효소는 환경과 조건에 따라 상이한 활성도를 나타내며, 전기 자극에 의하여 비활성화된 알콜 산화효소는 당, 계면활성제, 히드로젤 들에 의하여 안정화되었다. 이들 효소는 trehalose, TritonX-100, Brij에서 보다 안정하였으며, 이들 효소의 안정도는 Hansenula sp., P. pastoris, C. boidinii에서 분리된 효소가 순서적으로 보다 안정하였다. 전기자극하에서 효소의 안정화에 대한 이 연구는 생물공학, 단백질공학, 의료공학 분야에 널리 이용될 수 있으리라 사료된다.
과요오드산-산화가용성전분은 Aspergillus awamori a-glucosidase의 pH 안정성을 증가시켰다. 40℃에서 두시간 항온시킨 결과, 과요오드산-산화가용성전분이 존재하지 않을 때의 효소는 pH 3∼7, 존재할 때의 효소는 pH 3∼9, 50℃에서 과요오드산-산화가용성전분이 존재하지 않을 때의 효소는 pH 3∼6, 존재할 때의 효소는 pH 3∼8 범위에서 안정하였다. 60℃에서는 과요오드산-산화가용성전분의 존재여부에 관계없이 효소는 pH 3∼6 범위에서 안정하였으나 pH 5와 6에서 과요오드산-산화가용성전분이 존재하면 효소의 잔존활성은 존재하지 않을 때보다 20% 더 높았다. 과요오드산으로 변형한 효소는 pH 9에서 활성이 70% 남았으나 변형하지 않은 효소는 남지 않아서 변형으로 안정성이 증가된 것으로 나타났다. 변형효소는 50℃에서 12%, 80℃에서 7%의 활성이 남았으나 변형시키지 않은 효소는 50℃에서 8%가 남고, 70℃이상에서는 남지 않았다. HPLC 분석 결과 pH 2 이하 및 9 이상에서는 효소의 서브유니트가 분리되고, 변성 중합되었다. 변형하지 않은 효소는 산성과 알칼리성 pH에서 변성되어 단백질의 구조가 무너졌지만 과요오드산-산화가용성전분이 존재하면 변성되지 않았다.
몰리브덴 보조인자 형성을 방해하는 텅스텐산 나트륨이 옥수수 뿌리에서 알데히드 산화효소의 활성과 생장에 미치는 영향을 조사하였다. 다른 식물에서 보고된 바와 같이 옥수수 뿌리에서도 텅스텐산 나트륨은 그 농도가 증가됨에 따라 알데히드 산화효소의 활성을 억제하였는데, 억제 활성은 식물체에 직접 처리한 경우에만 나타나고 추출된 효소에 처리하였을 때에는 효과가 없었다. 텅스텐산은 알데히드 산화효소의 활성화를 억제하는 물질임에도 불구하고, Western분석에 의하면 알데히드 산화효소 단백질의 함량을 감소시키는 것으로 나타나 반응산물이 효소함량을 증가시키는 양성 되먹임 조절관계를 나타내었다. 텅스텐산 나트륨은 효소활성을 억제하는 농도에서 옥수수 원뿌리의 생장과 곁뿌리발생을 억제하였지만 굴중성 반응에는 영향이 없었다. 전자의 두 반응은 옥신 절대함량에 의존하고 후자는 상대량에 의존하므로 텅스텐산 나트륨에 의한 옥신 함량 변화로 관찰된 결과들의 설명이 가능할 것으로 사료되었다. 그러나 뿌리의free IAA의 함량 변화는 검출되지 않았다. 옥신 함량 조절에는 강력한 항상성 기작이 관여하므로 IAA conjugate분해와 nitrilase에 의한 생합성 증가 등 결과 설명에 적용 가능한 내용들을 논의하였다.
과산화 효소와 포도당 산화효소의 효소반응을 이용하여 혈액 중 당을 측정하는 혈당 측정 용 스트립을 개발하였다. 멤브레인에 포도당 산화효소와 과산화 효소, 색원체를 건조처리하면 혈당이 멤브레인에 처리된 포도당 산화효소와 즉각 반응하여 과산화 수소를 발생하고 발생된 과산화 수소가 과산화 효소와 반응하여 착색물을 형성한다. 제조된 스트립은 혈액과 접촉하면 반응시간 2∼3분 이내에 0∼800mg/d1의 혈당에 대하여 농도에 따라 연 녹, 청 녹, 짙은 청색을 나타내며 이때 민감도는 40 mg/dl이었다. 육안용 혈당 스트립을 이용하여 정상을 포함한 당뇨 환자의 혈당 농도를 측정한 결과 Ames사와 BM사에서 시판하고 있는 제품과 유사한 결과를 얻을 수 있었다. 본 연구에서 개발된 스트립이 자동 분석기기의 재료로 활용될 수 있는지 여부를 알아보기 위하여 분광 비색계로 발색 반응의 최적 파장을 분석하고 최적 파장에서 각 혈당 농도별 반사 밀도를 측정하여 검정선을 얻었다. 이 검정선에 의해 임상 혈청시료의 혈당 농도를 측정한 결과 일본의 Kyoto Daiichi사의 혈액 분석시스템과 유사한 결과를 얻었다. 이로서 본 연구에서 개발한 혈당 스트립을 이용하여 혈액 중 혈당량을 육안으로 측정할 수 있음은 물론 자동 분석기기의 기본 시료로 이용될 수 있음을 확인할 수 있었다.
We synthesized polypyrrole (PPy) nanotubules by oxidative polymerization of the pyrrole monomer within the pores of a polycarbonate template. The electrochemical behavior was investigated using cyclic voltammetry. The redox potential was about -0.5 V vs. Ag/AgCl reference electrode, while the potential was about 0 V for PPy film. It is considered as the backbone grows according to the pore wall. Therefore, it is possible to be arranged regularly. That leads to improvement in the electron hopping. By electrochemical doping of glucose oxidase (GOx) on PPy nanotubules, an enzyme electrode has been fabricated. The kinetic parameter of biochemical reaction with glucose was evaluated. The formal Michaelis constant and maximum current calculated by computer were about 11.4 mmol $dm^3$ and 170.85 A respectively. Obviously, an affinity for the substrate and current response of the PPy nanotubules enzyme electrode are rather good, comparing with that of PPy film.
Thiobacillus thioparus TK-m에서 메칠머캅탄(MM) 가스를 기질로 메칠머캅탄 산화효소(MMO)를 유도할 수 있었으며 DEAE-Sephacel과 Superose 12 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 이때 얻어진 각 효소의 비활성은 각각 374과 1240.8 units/mg-protein이었으며 효소의 최적 온도는 $55\;^{circ}C$였다. 상기 정제된 효소액은 SDS-PAGE상에서 66.1 kDa의 분자량을 가지며 20 mM $(NH_4)_2SO_4$ 혹은 200 mM NaCl의 첨가에 대해 최대 활성을 보였다. 글리세린, 에탄올, 아세톤의 첨가에 대해 효소활성은 부분적으로 불활성화되었으며 메탄올에 대해서는 저해받지 않았다. Purpald 발색법을 이용한 흡광도의 변화는 구강내 존재하는 MM 가스로부터 생성될 수 있는 수 십 nmol의 범위의 포름알데하이드에 대해 눈으로 인지가능한 발색시스템에 사용할 수 있음을 확인하였다.
생물은 자기 복제를 통한 생장이나 생명유지를 위해 에너지를 필요로 한다. 화학영양생물은 화학에너지를 발효 혹은 호흡을 통해 생물학적 에너지로 전환시키며, 광영양생물은 광합성 작용을 통해 광에너지를 이용한다. 발효, 호흡, 광합성은 모두 산화-환원 반응을 통해 이루어진다. 생물의 모든 에너지 전환반응은 산화-환원 반응, 즉 전자의 흐름으로 이루어지며 생명현상이 에너지를 필요로 하기 때문에 생명현상은 전자의 흐름으로 이루어진다고 할 수 있다. 모든 생물이 에너지 전환 반응에 산화-환원 반응을 이용한다는 말은 생물이 많은 종류의 산화-환원 효소를 보유하고 있다는 뜻이며, 실제 많은 종류의 산화-환원 효소가 발견되고 연구되었다.
본 연구에서는 전극의 전기 전도도 증대와 젖산 산화반응의 부산물인 과산화수소 생성 완화가 젖산 산화효소 전극 성능에 미치는 영향을 조사하였다. 유연성 있는 탄소종이 표면을 단일벽 탄소나노튜브로 개질하여 전극의 전기 전도도를 향상시켰다. 카탈라아제를 도입하여 젖산 산화반응에서 발생하는 과산화수소를 제거하였다. 젖산 산화효소와 카탈라아제가 동시에 고정화된 탄소종이 전극은 젖산 산화효소만 고정화된 탄소종이 전극보다 1.7배 많은 전류를 생성하였다. 단일벽 탄소나노튜브로 개질된 탄소종이 표면에 젖산 산화효소와 카탈라아제가 동시에 고정화된 전극은 171 µA의 전류를 생산하였는데, 이는 탄소종이 표면에 젖산 산화효소만 고정화된 전극이 생산하는 전류보다 2배 높은 값이다. 최적화된 전극은 젖산 농도가 20 mM까지 선형반응을 보여 센서용 전극으로 사용 가능함을 확인하였다.
재조합 효모를 이용한 포도당산화효소의 대량생산 에 관한 기초연구를 실시하였다. 분비신호를 포함한 포도당산화효소 유전자는 Aspergillus niger로부터 polymerase chain reaction을 이용하여 클로닝한후 G GALl과 GALlO promoter를 이용하여 s. cerevi siae strain 2805에서 말현시킨 결과 GALl promoter를 사용한 형질전환체(yGOD1-l)에서 높은 효율 의 효소생성을 나타냈다. 플라스크 배양 결과 1% galactose를 포함한 YEP 배 지 에셔 최고 6 IU/mL 의 포도당산화효소를 생산하였으며 재조합 포도당산 화효소의 세포내 위치를 비교한 결과 A. niger와는 달리 발현된 효소가 80% 이상 배지로 분비됨을 확인하였다. 재조합 포도당산화효소의 열 안정성을 측정한 결과 표준품과 비교하여 $50^{\circ}C$까지 큰 차이를 보이지 않고 높은 활성을 유지하는 것으로 확인되었다.
자동 산화된 지방질이 효소 활성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 각기 다른 수분활성도하에서 산화시킨 모델 시료에 대하여 산화 정도를 측정하고 분리된 단백질의 용해도 및 효소 활성도를 분석한 결과 산화가 진행되면서 과산화물가와 thiobarbituric acid(TBA)가는 증가한 반면 단백질의 용해도는 감소되고 호소 활성은 수분활성도가 높을수록 크게 감소되었다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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