배아줄기 세포는 신경퇴행성 질환의 치료 수단으로 많은 가능성을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 중풍 동물모델에서 수중미로 학습을 이용하여 중풍 치료제로서 인간배아줄기 세포의 인지 및 기억력 장애에 대한 기능 회복의 효능을 검토하였고, 인간배아줄기 세포의 신경세포 보호효과를 규명하기 위하여 면역조직화학 염색법을 이용하여 해마내의 세포사멸을 측정하였으며, 인지 및 기억증진의 작용을 규명하기 위하여 아세틸콜린성 신경세포의 활성도를 측정하였다. (중략)
체세포 핵이식을 통한 정상인과 환자 체세포 유래의 다능성 인간배아 줄기세포주 확립 및 응용 - 체세포 핵이식을 통한 다능성 인간 배아 줄기세포주 확립의 기술적 측면 - 인간배아줄기세포의 분화 : 발생생물학적 접근 및 세포치료에 대한 전망 - 마우스 배아줄기세포 기능들의 호르몬 조절 - 간엽줄기세포를 이용한 골조직 공학 - 조혈모세포의 재생 - 제대혈 유래 간엽줄기세포를 이용한 세포치료 - 난치성 혈액종양질환에서 수지상세포를 이용한 세포면역치료법 확립
목 적: 인간의 배아줄기세포는 전분화능과 영속성을 가지고 있어 발생 및 분화에 관련된 기초 연구 뿐 만 아니라 재생의학, 약물검색 등에서도 매우 유용한 재료로 이용될 수 있다.본 연구에서는 유전체의 변형이 배아줄기세포주의 확립 효율에 미치는 영향을 살펴보고자 비정상적인 포배기 배아에서 내세포괴를 분리하여 배양하였다. 연구 방법: 인간의 체외수정 및 배아이식술에서 공여 받은1개 또는3개의 전핵이 관찰되는 비정상 수정란 (n=20)과 착상전 유전진단에서 이수성이 확인된 배아 (n=27)를 대상으로 하였다. 일반적인 immunosurgery 방법으로 영양배엽세포들을 제거하고 내세포괴를 분리한 후 PMEF 혹은 STO feeder 세포위에서 배양하였다. 배아줄기세포의 배양시스템을 검증하기 위해서 이미 확립된 Miz-hES1 cell line을 동시에 같은 조건 하에서 계대배양하였다. 결 과: 비정상 수정란에서 발생된 포배기 배아에서 분리한 1개의 내세포괴가 배아줄기세포와 유사한 colony를 형성하였으나, 계대배양에는 실패하였다. 이수성 배아에서 발생된 포배기 배아의 내세포괴 배양에서는 두개의 colony가 계대배양 중에 영양배엽세포의 형태로 분화되어 미분화 상태를 유지하지 못하였다. 동일한 시기와 조건 하에서 계대배양된 Miz-hES1 cell line이 미분화상태로 유지됨을 karyotyping (46, XY)과 immunophenotyping (positive in SSEA-3 and -4)으로 확인하였다. 결 론: 본 연구의 결과에서 비정상 수정란과 이수성 배아에서 발생된 포배기 배아에서 유래한 내세포괴는 배아줄기세포주 확립 및 미분화 상태 유지 능력이 매우 저조한 것으로 여겨진다. 따라서, 인간의 배아줄기세포주를 확립하는데 있어 배아의 정상여부가 중요한 요소로 작용할 것으로 생각된다.
배아줄기세포 유래 심근세포는 심근경색 등으로 심장이 제 기능을 다 하지 못할 때 치료적 목적으로 주사하여 환자의 심기능을 정상화 시키는 데에 쓰인다. 배아줄기세포 유래 심근세포는 페이스메이커 활동을 보이면서 막전압 고정상태에서도 주기적인 일과성 내향전류를 보이는 특징을 갖고 있다. 본 연구는 기존에 발표된 배아줄기세포 유래 심근세포의 시뮬레이션 모델을 이용하여 어떻게 하여 페이스메이커 활동이 나타나는지 그 기전을 밝히고자 하였다. 세포내 모든 이온을 고정하였을 때 모델 세포는 여전히 페이스메이커 활동을 보였다. 근장그물내 칼슘 이온을 고정하였을 때도 모델 세포는 페이스메이커 활동을 보였다. 그러나 Na-Ca 교환 전류를 차단하였을 때는 모델 세포의 페이스메이커 활동이 사라졌는데, 여기서 L-type $Ca^{2+}$ 전류의 칼슘 의존성 비활성화 기전을 제거하자 페이스메이커 활동이 지속되었다. 또한 Na-Ca 교환전류와 L-type $Ca^{2+}$ 전류만으로는 페이스메이커 활동이 보이지 않았으나 L-type $Ca^{2+}$ 전류의 크기를 3배로 증가시키자 페이스메이커 활동이 다시 나타남을 확인하였다. 따라서, 배아줄기세포 유래 심근세포의 페이스메이커 활동은 Na-Ca 교환전류와 L-type $Ca^{2+}$ 전류의 역할이 매우 중요하며, Na-Ca 교환전류는 L-type $Ca^{2+}$ 전류가 비활성화되지 않도록 칼슘 이온의 농도를 조절하는 데에 큰 역할을 하는 것으로 결론을 내렸다.
배아줄기세포 유래 심근세포는 심근경색 등으로 심장이 제 기능을 다 하지 못할 때 치료적 목적으로 주사하여 환자의 심기능을 정상화 시키는 데에 쓰인다. 배아줄기세포 유래 심근세포는 페이스메이커 활동을 보이면서 막전압 고정상태에서도 주기적인 일과성 내향전류를 보이는 특징을 갖고 있다. 본 연구는 기존에 발표된 배아줄기세포 유래 심근세포의 시뮬레이션 모델을 이용하여 어떻게 하여 페이스메이커 활동이 나타나는지 그 기전을 밝히고자 하였다. 세포내 모든 이온을 고정하였을 때 모델 세포는 여전히 페이스메이커 활동을 보였다. 근장그물내 칼슘 이온을 고정하였을 때도 모델 세포는 페이스메이커 활동을 보였다. 그러나 Na-Ca 교환 전류를 차단하였을 때는 모델 세포의 페이스메이커 활동이 사라졌는데, 여기서 L-type $Ca^{2+}$ 전류의 칼슘 의존성 비활성화 기전을 제거하자 페이스메이커 활동이 지속되었다. 또한 Na-Ca 교환전류와 L-type $Ca^{2+}$ 전류만으로는 페이스메이커 활동이 보이지 않았으나 L-type $Ca^{2+}$ 전류의 크기를 3배로 증가시키자 페이스메이커 활동이 다시 나타남을 확인하였다. 따라서, 배아줄기세포 유래 심근세포의 페이스메이커 활동은 Na-Ca 교환전류와 L-type $Ca^{2+}$ 전류의 역할이 매우 중요하며, Na-Ca 교환전류는 L-type $Ca^{2+}$ 전류가 비활성화되지 않도록 칼슘 이온의 농도를 조절하는 데에 큰 역할을 하는 것으로 결론을 내렸다.
DNA 메틸화 (DNA methylation)는 유전자의 발현을 조절하는 대표적인 후생학적 조절기작 (epigenetic regulation) 중에 하나이다. DNA 메틸화 양상은 생식세포 형성과정 및 배 발생단계에서 탈메틸화 (demethylation)와 de novo 메틸화의 드라마틱한 변화가 일어난다. 또한 이러한 DNA 메틸화는 배아줄기세포 (embryonic stem cells, ESCs)에서 특징적인 양상을 보이는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 생쥐 수정란 유래 배아줄기세포와 체세포핵이식 배아줄기세포 (nuclear transplanted ESCs)를 이용해서 대표적 각인유전자 (imprinting genes)로 알려진 Snrpn, Igf2r, H19 유전자들에 대한 메틸화 양상을 알아보고자 하였다. 연구 결과 H19 유전자에 대해서는 DNA 메틸화 양상은 수정란 유래 배아줄기세포와 체세포핵이식 배아줄기세포에서 비슷한 경향을 보였으나, Snrpn과 Igf2r의 경우에는 체세포핵이식 배아줄기세포에서 과메틸화 (hypermethylation) 경향을 보였다.
생쥐 초기 배아의 형태형성에 영향을 주는 세포질내 인자의 기원과 작용기작을 연구하기 위해 단백질 합성과 단백질 활성화 효소 (protein kinase)의 억제제를 처리한 배아의 세포질로 재조합된 배아에서 발생과 RNA합성, 단백질 인산화를 조사하였다. 단백질 합성 억제제인 cycloheximide (CHX)가 함유된 배양액에서 24시간 배양한 1-세포 배아의 제핵된 세포질을 두 개의 전핵을 모두 가진 절반의 1-세포 배아와 재조합한 P+P-CHX군의 배아 발생과 유전자의 활성화는 P+P군의 배아와 유사하였으나, 밀집 형성과 밀집형성이 일어나는 세포 시기는 빨라져서 P+2군과 유사하였다. 또한 초기 배아의 발생 시 1-세포기에서 2-세포기 사이에 일어나는 단백질 인산화가 형태형성과정에 미치는 영향을 알아보기 위해, tyrosine protein kinase와 serine-threonine protein kinase의 억제제인 genistein (Gen)과 6-dimethylaminopurine (6-DMAP)이 처리된 배아의 제핵된 세포질과 2개의 전핵을 가진 절반의 1-세포 배아를 융합시킨 P+2-Gen과 P+2-DMAP군 배아의 발생과 밀집현상을 대조군인 P+P와 P+2군과 비교하였다. P+2-Gen과 P+2-DMAP군 배아에 발생은 대조군에 비해 빨랐으며, 특히 P+2-Gen군 배아는 밀집이 4-세포기에 일어나 8-세포기에 일어나는 P+2-DMAP군의 배아에 비해 일어나는 시간과 세포 시기가 빨라졌다. SDS-PAGE 방법으로 분석한 재조합 3시간째 P+2-Gen과 P+2-DMAP군의 단백질 인산화량은 대조군인 P+P와 P+2군에 비해 증가하였으나 종류의 변화는 없었다. 한편 2차원 전기영동법을 이용하여 P+2-DMAP군의 배아에서 P+2-Gen에 비해 80KD와 110KD 단백질의 인산화가 억제된다는 결과를 얻었다. 이상의 결과들은 생쥐의 초기 배아에서 형태 형성의 조절은 유전자 활성화 또는 난자내 모계 mRNA에 의해 수정 후 합성되는 새로운 단백질에 의한 것이 아니고, 난자내에 존재하는 인자에 의해 조절됨을 시사한다. 이 인자들 중 단백질의 인산화는 배아 발생과 형태형성에 밀접한 관계가 있으며, 특히 초기 1∼2세포기 사이에 serine-threonine protein kinase에 의해 인산화되는 단백질이 밀집현상을 조절하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 사료된다.
배아의 성별 판별을 위해 할구를 biopsy하여 핵상에서 정밀 분석을 하였다. 이 실험에서는 8-에서 16-세포기 배아의 할구를 배아 성결정의 대표물로 사용하여 IVF소 배아를 분석 평가하였다. 55개의 배아를 PCT후 biopsy하여 분석하였다. PCR에 의한 성판별에서 biopsy한 single blastomere와 blastocyst의 성판별의 일치하는 비율은 80%인 것으로 나타났다. IVF 수정란을 염색체 상태에서 평가하기 위해 8- 16- 세포기의 할구를 Karyotyping 하였다. 할구의 Karyotyping을 위해 metaphase 상태에서 vinblastine sulfate에 계속적으로 노출시켜 metaphse Ⅱ 상태를 유도하였다. (중략)
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[게시일 2004년 10월 1일]
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