본 연구는 농산물 수입개방으로 우리농산물의 고부가가치 창출에 힘써야 하는 이때에 비만인구의 증가과 이에 따른 순환기계질환의 심각성을 인식하고 예부터 기호식품이나 대용식량으로 널리 이용되어 왔던 밤을 이용하여 기능성식품으로서의 가치를 알아보고자 하였다. 실험은 일주일에 5번씩 총 5주 동안 5주령의 수컷 SD rat를 대상으로 밤시료를 경구투여하였다. 실험군은 음성대조군(non chestnut group), 과육 저용량 투여군(0.16 g/kg), 과육 고용량 투여군(0.5 g/kg), 과육내피 저용량 투여군 (0.16 g/kg), 과육내피 고용량 투여군(0.5 g/kg)으로 구분하여 지질대사와 항혈전능에 미치는 영향을 비교 분석하였다. 실험결과 랫드의 체중증가량과 상대장기중량에서 통계학적으로 유의적인 변화가 관찰되지 않았지만, 사료섭취량과 체중증가량을 이용하여 각 군의 5주간 식이효율을 구해보았을 때 과육 저용량군의 식이효율이 대조군의 식이효율보다 유의적으로 감소하였다. 혈청 중 triglyceride, free fatty acid의 수치는 과육내피 고용량군을 제외하고 대조군에 비하여 감소하는 경향을 나타내었으며, total lipid의 수치는 모든 투여군이 대조군에 비하여 감소하였고 특히 과육 저용량군, 과육 고용량군, 과육내피 저용량군에서 수치가 유의적으로 감소하였다. 한편, glucose의 수치는 대조군에 비해 과육 고용량군, 과육내피 고용량군에서 유의적인 증가를 관찰할 수 있었다. 혈청 total cholesterol과 HDL-cholesterol의 수치를 이용한 Atherogenic index 즉, 동맥경화지수는 대조군과 비교하여 봤을 때 모든 투여 군에서 증가하는 경향을 보였지만 특히 과육 고용량군과 과육내피 고용량군의 수치가 과육 저용량군과 과육내피 저 용량군의 수치보다 높은 것으로 나타났다. 이상의 결과를 종합해 봤을 때 내피를 함유한 식이보다 과육만을 함유한 식이가 랫드에서 지질대사와 항혈전능에 긍정적인 영향을 미치는 것으로 나타났다. 따라서 우리나라에서 대량으로 생산되고 있는 밤나무 열매의 과육이 기능성 건강식품의 소재로 이용될 수 있는 적절한 물질이라 판단된다.
연구배경: 호중구는 급성염증이 있을 때 존재하는 제일 많은 세포로서 폐의 염증이 있을 때에도 말초혈액에서부터 이동됨과 동시에 활성화된 호중구에서 분비하는 단백분해효소, 산화물 및 여러 가지 cytokine등에 의해 염증이 더욱 심해지고 호중구의 이동이 더욱 증가되는 것으로 알려져 있다. 호중구의 이동을 증가시키는 물질로 현재까지 LTB4, PAF, C5a, fMLP, TNF, IL-8 등이 밝혀져 있으며 특히 IL-8은 chemokine이라고 부르는 조그만 cytokine에 속하며 GRO/MGSA는 IL-8과 같은 C-X -C subgroup에 속하는 단백질로서 이 유전인자는 PF-4, IL-8등과 같은 chromosome 4q12-q21에 위치한다. IL-8이 호중구의 이동 및 활성화에 강력한 영향을 미치는 것은 잘 증명되어 있지만 같은 C-X-C subgroup에 속하며 최근에 발견된 GRO/MGSA의 기능 및 발현과정 등에 대해서는 잘 밝혀져 있지 않다. 내피세포는 TNF$\alpha$나 IL-1$\beta$ 등의 자극을 받으면 호중구의 유착을 돕는 접착분자 및 IL-8등의 생성이 증가되는등 염증반응에 능동적인 역할을 한다고 밝혀지고 있다. 저자들은 인체의 제대정맥에서 내피세포를 분리하여 TNF나 IL-1로 자극을 가하였을때 호중구의 이동을 증가시키는 IL-8이나 GRO/MGSA mRNA의 발현과 분비가 일어나는지 또한 호중구 화학주성에 미치는 각각의 기여도를 비교, 관찰하고자 하였다. 방 법: 제대정맥에서 내피세포를 분리, 배양하고 여기에 TNF-$\alpha$ IL-1$\beta$ 등을 0.2, 2, 20 ${\mu}g/ml$ 농도로 자극을 가하고 1, 4, 8, 24 시간이 경과하여 IL-8 및 GRO/MGSA mRNA의 발현을 RT-PCR로 관찰하고, 배양상층액내 IL-8 및 GRO/MGSA의 양을 ELISA로 측정하였으며 상층액의 호종구 화학주성 활성화도를 Neuro Probe 48 well chemotactic chamber를 이용하여 측정하였다. 결 과: 제대정맥 내피세포에 TNF-$\alpha$ 및 IL-1$\beta$로 자극하였을 때 내피세포에서의 IL-8 mRNA는 1 시간후부터, GRO/MGSA mRNA의 발현은 4 시간후부터 각각 관찰되었으며 TNF-$\alpha$ 및 IL-1$\beta$의 자극농도에 따른 뚜렸한 차이는 없었다. TNF-$\alpha$ 및 IL-1$\beta$로 자극한 내피세의 배양상층액에서 측정한 IL-8도 1시간후부터 현저히 증가되었고 GRO/MGSA의 양은 4시간후부터 현저히 증가되어 있었다. TNF-$\alpha$ 및 IL-1$\beta$로 자극한 내피세포의 배양상층액의 호중구 화학주성활성화도는 각각으로 1시간 자극 후에 현저히 증가되어 있었다. 결 론: 이상의 결과에서 제대정맥 내피세포를 TNF-$\alpha$ 및 IL-1$\beta$로 자극시 IL-8 및 GRO/MGSA mRNA 발현 및 단백이 분비되며, 특히 IL-8은 1시간 후에 GRO/MGSA는 4 시간후에 각각 증가되고 호중구화학주성활성화는 1시간후부터 최고치로 증가됨을 관찰하여, GRO/MGSA보다는 IL-8 이 호종구유주인자로서의 중요한 역할을 할것으로 생각된다.
내피세포가 제거된 토끼의 적출 장간막 동맥에서 토끼의 대동맥 내피세포로 부터 A23187과 acetylcholine은 NO와 유사한 혈관 이완성 물질 (EDRF)을 유리한다. 이에 첨가하여 A23187은 acetylcholine과는 달리 superoxide anion에 의하여 파괴되지 않는 EDRF도 유리시킴을 확인하고 이의 특성에 대하여 연구하였다. 정상적인 생리영양액에서는 A23187과 acetylcholine의 용량-반응 곡선은 내피세포에 의존하지 않는 sodium nitroprusside의 곡선과 유사하였다. 이들은 methylene blue에 의하여 억제되었다. Hypoxanthine (HX)과 xanthine oxidase (XO)를 bath내로 투여시 phenylephrine에 의한 수축이 일과성으로 증가한 후 지속적으로 이완되었다. HX-XO 반응중에는 A23187은 장간막 동맥을 즉각적으로 이완시켰으나 acetylcholine의 이완작용은 소실되었다. A23187에 의하여 야기되는 장간막동맥의 이완은 50 mM $K^+-PSS$로 수축을 야기시켰을 때에는 나타나지 아니하였다. Superoxide dismutase를 전처치하였을 때는 HX-XO 반응중에도 acetylcholine 뿐만아니라 A23187에 의한 장간막 동맥의 수축은 이완되었다. 한편, acetylcholine에 의하여 야기되는 장간막 동맥의 이완은 A23187에 의하여 야기되는 이완에 비하여 phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)에 훨씬 더 민감하게 억제되었다. 내피세포의 기능과는 무관한 sodium nitroprusside에 의하여 야기되는 이완은 PMA에 의하여 영향을 받지 아니하였다. 이상의 결과로 미루어 볼때, A23187과 acetylcholine은 methylene blue에 의하여 억제되는 내피세포 의존성 이완을 야기시키고, 첨가하여 A23187은 어떤 병적 환경 아래서는 superoxide anion과 PMA에 저항성을 지닌 혈관이완성 물질을 유리하는 것으로 사료된다. 앞으로 A23187에 의하여 유리되는 혈관 이완성 물질이 superoxide anion에 의존하여 생성된 것인지에 대하여는 추후의 연구과제이다.
이 실험에서 뇌졸중, 심혈관계 질환 등에 대해 치료 활성이 기대되는 플로레틴(phloretin) - 사과나무 잎과 개살구의 주성분 - 에서의 쥐의 대동맥에서 ROCK(Rho연관 인산화효소) 불활성화를 통해 혈관수축을 억제한다는 기전을 확인하고자 한다. 개체에서 분리되고 내피가 유지되거나 손상된 동맥의 고리 조각은 2개의 금속 고리로 근운동기록기(myograph) 수조 안에 현수되었고 아래쪽 고리는 수조바닥에 고정되었고 위쪽 고리는 등장력 변환기에 연결되었고 등장력 변환기의 전기적 신호는 생리측정기에 표시되었다. 재미있게도 플로레틴은 수축약 (fluoride, phorbol ester)에 의한 혈관 수축을 억제하여 ROCK 또는 MEK(마이토겐 활성화 단백질 키나제 키나제) 비활성화 같은 경로가 혈관이완에 관여할 수 있음을 보였다. 따라서 phloretin은 내피가 완전한 혈관에서의 내피에 의존적인 작용 외에 추가적으로 내피에 비의존적으로 평활근에서 ROCK 또는 MEK 활성 감소에 참여하여 결과적으로 평활근에서 액틴-미오신 상호작용을 억제하여 혈관을 이완하는 것으로 관찰되었다. 또한 phloretin은 thromboxane A2 유도수축을 억제하고 ROCK 및 MEK 억제를 포함하는 기전있음을 주장합니다.
혈관신생의 억제는 암과 같은 신생혈관형성 질환의 치료를 위해 유용한 접근법이다. 신생혈관형성의 핵심인자인 혈관내피세포성장인자는 신생혈관형성 질환의 치료를 위한 주요한 표적이다. 그러므로, 본 연구에서는 in vitro 분석과 ex vivo 동물 실험을 통해 황금 열수추출물의 신생혈관형성 억제효과를 연구했다. 본 연구결과에서 황금 열수추출물이 혈관내피세포성장인자에 의해 자극된 혈관내피세포에 있어 세포독성 없이 세포의 이동, 침투, 관형성을 농도 의존적으로 억제하였다. 더 나아가 황금 열수추출물은 혈관내피세포성장인자에 의해 유도된 흰쥐 대동맥 주변 미세혈관 발아를 예방하였다. 본 연구결과들은 황금 열수추출물이 신생혈관형성 억제작용이 있고, 이는 혈관내피세포성장인자에 의해 유도된 혈관신생을 억제 하는 잠재적 소재가 될 수 있음을 제안한다.
항산화 기능과 면역 억제 기능을 갖는 것으로 알려진 melatonin이 혈관 내피층에서는 어떤 기능을 갖는지 알기 위한 일련의 실험을 수행하였다. 본 연구의 실험 결과, 혈관기능과 관련된 혈관내피세포의 성장, 사멸, 이동에 melatonin은 특이적인 효과를 나타내지 않았고, 백혈구의 혈관내피세포 부착과 백혈구 동종간의 응집에도 melatonin의 역할이 관찰되지 않았다. 이와는 대조적으로 melatonin은 PP2A를 통해 eNOS의 활성을 억제하여 산화질소의 양을 감소시키고, 이로 인해 혈관내피세포의 탈착이 유발되는 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 종합해보면, 혈액 내 고농도의 melatonin은 PP2A 및 eNOS의 활성을 변화시켜 혈관내피세포의 탈착을 상승시킴으로써 혈관내에서 발생할 수 있는 혈전 형성에 의한 병리적 현상을 유발할 수 있다.
은행의 효율적인 내피제거 방법을 연구하고 이들의 저장성을 높이기 위한 방안을 제시하고자 열풍건조 온도 및 시간을 달리하여 은행을 건조하고 이중 90% 이상의 박피율을 보이는 조건에서 물리적, 관능적 특성을 평가하였다. 또한 내피를 제거한 은행을 실온, 냉장 및 냉동온도에 저장한 후 이들의 물리적 및 관능적 변화를 평가하였다. 내피가 제거되지 않은 은행을 $90^{\circ}C$에서 120분, $120^{\circ}C$에서 50분 및 $150^{\circ}C$에서 30분 동안 건조했을 때, 90%이상의 박피율을 보였으며 이들을 증숙하여 물리적 특성을 평가한 결과 $90^{\circ}C$에서 건조한 은행이 다른 시료들에 비해 더 단단했고 건조온도가 증가할수록 총 색, a 및 b 값이 감소하였다. 관능적 특성에서는 $150^{\circ}C$의 은행에서 구운 향미가 강했고 $120^{\circ}C$의 경우 녹색정도와 익은 은행 향미가 높았다. 이상과 같은 결과를 고려하여 $120^{\circ}C$에서 50분간 열풍건조 하는 조건을 은행의 내피제거를 위한 건조조건으로 결정하였다. 내피를 제거한 은행을 진공 포장하여 $25^{\circ}C$에서 저장하고 이들의 경도, L, a 및 b값을 평가한 결과 저장기간이 길어짐에 따라 경도 및 a 값이 증가하였고 L값은 감소하였다. 관능적 평가에서는 저장 4주에 이르러 향미 특성에서 바람직하지 않은 것으로 나타났다. $4^{\circ}C$에서 저장한 은행은 60일까지 물리적 특성에 큰 변화가 없고, 바람직한 정도도 유지되었다. 그러나 저장 80일부터 외관의 바람직한 정도가 다소 감소되는 경향을 보였고, 저장 180일째에는 그 현상이 두드러졌다. 냉동$(-18^{\circ}C)$ 저장한 은행의 경우는 저장기간이 길어질수록 hardness 및 색도가 약간 감소하는 경향을 나타내었으나 바람직한 정도는 10개월까지는 큰 변화가 없었다. 그 이후로 외관을 제외한 모든 특성의 바람직한 정도가 대조군에 비해 크게 감소되었으나 바람직하지 않은 상태(5점 이하)에는 도달하지 않았다.
Plasminogen kringle 5는 plasminogen kringles 1-4로 구성된 내생의 혈관 신생 억제제인 angiostatin과 같이 내피세포의 분열을 강력하게 억제한다고 알려져 있다. 본 연구에서는 plasminogen kringle 5의 재조합 단백질을 효모 발현 체계에서 생산하여 내피세포의 이동에 대한 저해 효과와 이에 대한 작용기전을 조사하였다 재조합 단백질 PK5는 plasminogen의 Thr456에서 Phe546까지 이르는 cDNA 부분을 ${\alpha}-factor$ prepro-peptide의 분비 신호 서열 뒤에 도입하여 Pichia pastoris GS115에서 발현시켰다. 메탄올 유도 후 얻은 배양액을 S-spin column을 이용하여 정제하였다. 정제된 단백질을 SDS-PACE하였을 때 약 10kDa의 단일 밴드를 나타냄을 확인할 수 있었다. 정제된 PK5는 bFGF나 VEGF에 의해 유도된 인간의 제대 유래 내피 세포의 이동을 약 500nM의 $IC_{50}$ 값으로 농도 의존적으로 감소시켰다. 내피 세포에 PK5 500M을 처리한 결과 bFGF에 의해 유도된 ERK1/2의 인산화를 감소시켰다 또한, PK5는 bFGF에 의해 유도된 내피세포의 골격 재형성을 강력하게 억제하는 것으로 관찰되었다. 따라서, 이러한 결과들은 효모 생산 PK5가 내피세포의 이동을 효과적으로 억제하며, 이는 ERK1/2의 활성과 세포골격의 재배열을 억제함으로써 나타나는 것으로 부분적으로 설명될 수 있다.
고칼륨과 저온이 혈관내피세포의 acetylcholine(Ach)에 의한 혈관이완에 미치는 영향을 알아보기 위하여 흰쥐의 흉부 대동맥을 이용하여 Ach과 sodium nitroprusside(SNP)에 대한 이완 반응을 측정하였다. 실험은 다섯 군으로 나누어서 실시하였으며 각 군을 10례로 하였다. 1군은 대조군으로 어떤 조작도 가하지 않고 organ bath에서 등랑성 긴장도를 측정하였고, 2군(내피세포 제거군)은 내피세포를 물리적으로 제거후 1군과 같은 방법으로 긴장도를 측정하였고, 37$^{\circ}C$ 57에 45분간 처리후 혈관의 등장성 긴장도를 측정하였다. 대조군, 457,4mST및 3757군에서의 Ach에 대한 혈관의 이완은 유의한 차이가 없었으며,내피세포 제거군에서는 Ach에 대한 혈관의 이완이 대조군에 비해 현저하게 감소되었으며, SUP에 대한 혈관의 이완은 모든 군에서 유의한 차이가 없었다. 이에 저자들은 다음과 같은 결론을 내릴 수 있었다. 고농도의 칼륨과 저온자체는 흰쥐의 흉부대동맥 내피세포의 Ach에 대한 이완능을 저해하지 않는다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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