방선균은 생리활성물질의 탐색원으로서 많은 주목을 받고 있는 미생물이지만 현재까지 이용되어온 균주의 대부분은 육상의 토양에서 분리된 것들이고, 해양의 방선균에 관하여서는 아직까지 거의 연구되지 않은 분야이다. 미생물의 서식지로서 해양의 환경조건은 육상과 현저히 다르기 때문에 해양에 있어서 방선균의 microflora는 육상과는 상당히 다를 것으로 생각되어지며, 또한 연안해역에 존재하는 방선균 중에는 육상에서 유입된 담수 등으로 인하여 육상의 토양으로부터 유래된 방선균도 많은 것으로 알려지고 있다. (중략)
미생물 생산은 다양한 산업에 이용되는 핵심산업이다. 그러나 미생물을 장기간 보존하거나 생산 후 현장처리에 상황에 있어 미생물의 활성이 환경 및 각종조건에 따라 장기간 유지되지 못하는 경향이 있다. 따라서, 본 실험에서는 Pseudomonas putida SSEoX의 생산 후 시중에서 판매되는 perlite, diatomite, bentonite, zeolite, dolomite, vermicullite 등의 담체를 이용하여 미생물의 생리활성유지를 위한 실험을 자연현상에서 나타날 수 있는 다양한 온도에서 담체의 종류별로 수행하였다. 그 결과 bentonite를 이용한 담체의 경우 5, 20, 3$0^{\circ}C$에서 40일간 미생물의 밀도가 거의 감소하지 않은 결과로 나타났고 zeolite의 경우 20일 이내의 저온에서 생존율이 높은 것으로 나타났으나 온도의 상승으로 생존율이 현저히 떨어졌다. 또한 Dololite의 경우 초기 20일 내에서는 20t에서 생존율이 매우 높았으나 40일 후 생존율이 현저히 감소하였다. 또한 bentonite의 경우 전체적으로 생존율이 거의 감소되지 않았으며 그중 5$^{\circ}C$와 2$0^{\circ}C$에서 생존율이 가장 높았고 3$0^{\circ}C$에서 30일 후까지는 비교적 적은 감소를 보였으며 40일 이후 비교적 큰 감소율이 있었다. 따라서, 본 실험결과 비교적 낮은 온도에서 bentonite와 vermiculite를 혼합한 담체를 이용한 미생물보존이 가장 우수만 생존유지법이었다.
본 연구에서는 endosulfan으로 오염된 토양을 in-situ flushing으로 정화시 발생되는 세척 유출수의 고정화 미생물에 의한 처리 효율 및 적용성을 검토하였다. 초기 endosulfan 농도 및 pH가 각각 5mg/L, 5.6인 세척유출수의 체류시간을 1, 3, 5시간으로 하여 고정화미생 물 충진 컬럼에 적용한 결과, 제거효율은 각각 62, 82, 89%로 체류시간이 증가될수록 향상되었으며 3가지 조건 모두 약 80시간 이후에 정상상태에 도달하였다. 체류시간 3시간에서 유입수내 endosulfan 농도를 50mg/L 및 100mg/L로 증가시킨 결과, 제거효율이 각각 70% 및 50% 부근까지 저하되었다. 유입수의 pH를 4.0과 9.0으로 변화시켜 실험한 결과 각각 73%와 66%의 제거효율을 나타내었다. pH 9.0보다 4.0에서 제거효율이 약간 높은 이유는 사용 배지의 pH가 약산성을 띠기 때문에 알칼리 상태보다 약산성에서 미생물의 활성이 높기 때문으로 판단된다. 유출수를 재순환 시킨 결과 제거효율이 90%까지 향상되는 것을 볼 수 있었으며, 이는 재 순환되는 유출수의 농도 저감 및 고정화 미생물과의 재 접촉에 기인하는 것으로 판단된다. 유입수에 공기를 주입한 결과, 유출수의 재순환 없이도 약 40시간 후에 93%의 제거효율을 보였으며 이는 미생물 활성의 증가에 기인하는 것으로 판단된다.
담수상태의 논토양에 처리한 유기인계 살충제 diazinon의분해기작과 그 분해산물에 대하여 조사하였다. 항온조건($30^{\circ}C$)하에서 살균토양에 비하여 비살균토양에서의 diazinon 분해가 보다 빠르게 일어남으로써 담수토양내 diazinon 분해에 미생물의 대사활동이 매우 종요한 것으로 나타났는데, 비살균토양내 diazinon의 반감기는 약 2일이엇고 항온반응 7일만에 95% 이상의 분해가 이루어졌다. 또한 diazinon 분해기간 중 미생물 개체수와 아울러 토양내 monoxygenase 및 esterase 활성의 증가가 이루어졌으며 이는 토양내 diazinon 처리가 이 약제의 분해와 관련된 미생물학적 요인의 생장 또는 활성을 촉진시키고 있음을 보여준다. 이와 관련하여 담수토양내 diazinon 분해산물로서 esterase 작용에 의한 2-isopropyl-6-methyl-4-hydroxy pyrimidine 이외에 monooxygenase에 의한 diazoxon과 hydroxydiazinon, 그리고 sulfotep 등이 mass spectrometry에 의하여 확인되었다.
누에동충하초의 유효성분 증가 및 흡수력 향상을 위한 발효식품을 개발하기 위하여 유산균, 고초균, 낫토균, 효모 등 4종의 미생물을 이용하여 각 미생물을 사용할 수 있는 다양한 조합으로 단 발효와 복합 발효를 시도한 15가지의 모든 경우의 수를 미생물 접종 조건으로 하여 발효산물을 제조하였다. 각 조건의 발효산물의 당도, 환원당, 단백질 함량 등 기본 성분의 함량 변화와 총폴리페놀, 총플라보노이드, 항산화 활성, tyrosinase 저해활성, 혈전 용해 활성 등 건강식품 개발에 요구되는 항목들의 활성을 분석하였다. 그 결과 대부분의 발효산물에서 환원당과 단백질 등 함량은 다소 낮아졌으나 효모를 이용하여 발효한 발효산물에서는 당도가 높아져 단맛이 증가하였으며, 총 폴리페놀과 항산화 활성은 발효 전 누에동충하초에 비해 발효산물에서 증가를 보이지는 않았지만 총플라보노이드와 tyrosinase 저해활성 및 혈전용해 활성에서는 발효에 의해 증가효과를 나타냈다. 특히, 효모를 이용한 복합 발효균에서 대부분 활성의 증가를 나타냈으나 효모만을 이용한 단 발효에서는 그 활성의 증가를 확인할 수 없었다. 따라서 유산균과 효모를 이용한 복합 발효 조건에 대한 추가적인 연구를 통해 더욱 탁월한 건강기능효과를 가지는 누에동충하초 발효식품을 개발한다면 국민 건강 증진 및 양잠농가의 소득증대에도 기여할 것으로 기대한다.
우리나라는 예전부터 전통적인 방법으로 누룩을 제조하고, 이를 발효제로 막걸리를 만들어 왔다. 막걸리는 여과 또는 살균 과정없이 다양한 미생물을 살아 있는 상태로 섭취하기 때문에 영양학적으로나 기능적인 측면에서 가치가 높다. 최근 많은 연구에서 막걸리로부터 미생물을 분리동정하고 다양한 기능성에 대해 스크리닝한 결과, 높은 프로바이오틱스 활성과 다양한 스펙트럼의 항균활성을 가진 균주들이 선별되었다. 특히 일부 유산균들은 GABA와 EPS 등의 기능성 물질을 생성하기도 했다. 또한, 일부 유산균과 효모의 경우 각각 bacteriocin 및 killer toxin을 통해 항균활성을 나타내는 것으로 여겨진다. 이러한 막걸리 유래 기능성 미생물과 그 대사산물은 기능성 식품 소재나 안전한 식품첨가물 및 다양한 산업분야에서 활용될 수 있을 것이다.
비자나무는 한반도 남부지역과 제주도에 자생하고 있으며 식용으로 이용이 가능하며, 전통적으로 구충 빛 변비 예방의 목적으로 사용되어 왔었다. 그러나 항산화 활성에 대한 연구는 보고되어 왔지만 항당뇨 활성에 대한 연구는 제대로 이루어지지 않고 있다. 새로운 당뇨 치료제로서 천연물은 독성의 염려가 낮고 매우 오랫동안 사용되어 왔기 때문에 약물에 대한 안전성의 장점이 있다. 식용 및 한방 재료로 사용되고 있는 비자나무는 지금까지 살충 및 항균성에 대해 보고되어 왔으나 항당뇨에 관한 연구는 이루어진 바가 없다. 따라서 본 연구에서는 비자나무 추출물의 항당뇨 효과를 조사하고 그 특성을 조사하였다. 먼저, 비자나무의 과육과 종자를 메탄올로 각각 추출한 후, 항당뇨 활성과 관련된 α-glucosidase와 protein tyrosine phosphatase 1B (PTP1B)에 대한 저해활성을 포함한 다양한 생리활성을 조사하였다. 그 결과, 비자나무의 종자 추출물에서 항당뇨활성을 나타내는 α-glucosidase와 PTP1B 효소에 대한 억제 효능이 높게 나타났으며, 특히 과육에 비해 종자 추출물이 각각 14.5배, 4.3배 높은 저해활성을 보였다. 또한 비자나무의 과육 추출물의 pH와 열 안정성 테스트를 수행한 결과로, 활성 물질은 산, 알카리 조건과 고온의 조건에서 안정한 저해활성을 보였다. 비자 과육의 메탄올 추출물을 한외 여과(ultrafiltration)한 결과, 항당뇨 활성물질은 분자량이 300 kDa 이상에 해당하였고 Diaion HP-20 수지에 대한 흡착능을 조사한 결과, 50-100% 메탄올 조건에서 항당뇨 활성물질이 용출되었다. 따라서 비자나무 종자의 메탄올 추출물로부터 buthanol 추출, 한외 여과, Diaion HP-20 컬럼 크로마토그래피를 통해 비자나무의 항당뇨 활성 물질의 분리, 정제를 시도하였다. 따라서 비자나무 종자 추출물의 인슐린 저항성에 대한 개선 효과에 대한 추가 연구를 통해 천연물 유래 당뇨병 예방 및 치료용 조성물로서의 가능성을 보여주었다.
본 연구에서는 국내 자생 식물인 아욱으로부터 새로운 균주를 분리 및 동정하였고 해당 미생물이 생산하는 항미생물질의 활성과 관련 생합성 유전자들을 확인하고자 하였다. 16S rRNA 유전자 서열 정보를 토대로 비교한 결과, 아욱에서 분리된 균주는 Bacillus velezensis이었으며 strain은 MV2라고 명명되었다. 유전체 염기서열 분석을 통해 전체 유전정보를 확인할 수 있었으며, 45.57% GC 함량을 가지는 4,191,702 bp 크기의 1개 컨티그(contig)가 존재하는 것으로 확인되었다. B. velezensis MV2가 정지기에 생산하는 물질 중 항균 활성이 확인된 소수성 물질 분획을 이용하여 항균 활성 스펙트럼 테스트를 진행한 결과, 그람음성균보다 그람양성균에서 더 높은 억제능이 확인되었다. 6종의 곰팡이를 이용한 항진균 활성 테스트에서는 모든 진균에 대해 강한 저해 활성을 보였으며, 특히 F. fujikuroi와 F. graminearum에 대한 항진균 활성이 매우 강하게 나타났다. 세균에 대한 항균물질의 작용 기작 분석을 통해 해당 항균물질은 균을 용해시키는 살균(bactericidal) 특성을 가진 것으로 추측할 수 있었다. B. velezensis MV2의 유전체 염기서열 정보를 통해 이차대사산물 생합성 유전자 cluster를 탐색한 결과 총 47가지 이차대사산물 생산이 예측되었으며, 기존에 밝혀져 있는 물질들과 유사도 80% 이상인 물질은 14개로 확인되었다. 앞서 확인된 내용들을 바탕으로 B. velezensis MV2에서 생성되는 항균물질은 비리보솜 펩타이드성 물질로 예상되며, 향후 항균물질의 동정과 활용 가능성에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각되었다. 기존에 상업적으로 이용되었던 곰팡이에 대한 활성이 낮은 항균물질 생물제제들과 함께 복합기능성 미생물제로 활용하여 식품산업 및 농업에서의 이용 가능성이 있음을 보여주었다.
항균 활성이 대체로 상승되었으나 Sarcina maginata의 경우는 약간 감소되었다. $\beta$-lactam 항생 물질인 penicillin G.Na와 ampicillin.Na도 인삼 saponin의 첨가로 항균 활성이 상승되었으나 Serratia 속 세균은 penicillin G.Na의 항균활성에 일정한 효과를 나타내지 않았다. 인삼 saponin 의 첨가에 의한 항생 물질들의 항균 활성의 변화는 Gram양성 세균 및 Gram음성 세균에 대해 일정하지 않은 상승 작용 혹은 길항작용과 같은 비특이성을 나타내었다. 세균의 약제 내성 현상도 인삼 saponin자 항생물질의 투여로 배제될 수 있을 것으로 사료되었다.
Bacillus amyloliquefaciens psychrotrophic strain이 분비하는 세포 외 단백질 가수분해효소를 정제하여, endopeptidase 활성에 관한 특성을 분석하였다. Protease SE910로 명명된 효소는 단백질 내부의 leucine에 연결된 peptide 결합만을 가수분해하는 endopeptidase로 작용한다. 효소를 특이한 아미노산 잔기에 작용하는 화학수식제와 반응하였을 때 효소의 활성부위에 관여하는 아미노산 잔기가 수식되었을 때는 효소활성이 저해를 받는다. 본 효소는 serine을 수식하는 PMSF에의해 endopeptidase 활성이 완전히 저해되었으며, 카르복실 기능기를 수식하는 화학수식제에 의해 저해되었고, lysine을 화학수식하는 PLP에 의해서는 큰 영향을 받지 않았다. 이것은 본 효소의 endopeptidase 활성에 serine과 aspartic acid 잔기가 관여하는 것을 의미한다. 구조적으로 leucine을 포함하는 유도체인 bestatin은 효소의 endopeptidase 활성을 경쟁적으로 저해하였다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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