바이오포토닉스는 생물학과 포토닉스의 융합학문으로 특히, 최근 바이오이미징기술, 광바이오센서, 광조절 및 바이오칩의 광학센서시스템 및 광학집게 개발등에 큰 관심을 받고 있고 다양한 융합연구를 창출하고 있다. 미세기전시스템(MEMS: Microelectromechancial system)은 센서나 구동기를 초소형화 하기 위해 매우 유용한 기술로서 지난 10여년간 광통신분야에서 미세광학소자 및 집적광통신 반도체소자개발에 응용되어왔다. 최근 이러한 MEMS 기술을 이용하여 고감도 바이오센서나 고분해능, 실시간 바이오 이미징시스템을 초소형하는 연구가 활발히 진행되고 있다. 본 연구에서는 바이오포토닉스 응용을 위한 광학소자의 초소형화 기술의 장점과 응용가능분야에 관해 소개하고자 한다.
바이오센서의 기본구조는 크게 바탕전극(base electrode), 막(membrane)및 측정장치(transducer) 등의 세 부분으로 나눌 수 있다. 여기서는 바탕전극의 종류와 감응 메카니즘(mechanism), 바이오센서의 원리와 그 종류, 응용범위및 국내 연구 현황에 대하여 소개하고자 한다.
광-바이오센서로 이용하기 위해 광섬유 형태의 마흐-젠더 간섭계와 측면 연마된 광섬유를 결합한 구조를 제안하였고, 이를 제작 및 특성 평가하였다. 마흐-젠더 간섭계 구성은 1310nm와 1550nm 파장에서 광 파워 분기비가 50:50인 $2{\times}2$ 광커플러 2개를 제작하여 구성하였으며, 센서부로는 측면 연마한 광섬유를 이용하였다. 제작된 광섬유 형태의 마흐-젠더 간섭계 센서의 센서부 표면에 다양한 굴절률 용액을 이용하여 광학적 특성을 평가하였다.
바이오센서는 간단하고 저렴하게 일차적으로 현장 시료를 분석할 수 있는 장점이 있다. 본 연구에서는 유전자 재조합으로 카드뮴을 검출할 수 있는 미생물 유래 바이오센서를 제작하였다. 이를 위해 카드뮴과 반응하는 CadC 유전자와 관련 프로모터를 PCR로 증폭하고 β-galactosidase 유전자(lacZ)와 결합하고 E. coli BL21 (DE3)에 형질 전환하였다. 이 바이오센서 세포는 카드뮴 존재 하에서 β-galactosidase를 발현하며 기질인 CPRG을 분해하여 붉은색으로 발색된다. 카드뮴 검출용 바이오센서는 카드뮴으로 3시간 유도하였을 때 β-galactosidase 활성의 최고값을 보여주었으며 pH 5에서 가장 좋은 활성도를 나타내었다. 카드뮴 검출용 바이오센서는 0.01 μM에서 10 mM 카드뮴에서 검출범위를 보여주었으며 0.01~10 μM에서 직선관계의 검정선(y= 0.98 X + 0.142, R2=0.98)를 나타내었다. 중금속 중에서 카드뮴과 납에서 높은 반응성을 보여주었으며 수은과 구리에서는 전혀 반응하지 않았으나 주석과 코발트에서도 약간의 반응성을 나타내었다. 카드뮴을 spike 한 폐수에서의 반응이 완충용액에 spike한 것(control)과 비슷하게 나타났다. 이는 카드뮴 검출용 바이오센서가 전처리를 하지 않은 현장시료에서도 반응성을 보여주어 현장시료의 간단하고 저렴한 일차적 검출에 활용될 수 있음을 시사한다.
소산파 기반 집적광학 바이오센서에 적합한 $Si_3N_4$ 립-광도파로 구조에 대한 해석적 분석을 통해서 단일모드 도파조건을 도출하였다. 두-모드 간섭현상을 이용하는 집적광학 바이오센서 구조를 제시하고, 단일모드와 두-모드(감지영역)에 해당되는 립-광도파로 제원인 폭, 립 및 코어 두께 각각에 대해서 $3{\mu}m$, 2 nm, 150 nm와 $3{\mu}m$, 20 nm, 340 nm를 제안하였으며, FMM 전산해석을 통해서 감지영역의 두-모드들에 대한 광학적 특성들을 검토하였다.
본 연구에서는 글루코스 검출을 위한 HRP (horseradish peroxidase)와 GOD (glucose oxidase)를 혼합한 형태의 다중 효소 반응 바이오센서 개발연구를 수행하였다. 바이오센서는 제작 시간 단축을 위하여 전기전착법을 이용하여 제작하였으며, 경제적인 센서 제작을 위하여 SPE (screen printed electrode)를 사용하였다. 다중 효소 바이오센서의 효과를 확인하기 위하여 단일 효소 바이오센서를 제작하여 비교 및 분석하였다. 센서의 특성을 평가하기 위해서 주사전자현미경(scanning electron microscopy, SEM), 순환전위법(cyclic voltammetry, CV), 전기화학적 임피던스 분광법(electrochemical impedance spectroscopy, EIS), 시간대전류법(chronoamperometry, CA), 흐름 주입분석법(flow injection analysis, FIA)를 수행하였다. SEM, CV, EIS의 분석결과로부터 효소가 전극 표면에 고정화가 잘 된 것을 확인하였고, CA로부터 제작된 다중 효소 바이오센서가 단일 효소 바이오센서에 비해 신호성능이 200% 향상된 것을 확인하였다. 이로부터 HRP와 GOD가 서로 촉매적으로 반응한다는 것을 설명할 수 있었다. 또한, FIA의 결과에서 동일한 농도의 글루코스 용액을 4회 나누어 주입하였을 때, 전류신호량이 일정함을 확인하였고, 농도에 따른 전류신호량을 분석하여 신호민감성, 재현성, 안정성 등이 우수함을 설명할 수 있었다.
글루코스 옥시다아(GOx)제 고정화 바이오센서를 두 가지 방법으로 제조 하였다. 첫 번째 방법은 폴리(maleic anhydride) 그래프트 탄소나노튜브(PMAn-g-MWCNT) 전극에 감마선 조사법으로 제조 된 Au 나노입자를 물리적으로 흡착시킨 후, GOx을 고정화 시켜 바이오센서를 제조한 경우이고, 다른 하나는 PMAn-g-MWCNT 전극에서 Au 이온을 전기화학적으로 환원시켜 Au 나노입자를 코팅 시키고, 그 위에 GOx을 고정화 시켜 바이오센서를 제조 한 경우이두. 제조된 바이오센서에 대해 효율 평가를 수행 하였는데, 물리적 흡착법으로 제조된 전극의 경우 검출 범위는 $30\;{\mu}M\sim100\;{\mu}M$이었으며, 검출한계는 $15\;{\mu}M$이었다. 또한 ascorbic acid와 uric acid에 대한 검출한계는 7.6%이었다. 물리적으로 Au 나노입자가 흡착된 전극의 경우가 글루코스 측정에 매우 우수한 전극임을 확인 하였다.
본 연구에서는 페놀 화합물들을 현장에서 검출하기 위해 간단하고 간편한 일회용 재조합 박테리아 바이오센서 시스템을 개발하였다. 플라즈미드 pLZCapR을 함유하는 E. coli 세포를 ${\beta}$-galactosidase 기질인 CPRG와 함께 96-well plate의 wells에 agarose로 고정하였다. 이 바이오센서는 현장에서 발색을 위한 별도의 기질을 추가하거나 불편한 기기 사용 또는 시료의 전 처리를 필요로 하지 않는다. 시료의 측정은 간단히 적은 부피(<100 ${\mu}l$)의 현장 시료를 바이오센서를 포함하는 wells에 넣고 발색을 관찰하여 측정하였다. 또한 6% DMF, 0.1% SDS 그리고 10 mM $CaCl_2$를 첨가하여 agarose 고정에 의한 화합물의 세포내 확산 제한을 감소시켜 보다 더 나은 발색을 얻을 수 있었다. 따라서 이 고정된 미생물 유래 재조합 바이오센서 시스템은 현장에서 환경오염물질들을 간단하게 확인하고 정량 하는 유용한 접근 방법이 될 것으로 사료된다.
본 연구에서는 전 세계적으로 활발히 연구되고 있는 나노바이오센서 분야 중 가장 주목을 받고 있는 LSPR 원리를 이용한 바이오센서를 제작하였다. 금속 나노입자의 국소 표면 플라즈몬 공명현상에 의한 주위환경에 민감하게 반응하는 특성은 고감도 광학형 바이오센서, 화학물질 검출 센서등에 응용된다. 특히 금 나노막대와 같은 1차 나노구조물은 나노막대의 주변 환경 변화에 따라 뚜렷한 플라즈몬 흡수 밴드 변화를 나타냄으로 센서로 적용 했을 때 고감도의 측정이 가능하다. 본 연구에서는 다공성인 알루미늄 양극산화 박막 주형틀을 이용하여 다양한 종횡비를 가지는 금 나노막대를 합성하고, 나노막대 어레이 형태의 박막을 제작하였다. 금 나노막대의 합성은 알루미늄 양극산화막을 사용한 주형제조 방법(template method)을 사용하는 전기화학 증착법을 사용하였다. 우선 부도체인 알루미늄 양극 산화막의 한쪽면을 열증착 장비를 사용하여 금을 증착하여 작업 전극(working electrode)을 형성하였다. 백금 선(platinum wire)을 보조 전극(counter electrode)으로 사용하고 Ag/AgCl 전극을 기준 전극(reference electrode)으로 사용하여 삼전극계(three-electrode system)를 형성하였으며, 금 도금 용액(orotemp 24 gold plating solution, TECHNIC INC.)을 사용하여, 800 mV 전압에서 금 나노 막대를 합성하였다. 금 나노막대의 길이는 테플론 챔버를 통과한 전하량 또는 전기 증착 시간에 비례하여 결정된다. 금 나노막대를 성장시킨 알루미늄 양극산화막을 실리콘 웨이퍼에 은 페이스트를 사용하여 고정시킨 후 수산화나트륨 (NaOH)용액을 사용하여 알루미늄 양극산화막을 녹여내어 수직방향으로 정렬되어 있는 나노 막대 어레이 박막을 제조 하였다. 또한 제작된 금 나노막대 어레이의 광학적 특성을 평가하였다. 본 연구에서와 같이 나노막대를 직경방향으로 측정할 경우, 직경방향의 transverse mode만 측정된다. 금 나노 막대가 알루미늄 양극산화막 안에 포함된 상태로 측정된 금 나노로드 어레이 박막의 광 스펙트럼 분포는 금 나노막대의 가시광영역에서의 흡수 스펙트럼을 측정하였을시 직경 및 길이에 따라 transverse mode의 ${\lambda}$ max (최대 흡광)의 위치가 변화됨을 나타낸다. 실험 결과를 바탕으로 나노막대의 종횡비가 증가함에 따라 흡수 스펙트럼의 transverse mode ${\lambda}$ max가 미약하게 단파장 영역으로 이동하는 것을 확인할 수 있다. 이러한 결과는 원기둥 형태의 금 나노막대의 흡수 스펙트럼에 대한 이론적인 예측과 부합한다. 바이오센서로의 적용 가능성을 확인하기 위하여 자기조립단분자막을 형성하여 항체를 고정하고 CRP에 대한 응답특성을 평가하였다. CRP 항원-항체의 면역반응에 대한 실험 결과 CRP 항원의 농도가 증가함에 따라 넓은 측정범위에서 선형적으로 흡광도가 증가하는 결과를 나타내었으며, CRP 10 fg/ml의 농도까지 검출할 수 있었다. 센서의 선택성을 확인하기 위하여 감지하고자하는 대상물질이 아닌 Tn T 항원을 감지막에 반응시켜 흡광도 변화를 분석하였다. 결과적으로 제작된 센서칩은 선택성을 가지고 측정하고자하는 물질에만 반응함을 확인하였다. 이러한 결과는 다양한 직경을 사용한 부가적인 LSPR현상의 연구에 활용될 수 있을 것이다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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