Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, aizawai, dendrolimus, finitimus 그리고 israelensis의 결정성독소의 특성을 구명하기 위하여 이들 균주들이 생산하는 결정성독소들을 alkali용액, SDS용액, 누에소화액 그리고 부분정제된 누에소화액 protease에 용해시켜 전기영동을 실시 이들 독소의 저분자화 현상을 조사하였으며 또한 amino산 조성과 면역학적 특성을 조사하여 아래와 같은 결과를 얻었다. 1. Alkali 용액과 1% SDS-1% $\beta$-mercaptoethanol에 결정성독소들을 용해시킨 결과 subsp. kurstaki, dendrolimus, finitimus 그리고 aizawai로부터는 분자량 1.3$\times$105과 6.5$\times$104의 subunit가 주 band로 나타났고 subsp. israelensis에서는 분자량 4$\times$104과 1.4$\times$104의 subunit가 주 band로 나타났다. 2. 누에소화액에 의한 결정성독소의 분해상은 alkali용액이나 SDS-mercaptoethanol 처리때와 같은 pattern을 보여 주었다. 3. 부분정제된 누에소화액 protease로 결정성독소를 용해시켰을 경우 subsp. kurstaki, aizawai, finitimus에서는 분자량 1.3$\times$105의 subunit는 용해되어 거의 나타나지 않았고 6.0-6.4$\times$104의 subunit가 주 band로 나타났으며 subsp. dendrolimus에서는 분해 정도가 약하게 나타났고 subsp. israelensis에서는 alkali나 SDS 처리때와 비슷한 전기영동상을 나타냄으로써 누에소화액 protease에 의하여 용해되지 않았음을 보여 주었다. 4. 결정성독소의 amino산 조성은 subsp. israelensis에서는 aspartic산이 14.5%로 가장 많은 비율을 차지하였고 그외 4개의 subsp.에서는 glutamic산이 13.9-14.6%로 가장 많았다. 5. 결정성독소의 면역학적 특성을 보면 subsp. israelensis의 항체는 그것의 항원과만 반응하고 그외 4개의 subsp.의 항체는 각각의 항원과 그리고 서로 다른 항원과 교호하여 반응하였다.
남조류 독소인 마이크로시틴은 호수에서 매우 미량 존재하기 때문에 이를 정확히 정량 분석하기가 쉽지 않다. 본 연구에서는 소양호에서 채취한 물시료 중에 포함된 남조류 독소, 마이크로시틴을 정량 분석하기 위하여 두 가지 서로 다른 정량 분석법을 시도하였으며 이 둘의 정량 결과를 비교${\cdot}$분석 하였다. 첫째는 고체상 추출과 HPLC(High Performance Liquid Chromatography)를 이용한 분석법을 이용하였으며 둘째는 마이크로시틴의 단일클론항체를 이용한 효소면역흡착분석법(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)을 이용하였다.
남조류 독소인 마이크로시스틴은 여름철 우리나라 여러 호수들에 존재하여 물고기와 가축 그리고 인간에게 강한 독성을 나타내는 독소이다. 본 연구에서는 화학적 산화제인 염소($Cl_2$), 과망간산칼륨($KMnO_4$), 과산화수소수($H_2O_2$)를 이용하여 마이크로시스틴중 가장 독성이 강한 마이크로시스틴 LR의 분해실험을 시도하였다. 수중 마이크로시스틴LR의 농도 측정은 마이크로시스틴 LR의 단일클론항체를 이용한 효소면역흡착분석법으로 측정하였다. 실험결과 염소는 마이크로시스틴 LR의 농도 800 pg/mL, $Cl_2$의 농도 12 ppm, 암소방치시간 40분, pH 7에서 가장 잘 분해되었으며, 또한 pH 8 이상에서는 독소 파괴가 눈에 띄게 감소하였다. 과망간산칼륨의 경우 마이크로시스틴 LR의 농도 2000 pg/mL, $KMnO_4$의 농도 1.2 ppm, 암소방치시간 60분, pH 7에서 가장 잘 분해되었다. 그러나 과산화수소수에 의한 마이크로시스틴 LR의 분해는 느린 화학 반응 속도 때문에 효과적이지 못함을 알수 있었다.
도계장에서는 항상 비품이 발생한다. 골절, 피부병변, 착색이상 등 여러 가지 상태의 계육이 비품으로 분류되어 큰피해를 입고 있다. 가까운 예로 미국의 경우 이에 대한 피해액이 연간 5천만 달러로 추산되고 있다. 국내에서는 이러한 문제 때문에 육계 담당 부서에서는 항상 비품에 대해서 스트레스를 받고 있다. 하지만 이러한 문제들이 정말 스트레스가 되는 원인은 사육 중에 발견되기보다는 도계 후에 발견되며, 이에 따라상품가치가 현저히 감소하고 추가적인 작업이 요구되기 때문일 것이다. 대부분의 회사들이 이 문제를 접하게 되면, 주로 곰팡이 독소 흡착제를 사용하는 것이 유일한 대책인 것으로 생각한다. 이런 경우엔 약품에 대한 효과는 잘 모르겠지만, 필자의 느낌으로는 일정한 시간이 흘러 자연스럽게(?) 해결되는 과정을 걷는 듯 하며, 관련 부서에서는 이 약제의 효과에 대해 판단하기보다는 일단 직면한 문제가 해결되었
다고 결과론적으로 만족하는 듯 하다. 필자는 이 지면을 통해 그 동안의 관점과는 다른 측면에서 이런 문제의 원인과 그 대책에 대해 간략히 논하고자한다. 도계장에서는 항상 여러 가지 비품들이 발생한다. 이 모든 것들을 논하기에는 너무 범위가 넓기 때문에 여기서는 독자들의 이해를 위해 비품들 중에서 등 부위의 상처와 복부의 상처(배꼽 닭)에 대해 국한하도록 하겠다. 아마도 이 부분외의 다른 비품들은 대부분 그 원인을 쉽게 추정할 수 있기 때문이다. 먼저, 독자들에게 질문하고 싶은 것이 있다. 이러한 비품들의 직접적인 원인은 무엇인가? 앞서 얘기한 것과 같이 각 회사들의 대책으로 이용되는 곰팡이 독소 흡착제를 보면, 곰팡이 독소가 가장 직접적인 원인으로 생각할 수도 있다. 하지만 결론적으로 직접적인 원인은 외상이다. 즉, 외부의 물리적인 작용에 의한 상처인 것이다. 이런 측면에서 볼 때 가장 직접적인 원인은 외상이며, 이 외에 깃털발육 이상(혹은 저하), 바닥상태 불량 등과 같은 사양관리 이상과 면역 억제성 질환 및 지혈능력의 저하 등이 직접적인 원인으로 인한 문제들을 더욱 악화시키는 간접적인 원인으로 작용한다.
어린이집 유아들이 사용하는 칫솔 및 양치 컵의 미생물 오염도와 분리된 식중독 미생물의 독소 유전자 및 독소 생산능력을 분석하여 칫솔과 양치 컵에 의해 발생할 수 있는 식중독을 예방하고자 칫솔 75개, 칫솔걸이 29개, 양치 컵 65개를 실험하였다. 일반세균수는 평균 5.3 log CFU 검출되었고 칫솔은 평균 6.7 log CFU 검출되어 가장 높은 오염도를 나타내었다. 대장균군은 칫솔 75건 중 41건 (54.7%), 칫솔걸이 29건 중 13건 (44.8%), 양치 컵 65건 중 29건 (44.6%)에서 검출되었으며 진균수는 평균 3.2 log CFU 검출되었고 칫솔이 평균 4.6 log CFU 검출되어 칫솔의 대장균군, 진균 오염도가 가장 높게 나타났다. Salmonella spp.는 모든 시료에서 검출되지 않았으나 B. cereus는 칫솔 75건 중 1건 (1.3%), 양치 컵 65건 중 2건 (3.1%)에서 검출되었고 S. aureus는 양치 컵 65건 중 1건 (1.5%)에서 검출되었다. 칫솔에서 분리된 B. cereus의 경우 nheA, nheB, nheC, hblC, hblD, hblA, entFM 등 7종의 설사독소 유전자가 검출되었고 양치 컵에서 분리된 B. cereus 2균주는 nheA, nheB, nheC, entFM 설사독소 유전자만 검출되었다. 칫솔에서 분리된 B. cereus의 경우 HBL, NHE 설사독소를 생산하였고 양치 컵에서 분리된 B. cereus 2균주는 모두 NHE 설사독소만을 생산하였다. B. cereus는 ${\beta}-lactam$계 항생제에 내성을 나타내었고 S. aureus는 ampicillin과 penicillin에만 내성을 나타내었다. 이러한 결과는 대부분의 칫솔과 양치 컵이 양치 후 젖은 상태로 화장실에 보관되거나 젖은 상태로 자외선 살균고에서 살균되는 등 부적절한 보관가 살균방법이 주요 원인으로 분석되었다. 따라서 면역력이 취약한 어린이집 유아가 사용하는 칫솔 및 양치컵을 건조한 후 자외선 살균고 등을 이용 살균하여 상대 습도가 낮은 건조한 곳에 보관하여야 할 것으로 판단되었다.
11종(아플라톡신 $B_1$, $B_2$, $G_1$, $G_2$, 오크라톡신 A, 푸모니신 $B_1$, $B_2$, 제랄레논, 데옥시니발레놀, T-2 toxin과 HT-2 toxin) 곰팡이독소 동시분석법을 정립하였다. 1/6 면역친화컬럼을 이용하여 정제하였으며, LC/MS/MS로 분석하였다. 각각 독소별 정성한계는 S/N=3에서 0.1-3.0 ${\mu}g/kg$이었으며, 정량한계는 S/N=10에서 0.3-10.0 ${\mu}g/kg$이었다. 회수율(recovery)은 70.45-111.11%이었으며, 상대표준편차(RSD)는 0.10-14.45%로 나타났다. 동 분석법을 이용하여 대표적인 한국산 농산물인 백미, 보리, 옥수수에 대한 곰팡이독소 오염실태를 조사하였다. 푸모니신, 데옥시니발레놀, 제랄레논이 백미와 보리에서 각각 평균 29.8, 6.4, 36.2%와 2.3, 55.8, 34.9%의 평균 오염율을 보였으며, 다른 독소들은 나타나지 않았다. 옥수수에서는 1개의 시료에서 푸모니신($B_1+B_2$)이 100.90 ${\mu}g/kg$ 검출되었다. 하지만, 곰팡이독소 오염 수준은 현재 우리나라 각 곰팡이독소 허용 최대기준치 이내로 나타났다. 한편, 벼의 가공단계, 재배지역, 벼 품종 및 품질 등급에 따른 곰팡이독소 오염현황을 비교하였다. 벼에서 현미, 백미로 가공될수록 곰팡이독소 오염도는 감소하였다. 동일 품종의 경우에 상대적으로 기온이 높은, 낮은 위도의 지역에서 재배된 벼가 곰팡이독소가 많이 오염된 것으로 나타났으며, 벼의 품질 등급이 낮아질수록 높은 곰팡이독소 오염도를 나타내었다. 이러한 결과를 종합적으로 살펴보았을 때 국내산 주요 농산물의 곰팡이독소 오염수준이나 위해도가 기준치 이내이며, 위험한 수준은 아닌 것으로 판단된다. 그러나, 곰팡이독소는 코덱스 등 국제사회에서 중요하게 다루어지고 있고, 현재까지 알려지지 않은 위험성이나 신규 독소들에 대한 연구가 활발히 진행되고 있는 만큼 우리나라도 충분한 연구를 통하여 우리 식품에 대한 안전성 논란에 사전 대비토록 하여야 할 것이다.
발암성 진균 독소의 하나인 fumonisin을 신속, 간편하게 분석할 수 있는 효소면역측정법 (ELISA)을 개발하고자 하였다. 먼저 Fumonisin $B_1\;(FB_{1})$에 특이적인 항체를 생산하기 위하여 $FB_1$을 keyhole lympet hemocyanin (KLH)에 공유결합시키고 이를 Freund's adjuvant와 함께 토끼에 3차례 피하주사하여 면역하였다. 높은 항체가와 가장 양호한 경합반응을 보인 항혈청으로부터 항체를 정제하였으며, 이 항체의 fumonisin 유사독소에 대한 교차반응은 fumonisin $B_1,\;B_2$및 $B_3$에 대하여 각각 100%, 69% 및 166%이었다. $FB_1$의 검출을 위하여 확립한 직접법 경합ELISA (cdELISA)로 옥수수에 인위적으로 오염시킨 $FB_1$을 정제없이 ELISA로 분석하는 경우, 75% methanol로 시료의 추출 후 완충액으로 1/100 희석하였을 때 양호한 회수율을 보였다. 이 조건하에서 행한 ELISA의 FB₁분석회수율은 $1-30\;{\mu}g/g$의 오염농도범위에서 평균 67%이었으며, 농도별 회수율의 분산은 3.4%로 분석치가 매우 안정하였다. 본 연구에서 개발한 fumonisin 분석용 ELISA system은 수입 및 국내산 농산물로부터 이 독소의 정제없이 손쉽게 다량의 시료를 일차로 분석하는 데 유용할 것으로 판단된다.
Shiga-like toxin-II(SLT-II)-producing Escherichia coli 0157 : H7 strain B2387이 분비하는 SLT-II가 gnotobiotic자돈에서의 뇌혈관 병변을 일으키는 pathogenesis에 관해서 실험을 했다. 제왕절개 수술로 태어난 자돈들을 두 그룹으로 나누어서, 한 그룹에는 SLT-II 중화항체를 포함한 혈청을 구강을 통해서 수동면역을 시키고, 또다른 한 그룹에는 SLT-II 중화항체가 포함되어 있지 않은 혈청을 구강을 통해서 수동면역시켰다. 24시간후 두 그룹 모두에게 SLT-II producing Escherichia coli O157 : H7 strain B2387를 구강으로 접종했다. SLT-II 중화항체가 포함되어 있지 않은 혈청으로 수동면역시킨 그룹의 자돈들은 설사와 맹결장염, 신경증상, 뇌혈관병변을 일으키고, plasma의 prostacyclin의 level이 증가했다. 하지만 SLT-II 중화항체가 포함되어 있는 혈청으로 수동면역시킨 그룹의 자돈들은 설사와 맹결장염은 유발했지만, 신경증상과 뇌혈관병변은 관찰되지 않았고, prostacyclin의 level도 증가하지 않았다. 이런 실험결과는 SLT-II 중화항체는 뇌혈관병변은 방어하지만 맹결장염은 방어하지 못한다는 의미를 나타내며, prostacylin의 증가는 뇌혈관의 endothelium의 병변을 의미한다.
국내에서 발생하고 있는 닭 질병 중에서 심각하게 경제적인 피해를 일으키는 질병들은 주로 온도가 낮은 시기에 집중되어 있다. 하절기에는 몇몇 세균성 질병을 포함하여 고온다습한 환경 조건에 닭이 노출됨으로써 오는 일사와 열사병, 곰팡이 독소 중독증 그리고 가금티푸스를 포함한 몇몇 세균성 질병 등이 주를 이룬다. 그러나 간과해서는 안 될 것은 여름철이라고 해서 환절기와 동절기에 바이러스성 질병의 발생이 없는 것이 아니라 사육환경이 좋아짐으로써 질병의 증상이 잘 드러나지 않고 피해가 나타나지 않을 뿐 각종 질병의 발생이 계속되고 있다는 사실이다. 더위는 털이 많은 닭에게 있어서 분명 견디기 힘든 환경일 것이다. 더위로 인해 겪는 계군의 피해는 사료섭취 감소, 산란저하, 난중감소, 난각질 저하, 부화율 저하, 사료효율의 저하와 스트레스 호르몬의 분비에 의해 성장저하 및 면역시스템에 좋지 않은 영향을 주어서 질병에 대한 감수성이 높아지게 만든다. 계군이 더위를 잘 이기게 해주는 일련의 관리방법들은 계군에 대한 스트레스를 감소 시켜주어 결국은 닭의 면역시스템을 보호해 주는 넓은 의미의 질병 예방 관리라 할 수 있을 것이다. 7월의 폭염을 계군이 효과적으로 이길 수 있게 해 주는 일반적인 관리방법들을 나열해 본다.
보툴리눔 신경독소는 콜린성 신경말단(부)을 선택적으로 공격하여 신경마비를 일으키는 신경독소로서, 그람양성을 띠고 내성포자를 형성하는 절대혐기성 세균인 보툴리눔 균(Clostridium botulinum)이 만들어낸다. 이 중 보툴리눔 A형 독소(BoNT/A)는 음식물과 물을 오염시킬 수 있으며 생물 무기나 생물 협박물질로 사용될 수도 있다. 이 때문에 독성을 탐지할 수 있는 예민한 분석방법과 중독을 치료할 수 있는 효능 있는 항독소를 개발해낼 필요성이 제기되어 왔다. 본 연구에서는 BoNT/A를 중화할 수 있는 단일클론 항체(mAb)를 생산하기 위하여 BoNT/A로 면역된 토끼의 항혈청에서 유래한 scFv 라이브러리를 인간 IgG와 융합시켰다. 그렇게 재조합된 scFvIgG 항체 단백질을 안정된 세포주에서 발현시켰고 항체 친화 크로마토그래피를 사용하여 scFvIgG mAb 단백질을 정제하였다. ELISA로 정제된 scFvIgG mAb 단백질의 효율성을 확인하였고, in vivo 실험으로 BoNT/A에 대한 중화능을 시험하였다. 독성 중화능 실험은 마우스를 사용하여 수행하였는데, 그 결과 scFvIgG 항체(10 ug)는 BoNT/A(100,000 $LD_{50}$)의 독성이 주입된 마우스를 완전히 방어하지는 못하지만 마우스의 생존 기간을 현격하게 연장시키는 것이 확인되었다. 이러한 결과들은 이 scFvIgG mAb가 BoNT/A를 중화하는 효능을 가지고 있다는 점을 제시한다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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