEF 지지세포에서의 형성률은 부분 영양막세포 절개법을 사용한 경우 (88%)와 포배기 배아 공배양법 (82%)을 사용한 경우가 면역절제술 (16%)을 사용한 경우보다 높았다 (p<0.05). STO와 pMEF 모두에서, 2시간 mitomycin C 처리군 (52%, 88%)이 1시간 처리군 (9%, 42%)과 3시간 처리군 (18%, 76%)보다 높은 내세포괴 colony 형성률을 보여주었다 (p<0.05). 결 론: 이상의 결과는 부분 영양막세포 절개법이 생쥐 포배기 배아로부터 내세포괴를 분리하는 가장 효과적인 방법이며, 가장 적절한 mitomycin C 처리 시간은 2시간이라는 것을 보여준다. 그러나 이와 같은 부분 영양막세포 절개법의 효용성을 보다 명확하게 확인하기 위해서는 분리한 내세포괴를 계대배양하여 줄기세포주로서의 특성을 확인하는 실험이 추가적으로 필요할 것으로 생각된다.

• 한국발생생물학회지:발생과생식
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• 제14권4호
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• pp.215-223
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• 2010

배아줄기세포를 이용한 형질전환동물의 제조는 유전자의 기능 연구에 필수적이다. 특히 유전자 파괴 생쥐는 유전자의 기능 연구뿐만 아니라 사람 질병 연구에 중요한 모델이 되어 왔다. 유전자 적중법(gene targeting)과 유전자 함정법(gene trapping)은 ES 세포에서 녹아웃(knockout) 생쥐를 제조하는 대표적인 방법이다. 20여 년 전 유전자 적중법과 함정법이 최초로 개발된 이후에 이 기술은 많은 변화를 거쳤다. 특히 상동재조합에 기초한 전통적 유전자 적중법은 대량 제조기반의 조건부 유전자 적중법의 개발로 이어졌고, 유전자 적중법 및 유전자 함정법의 장점 요소의 조합은 유전자를 파괴하는 범위를 넓혔고, 유전자 적중을 더욱 효율적으로 만들었다. 이런 기술은 특정 유전자를 표적으로 하는 다양한 종류의 돌연변이 형질전환동물을 제조할 수 있게 하여 포스트게놈 시대에 요구되는 전체 유전체의 기능 연구를 더욱 효과적으로 진행시켜 줄 것이다.