다기능성 농업용 미생물 제제를 개발하기 위하여 생물방제 및 생물비료 활성을 가지는 미생물을 탐색하였다. 본 연구실에서 분리 및 동정된 균주가운데 Pantoea agglomerans 및 Bacillus megaterium을 실험군주로 선정하였으며, 경남 밀양에 위치하는 양계장 부근 부엽토로부터 새로운 다목적 세균 MF12를 분리하였다. 형태학적, 배양적, 생화학적 특성 및 16S rDNA 염기서열을 분석한 결과, MF12는 Bacillus pumilis로 동정되었다. 이 균주들의 불용성 인산 가용능, IAA 및 siderophore 생성능, ammonification ability, 식물병원성 진균 세포성분 분해효소 생성능 및 항진균능을 조사하였다. P. agglomerans는 고체배지에서 불용성 인산을 가용화할 수 없었으나 액체배지에서는 가용성 인산을 생성하였다. 상기 모든 균주들은 배양시간에 따라 $3{\sim}639{\mu}g/ml$의 IAA를 생성하였으며, P. agglomerans만이 siderophore를 생성하였다. 이 균주는 pectinase와 lipase를 생성하였다. B. megaterium은 amylase, pretense 및 lipase를 생성한 반면 B. pumilisr는 protease와 lipase를 생성하였다. P. agglomerans는 Fusarium oxysporum과 Colletotrichum gloeosporioides의 생육을 억제하였으며, B. pumilis는 Botrytis cinerea, Sclerotinia sclerotiorum 및 Phythium ultimum의 생육을 억제하였다.
다케다약품공업주식회사의 "액토스정$^{(R)}$ 30 mg"을 대조약으로 하고 보령제약주식회사의 "염산피오글리타존정 30 mg"을 시험약으로 하여, $2{\times}2$ 교차시험법에 따라 지원자 28 명을 대상으로 생물학적동등성시험을 실시하였다. 이를 위하여 피오글리타존 30 mg을 각 지원자에게 경구 투여한 후, 0-36 시간 동안 채혈한 혈장 시료를 확보하였다. 혈장 중 피오글리타존을 분석하기 위하여, LC-MS/MS 분석법을 확립하였으며 분석결과의 신뢰성을 높이기 위하여 분석법 검증을 수행하였다. 그 결과, 5-2000 ng/mL의 농도범위에서 우수한 직선성을 나타내었으며, 생물학적동등성시험에 이용될 수 있는 충분한 감도와 특이성, 정밀성 및 정확성을 확인하였다. 각 피험자들의 혈중 약물농도 데이터로부터 구한 혈중약물농도-시간곡선하면적($AUC_t$)과 최고혈중농도($C_{max}$) 등의 약물속도론적 파라미터에 대해 통계학적으로 고찰한 결과, 판정기준을 만족 시켰으며, 따라서 두 제제는 생물학적으로 동등한 것으로 평가하였다.
본 연구의 목적은 경기도 의왕시 소재 백운산 주변의 유류로 인한 토양오염도를 조사하고 복원에 필요한 기초자료를 마련하는 데 있다. 토양의 유류오염도를 측정하기 위해 BTEX와 TPH를 분석하였으며, 토양의 물리적 특성은 pH, 유기물함량, 함수율, 투수계수, 비중, 공극율을 측정하였다. BTEX는 GC-FID와 Purge & Trap을 사용하여 분석하였으며, TPH는 가속용매추출기(Accelerated Solvent Extractor)를 이용하여 토양시료를 전처리 하였으며 GC-FID로 분석하였다. 분석 결과 TPH의 경우 최고 24,773mg/kg, BTEX는 101.7mg/kg가 검출되어 TPH의 토양오염대책기준인 5,000mg/kg, BTEX의 토양오염우려기준인 80mg/kg을 많은 지점에서 초과하고 있었다. 따라서 백운산 지역은 오염지역의 토양복원이 반드시 필요함을 알 수 있다. 한편 연구대상 지역 중 오염도가 높은 지점에서 본 연구실에서 개발한 미생물제제를 사용하여 5주 동안 오염도의 회복정도를 조사하였다. 실험결과 3주만에 대부분의 오염물질이 분해되었고, 5주 후에 초기농도의 95%의 TPH가 분해됨을 확인할 수 있었다. 따라서 백운산 토양오염 현장에는 본 연구팀이 사용한 미생물제제를 이용하여 복원하는 것이 매우 효과적인 것으로 사료된다.
포자형성균은 사람과 동물용의 프로바이오틱 제제로서 사용되어져 왔다. 포자형성균의 낮은 pH에 대한 안정성과 위내 생육저해 환경에 생존능은 프로바이오틱 제제로서 매력적이다. 본 연구는, 한국 전통 대두 발효 식품의 종균인 BCNU 9028균주를 메주로부터 분리하였다. 생리학적, 생화학적 특성과 16S 리보좀 DNA 염기서열 분석 결과 BCNU 9028균주는 $Bacillus$에 속하는 것을 확인하였다. $Bacillus$ sp. BCNU 9028은 pH 2.5에서 92%의 생존률을 보였으며, 0.3% 담즙산에서도 저항성을 나타냈다. 그리고, 식품 병원성균과의 응집정도와 자가결합능에 의해 $Bacillus$ sp. BCNU 9028는 $Listeria$$monocytogenes$, $S.$$aureus$ 및 $E.$$coli$와 같은 식품 병원성균의 생물막형성과 부착을 저해할 수 있는 것을 확인하였다. BCNU 9028의 소수성 특성(63.3%)은 장관내 부착능이 우수할 것으로 나타났다. 특히, $Bacillus$ sp. BCNU 9028 균주는 그람양성 및 그람음성 병원성균 모두에 항균력을 갖는 것을 확인하였다. 이상의 결과로 $Bacillus$ sp. BCNU 9028균주가 프로바이오틱스로서 이용가능성이 있음을 제시하였다.
(주)녹십자는 1986년 "훽나인"을 B형 혈우병 치료제로 제조품목허가를 받아 B형 혈우병치료제 공급을 시작하였다. 또한 1991년 New York Blood Center에서 selvent/detergent 바이러스 불활화 방법을 도입하여 제조공정에 추가한 후 혈액유래 바이러스로부터 안전한 제품을 생산하여 왔다. 하지만 이 제품은 혈액응고 제2인자, 제7인자, 제10인자가 함유된 제9인자 복합체로, 정맥 혈전증과 파종성 혈관내응고병증 같은 혈전형성 부작용이 일어날 가능성이 있어, 훽나인보다 순도, 유효성, 바이러스 안전성이 우수한 제품의 개발이 필요하였다. 이를 위해 고순도 제9인자 제제인 "GreenNine VF" 제조공정을 개발하였다. GreenNine VF 제조공정은 기존의 훽나인 생산 공정에 heparin 친화성 크로마토그래피와 양이온 크로마토그래피가 추가된 공정으로, 바이러스 안전성을 증진시키기 위한 바이러스 필터 공정도 포함하고 있다. 이러한 공정에 의해서 산업적 규모로 생산된 GreenNine VF는 훽나인에 비해 순도와 바이러스 안전성이 월등히 높은 것으로 확인되었다. 또한 고순도 혈액응고 제9인자 제제인 Mononine, Octanyne, Berinin HS, Immunine STIM plus 600보다 순도가 더 높았다. Cryo-poor plasma 1,600 L를 원료로 사용했을 때 1 batch 당 250IU 분병제품 2,400병 이상, 500 IU 분병제품 1,200병 이상을 생산할 수 있었다.
시판 살균제의 실제 적용 시 감균 효과를 조사하기 위해 양상추를 신선편의 가공하고, 세척 시 살균제로 이들을 적용한 후 저장 중 pH 및 일반세균, 효모, 곰팡이, 대장균, 대장균군의 변화를 조사하였다. 살균제 스크리닝 결과, 0.02%의 염소수 처리 시 3.1 log 감소를, 1% 농도에서 acetic acid는 2.4 log, ascorbic acid는 1.3, citric acid는 0.7 log의 감균 효과를 나타내었다. 시판 중인 살균제 대부분에서 2 log 의 감균 효과를 나타내어, 이들을 신선편의 양상추에 적용하고 $10^{\circ}C$에 저장하면서 양상추의 pH 변화 및 미생물의 변화를 조사하였다. 저장 초기 양상추의 pH는 살균제 용액의 pH에 따라 변화하고 있었는데, 용액의 pH가 가장 높은 칼슘제제(12.0)가 6.1, 가장 낮은 Formula 4(4%, pH 1.7)에서 가장 낮은 pH(4.7)로 나타났으며 저장일 경과에 따라 pH는 유의적으로 증가하고 있었다. 대장균군을 제외하고 0.02%의 염소수가 가장 높은 수준의 미생물 저해 효과를 나타내었다. 반면 Formula 4, Fresh produce wash 모두 3% 이상에서 미생물 저해 효과가 나타나고 있었다. 특히 Formula 4는 대장균 및 대장균군 저해 효과가 매우 좋았다. 모든 처리구에서 곰팡이는 검출되지 않았으며 효모의 경우 염소수와 Fresh produce wash 및 알코올 살균제 중 키토콜과 칼슘 제제 처리구가 효과적으로 저해하고 있었다. 시판 살균제에 따라 미생물 저해 효과는 다르게 나타나고 있었으나 염소수와 비교했을 때 초기 미생물 저해 효과는 존재하고 있기 때문에 부가적인 hurdle technology 및 공정관리를 통해 저장 중 항미생물 효과를 지속시킨다면 실제 적용이 가능할 것으로 판단된다.
포유동물과 마찬가지로 암탉은 태어날 병아리에게 계란을 통해서 면역항체를 이행시켜 해로운 병원균의 침입으로부터 병아리를 보호해준다 . 즉 어미 닭의 혈청으로부터 특정항체가 난황에 이행되고 이 면역항체를 IgY 라고 부르며 이것이 발육중인 태아와 갓 부화한 병아리의 면역항체가 되는 것이다. 상대적으로 면역능력이 낮은 갓 부화한 병아리는 병원균에 대한 방어능력을 계란을 통해 어미로부터 받은 항체를 통해 얻는다. 그 결과, 난황 내에는 많은 양의 IgY를 보유하게 되고 이 면역물질이 있으므로 말미암아 계란 내에 들어와 있는 병원균이냐 외부에서 들어오려는 병원균을 무력화시켜 아무 탈없이 병아리가 부화하게 된다 . 이처럼 산란계에 각종 병원균을 접종함으로서 면역항체 IgY 가 많이 들어 있는 계란을 생산할 수 있다. 난황 1 개에는 136~340 mg 의 IgY 가 들어있고 이는 난황 $m\ell$ 당 8~20 mg의 IgY 가 함유되어 있는 셈이다. 그리고 산란계 한 마리로부터 일년에 30 g 이상의 IgY 를 얻을 수 있다. 산란계에 항원을 접종하여 난황으로부터 IgY 를 수확하면 IgY g 당 10$ 도 안 되는 낮은 비용으로 항체를 얻을 수 있게 된다. 이에 비하여 포유동물의 경우 19 의 IgG 를 얻는데 20,000$가 소요된다. 이와 같은 IgY 제조기술을 의학, 공중 보건, 수의학, 식품안전과 같은 분야에 응용을 함으로써 잠재력이 높은 새로운 시장을 여는 장이 될 것이다. IgY 기술을 더욱 폭넓게 활용할 수 있는 분야들로는 생물제제나 의학진단기구, 생리적 기능성 물질이나 기능성식품의 개발, 질병예방을 위한 경구투여제 그리고 질병감염을 막는 특정 병원균성 항미생물 제제와 같은 것들을 들 수 있다. 이 논문에서 우리가 강조하고자 하는 것은 IgY 가 함유된 계란을 생산하고 섭취하였을 때 특정항체들의 결합을 통해 병원성 미생물의 성장이나 군체를 형성하는 것을 무력화시켜 결과적으로 병원균을 감소시키거나 억제시킨다는 점이다. 오늘날 약물에 내성을 지닌 박테리아의 출현으로 질병감염을 막는데 항생제의 사용효과가 점차 감소하고 있기 때문에 이러한 항생제를 대체할 수 있는 방안으로 계란항체를 이용할 수 있다.
2012년 5월에서 10월 사이에 우리나라 넙치 육상 양식장을 대상으로 폐사 피해 및 수산생물용 의약품 사용량을 전수 탐문조사와 표본 정밀조사의 형태로 진행하였다. 조사는 해당 양식장과 거래하고 있거나 관계를 맺고 있는 전국의 수산질병관리사 조사요원의 직접 현장 방문을 통한 면접과 표준 매뉴얼을 통한 진단을 통하여 실시하였다. 전국 565개의 넙치 육상 양식장을 대상으로 한 탐문 전수조사에서 해당기간 동안의 피해율은 27.18%로 집계되었고, 표본 60개소의 총 피해율은 25.50%로 나타났다. 표본조사의 피해율 조사가 $95{\pm}10%$ 이내의 신뢰성이 있는 것으로 확인되었다. 피해원인 별로는 탐문조사 및 표본조사에서 모두 스쿠티카병, 자연감모, 연쇄구균병, VHS, 선별도태, 비브리오병, 활주세균병 등의 원인이 높은 피해율을 보이는 것으로 집계되었다. 피해 중량과 피해금액을 봤을 때는 고체중의 넙치에서 발생한 비감염성 원인에 의한 폐사피해 및 연쇄구균증이 매우 높은 피해율을 보여주었다. 표본조사에서 수산생물용의약품의 사용량을 조사한 결과, 가장 많이 사용되었던 의약품은 스쿠티카병 치료목적의 formalin 약욕제제인 것으로 나타났고, 항균 항생물질로는 연쇄구균병의 치료목적으로 사용되는 amoxicillin, florfenicol과 광범위 항균작용을 기대하는 oxytetracycline, neomycin 등의 사용량이 높았다.
작물생육촉진과 병 방제 기능을 지닌 Bacillus velezensis GH1-13 균주의 대량배양을 위한 최적배지(glucose 0.5%, soy bean flour 0.8%, NaCl 0.15%, $K_2HPO_4$ 0.25%, $Na_2CO_3$ 0.05%, $MgSO_4.7H_2$ 0.1%) 조성을 확립하였다. 최적배지(MMS)를 이용하여 500 L 대용량 발효기에서 배양한 결과 총 균체수 $7.5{\times}10^9cells/mL$, $6.8{\times}10^9\;endospore\;cells/mL$ 및 90% 내생포자 형성률 등 안정된 대량생산을 확인하였다. 최적배지에서 배양한 GH1-13 균체와 배양 상층액의 경우 Colletotrichum gloeosporioides를 포함한 4종의 식물병원성 곰팡이에 대한 항진균활성을 보였다. 또한 식물생육촉진 호르몬의 일종인 IAA 생산량을 비교한 결과, 최적배지에서 배양한 경우 상업용 배지(TSB, R2A)에 비해 2.5~13배 이상 높은 생산성을 보였다. 더불어, 최적배지에 0.3% tryptophan을 첨가하여 배양했을 경우 28.50 mg/L의 IAA 최대 생산량을 보였으며, 이는 tryptophan을 첨가하지 않고 배양한 경우보다 약 4배 높은 수준이었다. 이러한 결과로 볼 때 본 연구에 사용된 B. velezensis GH1-13 균주는 작물생육촉진 및 곰팡이 병 방제 측면의 복합기능 생물학적 제제로서 매우 유용할 것으로 판단된다.
인삼은 수천 년 동안 동아시아에서 재배된 중요한 약용 식물이다. 일반적으로 같은 포장에서 4-6년 동안 재배되기 때문에 다양한 병원균에 노출된다. 그 중 인삼뿌리썩음병이 가장 큰 피해를 주는 주요 원인이다. 본 연구에서는 건강한 인삼에서 내생균을 분리하고, 인삼뿌리썩음병원균에 대해 길항작용을 갖는 내생균을 선발하였다. 분리된 17개 균주 중, 3개 균주가 인삼뿌리썩음병원균에 길항작용을 나타냈으며 인삼뿌리썩음병균이 생산하는 곰팡이독소인 라디시콜에 내성을 보였다. 우수한 길항효과와 라디시콜 저항성을 갖는 Bacillus velezensis CH-15를 선발하여 추가 실험을 수행하였다. 인삼 뿌리에 CH-15를 접종하면 병원균의 균사 생장을 억제할 뿐만 아니라 질병의 진행도 억제하였다. CH-15는 또한 바실로마이신 D, 이투린 A, 바실리신, 서팩틴 생합성 유전자를 갖고 있었다. 또한 CH-15 배양여액은 병원균 생장과 분생포자 발아를 억제하였다. 본 연구는 내생균 CH-15가 인삼뿌리썩음병 병원체에 대해 길항작용을 하고 인삼뿌리썩음병의 진행을 억제함을 보여주었으며 이 균주가 인삼뿌리썩음병을 억제하는 미생물 제제가 될 수 있을 것으로 기대한다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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