• 한국수정란이식학회지
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• 제13권3호
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• pp.277-289
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• 1998

정자의 무분별한 이동을 충분히 억제하면서 운동성을 저해하지 않는 sucrose 층으로부터의 swim-up 분리체계를 구축하기 위하여, 정자의 이동에 장애가 될 수 있는 sucrose 층에 첨가되는 sucrose수준과 정자의 이동과 운동을 극대화시킬 수 있는 배양시간 및 sucrose 이중층의 형태를 조사하였던 바, 얻어진 결과는 다음과 같다. 1. 10mM의 sucrose 층은 정자의 swim-up 이동을 억제하였다. 2. Sucrose 층을 이용하지 않은 swim-up 분리에서 25분간 배양후 회수된 정자의 수가 유의하게 증가되었다. 한편, sucrose 층을 이용한 swim-up 분리에서 10분간 배양후 회수된 정자의 수가 유의하게 증가되었으며 정자의 운동성도 유지되었다 3. Sucrose 이중층 Type I과 Type II 간에 장애효과에는 유의한 차이는 없었으나, 장애공간이 짝은 Type II 이중층에서 시료 채취가 편리하였다. 정자의 주화적 이동과 관련하여 난포액의 기능 을 밝히기 위하여, 난포액의 희석과 열처리 및 난포액으로부터 추출한 단백질과 지질이 Type II Sucrose 층으로부터 10분간 배양한 정자의 swim-up 분리에 미치는 효과를 조사하였던 바 얻어진 결과는 다음과 같다 4. 난포액은 정자의 이동과 운동을 자극하였고 수정능획득정자를 유인하였으며, 특히 10% 난포액에서 수정능획득정자의 유인효과가 가장 크게 나타났다. 5. 저온 열처리 (56$^{\circ}C$, 30분)는 정자의 이동과 운동을 자극하는 난포액의 효과를 감소시키지 않았다. 6. 난포액으로부터 추출한 단백질 성분은 정자의 이동을 자극하였으나, 단백질 성분의 여과는 정자의 이동을 자극하는 단백질 성분의 효과를 감소시켰다. 7. 난포액으로부터 추출한 지질 성분은 정자의 이동과 운동을 유의하게 자극하지 않았다. 8. 난포액으로부터 추출된 단백질과 지질의 병용처리는 정자의 이동과 운동을 자극하는 난포액의 효과를 감소시켰다. 결론적으로 정자의 swim-up 분리에 sucrose 이중층을 이용할 수 있으며, 난포액은 sucrose 층으로부터 정자의 이동과 운동을 자극하고 수정능획득정자를 유인하였다. 특히 열내성을 가진 단백질 성분이 정자의 이동을 자극하였다.

• 한국동물번식학회:학술대회논문집
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• 한국동물번식학회 2001년도 춘계학술발표대회
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• pp.33-33
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• 2001

본 연구는 한우 난포발달에 있어서 난포액 및 inhibin의 생리적 역할을 검토하기 위해 수행하였다. Anti-inhibin serum(AIS) 생산을 위해 사용된 항원은 porcine inhibin-$\alpha$-subunit 19~32의 peptide를 사용하여 adjuvant 용액을 1:3의 비율로 혼합하여 앙고라종 토끼 5두(체중 2.5kg)에게 주 2회 간격으로 8회 실시후 ELISA Leader로 항혈청의 역가를 확인하였다. 난포액(bFF; bovine follicular fluid)은 도축장에서 도축되는 한우 난소로부터 직경 1.0cm 이하의 난포로부터 회수하여 스테로이드를 제거하기 위해 10% chacoal solution(50 mg/$m\ell$, Norrit-A, Fisher Sci., USA)을 처리하여 45분간 배양후 원심분리후 상층액을 회수하여 실험에 공시하였다. 과립막세포의 체외배양을 위해 D-MEM용액(10% FCS와 antibiotics를 첨가)을 배양액으로 하여 1 $\times$ $10^{6}$ cells/$m\ell$로 조절하였다. 호르몬은 RIA 및 ELISA법으로 분석하였다. 그 결과 항원-항체반응은 항원처리후 24일째부터 항체가를 확인할 수 있었으며 52일째에서 높은 항원-항체반응을 보였다. 한편, 난포크기별 난포액의 progesterone 및 Estradiol-l7$\beta$을 농도를 분석한 결과, Progesterone 난포크기가 직경 1.0 cm부터 유의적으로 증가하기 시작하여 직경 2.0cm의 난포액에서는 높은 progesterone이 존재하고 있는 것으로 나타났다. 이에 반해, 난포크기별 난포액중 estradiol 17$\beta$농도는 직경 1.0cm구에서 가장 높게 나타났다. 난포직경이 1cm일 경우에 난포액내 etradiol-17$\beta$가 가장 많이 존재하고 있음이 나타났다. 과립막세포의 체외배양에서 배양 24시간에서는 과립막세포의 progesterone분비는 약 40ng/1$\times$$10^{6}$ cell/well/$m\ell$ 전후로 나타났으며 bFF 5%, AI 5% 및 bFF＋AI 첨가구에 따라 유의적인 차이는 없었다 반면에 48시간배양구에서는 24시간에 비해 유의적으로 높게 분비되었으며, bFF 5%처리구와 bFF5%＋AI5%처리구에서는 progesterone을 대조구보다 유의적으로 억제되었으나 AI 5%단독처리구에서는 대조구와 큰 차이가 없었다. 한편, 각 세포질을 SDS-PAGE로 분리하여 nitro cellulose membrane에 transfer하여 Western blotting법에 의해 검토한 결과, 직경 1.0 cm의 성숙난포의 granulosa cell에 특이하게 Inhibin이 존재하고 있음이 확인되었다. 이상의 결과로, 한우에 있어서 성숙난포에 존재하는 Inhibin은 난포발달 및 난포세포의 스테로이드호르몬합성에 중요하게 관여하고 있는 것으로 사료된다.

• 한국가축번식학회지
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• 제16권4호
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• pp.289-299
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• 1993

돼지 난포내의 각 구성분들에 대해 10% SDS-PAGE와 IEF를 이용한 이차원 전기영동을 실시하여 세포 및 난포액 구성분의 구조단백질상을 분석하였다. 난자-난구세포 복합체를 호르몬과 15%의 FCS가 포함된 M16 배양액으로 39$^{\circ}C$, 5% CO2 상태에서 35시간 동안 체외배양하였다. 배양 전후의 난자, 투명대 및 난구세포와 난포 크기별로 회수된 난포액들을 각각 분리 회수하여 구조단백질상을 분석하였으며, Silver 염색과 CBB 염색으로 분석이 가능한 각 구성분의 적정 시료량을 조사하였다. 한편 난포 구성분들에 있어서 난자는 분자량이 25와 114kd, 난구세포는 20, 33, 58, 78 및 112kd, 투명대는 65kd, 그리고 난포액은 18, 76, 92, 152 및 187kd 단백질을 세포특이단백질로 가지고 있음이 확인되었다. 특히 난자의 경우 성숙에 따라 구조단백질상의 변화가 확인된 반면, 난구세포에서는 차이가 없었다. 또한 난포액은 난포의 크기에 따라서는 단백질상의 차이가 없었으나 호르몬 처리 여부에 따라서는 이차원 전기영동상에서 몇가지 단백질에서 차이가 확인되었고, 난포세포들도 폐쇄 여부에 따라 단백질 조성에 차이를 보였다. 따라서 본 실험에서는 전기영동에 필요한 시료의 양과 준비 방법을 확립하여 각 난포 구성분들의 단백질상 분석에 대한 기초자료를 확립하였으며, 이상의 결과는 앞으로 진행될 단백질의 생합성 분석이나 면역화학학적 분석에 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제33권1호
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• pp.53-60
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• 2006

목 적: 보조생식술에서의 정자처리법으로서 인간 난포액을 이용한 swim-down 방법의 유용성을 확인해 보고자 하였다. 연구방법: 분당서울대학교병원 산부인과에서 불임평가 목적으로 정액검사를 시행할 때 정자무력증 (asthenozoospermia, sperm motility < 50%)을 보이는 12명의 남성을 대상으로 하였다. 이들에서 검사 후 남은 정액을 100% 인간 난포액을 이용한 swim-down법과 SpermGrad를 이용한 밀도차 분리법을 적용하여 각각 처리하고 컴퓨터 정액분석기를 이용하여 정액검사를 시행하였다. 결 과: 두 군 모두에서 운동성과 빠른 운동성 정자의 비율, VCL (curvilinear velocity), ALH (amplitude of lateral head displacement)치 및 과활동성 정자의 비율이 통계적으로 유의하게 상승하였고 LIN (mean linearity)치는 유의하게 감소하였다. 100% 인간 난포액을 이용한 swim-down법에서 정자의 운동성이 SpermGrad를 이용한 밀도차분리법에 비하여 유의하게 높게 나타났으며 ($81.2{\pm}4.7$ vs. $67.6{\pm}2.3$, p=0.02), 다른 변수들은 두 군에서 차이를 보이지 않았다. 결 론: 100% 인간 난포액을 이용한 swim-down법은 정자무력증을 보이는 경우 유용한 정자 처리법으로 사료된다.

• 한국발생생물학회지:발생과생식
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• 제7권2호
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• pp.113-118
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• 2003

포유동물의 성숙한 난포의 난포액 속에는 여러 종류의 단백질 분해효소가 있으며 이들은 난포의 형성과 퇴화 및 난자의 성숙과 배란 등의 다양한 변화에 중요한 역할을 하는 것으로 여겨진다. 난포액 속의 단백질 가수분해효소 중에는 serine proteinase가 비교적 잘 알려져 있으나 다른 효소 특히, caseinolytic enzyme에 대해서는 거의 알려져 있지 않다. 본 연구에서는 사람의 난포액을 재료로 하여 caseinolytic enzyme의 존재 여부 및 동 효소의 특성을 알아보고자 하였다. 사람의 난포액과 혈청 그리고 사람의 제대혈을 $\alpha$-casein을 기질로 하는 zymography 방법으로 분석 한 결과 분자량 80 kDa의 매우 강한 caseinolytic activity를 지니는 효소 단백질과 분자량 78 kDa의 비교적 약한 caseinolytic activity를 갖는 단백질 등 두 개의 caseinolytic enzyme이 관찰되었다. 이 caseinase들의 특성을 알아보기 위해 phenylmethylsulfonyl fluoride(PMSF), soybean trypsin inhibitor(SBf), 1,10-phenanthroline, E-64 그리고 ethylenediamine tetraacetic acid(EDTA)를 zymouaphy의 substrate buffer에 처리한 결과 EDTA와 SBTI에 의해서 80 kDa와 78 kDa caseinase의 활성이 억제되었다 이로 미루어 80 kDa와 78 kDa caseinase는 trypsin-like enzyme인 것으로 추측된다. 한편 사람 난포액의 zymouaphy 수행시에 5 mM의 EDTA가 첨가된 substrate buffer에 CaC $l_2$, MgC $l_2$, MnC $l_2$ ZnC $l_2$를 각각 0에서 10 mM의 농도별로 처리한 결과 모두 5 mM 농도에서 가장 높은 caseinase 활성을 보였다. 금속 이온의 첨가없이 EDTA만 처리한 대조군의 경우 caseinase의 활성은 나타나지 않았다. 이로 미루어 80 kDa 및 78 kDa caseinase는 효소 활성을 위해 이가 금속 양이온을 필요로 하는 것으로 여겨진다.

• 한국발생생물학회지:발생과생식
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• 제7권2호
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• pp.105-112
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• 2003

최근 사람의 난포액에 존재하는 gelatinase 중 EDTA처리에 의해 활성이 크게 증가하는 GA110을 발견하였으며, 본 연구에서는 이러한 GA110이 만들어지는 기작을 알아보고자 하였다. 먼저, protein disulfide isomerase(PDI)가 관여하는지 알아보기 위해 PDI 저해제를 처리하여 GA110의 활성을 조사하였다. 난포액에 EDTA를 처리하기 전에 저해제를 첨가하여 반응시키면 저해제 의 농도가 증가할수록 GA110의 활성 이 감소하였으나 반면 72 kDa gelatinase의 활성은 증가하였다. 그러나 EDTA를 처 리 한 후 저해제를 첨가하여 반응시키면 GA110의 활성에 영 향을 주지 못하였다. 다음으로 72 kDa gelatinase로부터 GA110이 만들어지는 과정에 관여하는 효소를 분리하기 위하여 chromatography 방법을 이용하였으며 이렇게 분리한 효소와 기질을 반응시켜 GA110이 만들어지는 것을 확인하였다. 또한 PDI 항체를 이용하여 immunoblotting을 수행한 결과 난포액 내에 PDI보다 분자량은 약간 작지만 항체와 반응하는 단백질이 존재하는 것으로 나타났다. 이러한 결과로 보아 EDTA 처리로 인해 난포액에서 나타나는 GA110은 난포액 내에 존재하는 PDI와 유사한 효소의 활성화로 인해 72 kDa gelatinase 서로간에 이황화 결합이 형성되어 결국 72 kDa gelatinase dimer인 GA110이 만들어지는 것으로 추측된다.

• 한국동물번식학회:학술대회논문집
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• 한국동물번식학회 2003년도 학술발표대회 발표논문초록집
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• pp.68-68
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• 2003

오늘날 형질전환동물의 생산과 같은 생명공학기술의 발달로 인하여 우리나라 재래산양은 그 모델동물로서 번식 생리학적으로 매우 중요한 가치를 지니고 있을 뿐만 아니라 고유의 유전자원 보존 측면에서도 산양복제와 같은 다양한 연구가 절실히 요구된다. 따라서 본 연구에서는 이러한 생명공학기술의 기초자료를 제공하고자 난포란의 활성화 방법과 단위발생란의 체외발달율을 조사하였다. 성숙한 미경산 재래산양을 공시동물로 하여 CIDR를 이용하여 발정동기화를 시켰으며, 과배란 처리는 FSH와 hCG를 이용하여 과배란 처리를 실시하였고 난포란의 회수는 외과적 방법으로 개복하여 난소의 난포로부터 난자와 난포액을 흡입하여 회수하였다 난포란의 활성화 처리는 전기자극법과 약물처리 방법을 사용하였으며, 전기자극방법은 DC 2.36㎸/cm, 17$\mu$sec 전압으로 1회 전기자극을 가하여 활성화를 유도하였으며, 약물처리법은 5$\mu\textrm{g}$/$m\ell$의 ionomycin 용액에서 5min, 1.9mM 6-DMAP용액에서 4시간동안 처리하여 활성화를 유도하였다. 단위발생란의 배양은 10% GS(goat serum)가 첨가된 M16 배양액과 10% FBS가 첨가된 TCM-199 배양액에서 난관상피세포와 6~7일동안 공배양을 실시하면서 체외발달율을 조사하였다. 활성화 방법에 따른 체외발달율은 전기자극 및 약물처리를 하였을때 분할율은 3.1% 및 67.9%였으며, 상실배 및 배반포로의 발달율은 0% 및 7.9%였다. 단위발생란의 체외 발달율은 10% GS가 첨가된 M16 배양액을 사용하였을 때 분할율은 68.0%였으며, 이중 12.0%가 상실배 또는 배반포로 발달하였다. 뿐만 아니라 10% FBS가 첨가된 TCM-199 배양액에 난관상피세포와 공배양을 실시하였을 경우는 72.0%가 분할하였으며, 이중 16.7%가 상실배 또는 배반포로 발달하였다. 이상의 결과로 볼 때 활성화 처리는 ionomycin과 6-DMAP 용액처리가 적합하며, 단위발생란의 체외배양은 보다 적합한 배양조건의 확립이 필요한 것으로 생각된다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제21권3호
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• pp.247-253
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• 2006

본 연구는 안정된 돼지 체외 성숙 난자를 얻을 목적으로 배양액의 종류 및 배양액에 EGF, ${\beta}-ME$, 호르몬 첨가가 돼지 난포란의 체외 성숙에 미치는 영향을 조사하였다. 난포란을 TCM-199, NCSU-23 및 PZM-3으로 48시간 배양했을 때 체외 성숙율은 각각 $22.1{\pm}0.70%,\;30.6{\pm}0.70%$ 및 $30.4{\pm}2.82%$였다. TCM-199로 48시간 배양했을 때 체외 성숙율은 NCSU-23 및 PZM-3 보다 약간 낮은 체외 발생율을 나타냈다. 난포란을 25 ng/ml의 EGF를 첨가한 TCM-199, NCSU-23 및 PZM-3로 48시간 배양했을 때 체외 성숙율은 각각 $46.3{\pm}2.8%,\;76.6{\pm}3.1%$ 및 $72.2{\pm}2.6%$로 나타났다. 난포란의 배양 시 배양액에 25 및 50 ng/ml의 EGF를 첨가 후 48시간 배양했을 때 첨가하지 않은 군에 비해 높은 체외 성숙율을 나타냈다(p<0.05). 난포란을 NCSU-23 및 PZM-3 배양액에 $25{\mu}M/ml$의 ${\beta}-ME$를 첨가한 후 48시간 배양했을 때 체외성숙율은 각각 $43.9{\pm}1.41%,\;41.7{\pm}l.41%,\;44.4{\pm}0.70%,\;40.6{\pm}0.70%$로 나타났다. 난포란을 $25{\mu}M/ml$의 ${\beta}-ME$를 첨가한 NCSU-23로 48시간 배양했을 때 첨가하지 않은 군에 비해 높은 체외 성숙율을 나타냈다(p<0.05). 난포란의 배양 시 NCSU-23에 PMSG, hCG, PMSG+hCG, hCG+${\beta}$-estradiol, PMSG+${\beta}$-estradiol을 첨가 후 배양하였을 때 체외 성숙율은 각각 75.6%, 77.8%, 80.0%, 86.4% 및 84.8%로서 무첨가 군(64.4%)에 비해 높게 나타났다(p<0.05).

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제28권3호
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• pp.173-179
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• 2004

본 연구는 돼지 미성숙 난포란의 유리화 동결액에 노출시 독성과 삼투압 스트레스가 가장 적은 유리화 동결액을 조사하기 위하여 실시하였으며, 그 결과를 요약하면 다음과 같다. 미성숙 난포란을 EFS(40% ethylene glycol +18% ficoll +0.3 M sucrose) 용액, ES(5.5 M ethylene glycol +1.0 M sucrose) 용액, GE(10% glycerol +20% ethylene glycol) 용액에 각각 노출하고 대조구로 아무 처리하지 않은 난포란을 체외성숙하여 관찰한 체외성숙율은 ES 용액과 대조구 에서 EFS 용액과 GE 용액보다 유의적으로 높았으며(P<0.05), 유리화 동결액의 독성에 의한 난포란의 퇴화율은 대조구, ES 용액, EFS 용액, GE 용액 순으로 유의적으로 낮은 퇴화율을 나타내었다(P<0.05). 미성숙 난포란을 EFS 용액, ES용액, GE용액에 각각 노출하고 대조구로 아무 처리하지 않은 난포란을 체외성숙, 체외수정하여 관찰한 정상 수정율은 대조구가 세 종류의 유리화 동결액보다 유의적으로 높았고(P<0.05), 유리화 동결액 간에는 유의적인 차이가 없었다. 다정자 침입율과 난자당 침입한 평균 정자수는 모든 처리구간에 유의적인 차이가 없었다. 미성숙 난포란을 EFS 용액, ES 용액, GE 용액에 각각 노출하고 대조구로 아무 처리하지 않은 난포란을 체외성숙, 체외수정, 체외 배양하여 관찰한 수정 3 일째의 분할율은 ES 용액과 대조구가 EFS 용액과 GE 용액보다 유의적으로 높았으며(P<0.05), 수정 7일째의 배반포 형성율은 모든 처리구간에 유의적인 차이가 없었다. 배양기간 동안 나타난 퇴화율은 대조구가 세 가지 유리화 동결액에 비해 유의적으로 낮았고(P<0.05), ES 용액은 EFS 용액과 GE 용액보다 유의적으로 낮은 퇴화율을 나타내었다(P<0.05).

• 한국발생생물학회지:발생과생식
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• 제6권2호
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• pp.97-104
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• 2002

대부분의 포유동물에서 수란관내로 배란된 난자는 정자에 의해 수정이 된 후 개체발생을 시작한다. 그러나 수정이 되지 못한 난자들은 난구세포와 함께 수란관내에서 퇴화하여 제거되는데, 그 기작에 대해서는 구체적으로 알려져 있지 않다. 따라서 본 연구는 포유동물의 수란관내 물질이 난자-난구 복합체에 미치는 영향을 알아보고자 사람의 난포액과 소의 수란관 조직 추출액을 생쥐의 난자-난구 복합체에 처리하고 난자의 생존율 및 난구세포의 세포자연사(apoptosis)를 조사하였다. 수란관 조직 추출액을 처리한 미성숙난자는 난포액만을 처리한 난자와 비교하여 난자의 성숙률에 차이를 보이지 않았다. 그러나 난구세포에서 난포액만을 처리한 경우 확장을 일으키면서 배양접시 바닥에 붙어서 배양 후 72시간까지 분열 증식을 계속하는 것이 관찰된 반면, 수란관 조직 추출액을 처리한 난구세포는 확장이 억제되며 72시간 배양 후 모두 죽었다. 한편 난포액과 수란관 조직 추출액을 함께 처리한 난구세포는 배양 후 24시간에 화장을 일으켰으나 72시간 후에는 수란관 조직 추출액 만을 처리했을 때 와 마찬가지로 모든 난구세포가 죽었다. 이러한 난구세포의 죽음이 세포자연사에 의한 것인지를 알아보기 위하여 DAPI로 핵을 염색한 후 관찰한 결과 세포자연사의 특징인 응축되고 분절화된 핵을 관찰 할 수 있었고, 특히 수란관 조직 추출액을 처리한 난구세포에서 많이 관찰되었다. 또한 TUNEL 방법으로 세포자연사를 확인한 결과 응축되고 분절화된 핵을 가진 난구세포에서 염색되는 것을 확인하였다. 본 연구의 결과들을 종합해 볼 때 소의 수란관 조직 추출액에 의한 생쥐 난구세포의 죽음은 세포자연사에 의한 것으로 판단되며, 이로 미루어 수란관 조직세포에는 난구세포의 세포자연사를 유도할 수 있는 물질을 포함하고 있는 것으로 사료된다.or teacher educators to re-conceptualize teacher education in Korea. 것이 필요하다.량은 264,000$m^2$, 79,200$m^3$이였으며, 우려기준의 40% 농도 이상의 경우 복원 면적과 물량은 779,000$m^2$, 233,700㎥, 배경치 농도 이상의 복원 목표 설정의 경우에는 각각 969,200$m^2$, 290,760$m^3$ 이였다. 토양오염 우려기준 농도의 40%를 복원 목표로 하는 경우와 배경치 농도를 복원 목표로 하는 경우, 복원 물량은 우려기준 농도를 복원 목표로 하는 경우의 3.0배와 3.7배정도 증가하는 것으로 나타나 복원 목표치 설정시 우려기준 농도의 40%와 배경농도의 차이에 다른 복원 물량의 차이는 적어서, 복원 목표 설정시 배경치 농도로 복원계획을 세우는 것이 가장 바람직한 것으로 판단되었다.amma}$D)안정동위원소값이 광화I시기에는 각각 11∼9.${\textperthansand}$, -92∼-86${\textperthansand}$, 광화 II시기에는 각각 0.3${\textperthansand}$(${\gamma}^{18}O_{H2O}$),-93${\textperthansand}$({\gamma}$D)이며, 리본-호상구조를 보이는 것으로 보아 대봉광상의 광화유체에 대한 기원과 진화과정을 두 가지로 생각할 수 있다. 1) 마그마유체로부터 광화작용이 진행됨에 따라 계속적인 순환수의 혼입이 있었으며 2) 조기 마그마${\pm}$변성유체에서 유체압력의 차에