RNA 함량이 증가되고, 증식속도가 더 빠른 효모 변이주를 선별하기 위해, 모균주 Saccharomyces cerevisiae MTY62 세포에 화학적 돌연변이제인 ethylmethane sulfonate를 처리하여, YPD 배지에서는 잘 자라고 KCl 함유 배지에서는 자라지 않는 변이주들을 선별하였다. 이 변이주들 중 시험관 및 플라스크 배양을 통해 균체농도와 RNA 함량이 모균주 MTY62에 비해 각각 1.5배, 1.3배 증가한 M40-10 변이주를 최종적으로 선별하였다. 변이주 M40-l0을 발효조 회분배양한 결과, 최대비증식속도는 $0.38 h^{-1}$ , RNA 농도는 3210 mg-RNA/1, RNA 함량은 183mg-RNA/g-DCW 값을 보여, 모균주에 비해 각각 23%, 15%, 12%씩 증가하였다. M40-10 변이주를 간헐적 유가배양한 결과, 최대 균체농도는 35.6 g-DCW/1을, 최대 RNA 농도는 5677mg-RNA/l을, RNA함량은 160 mg-RNA/g-DCW을 나타내어 모균주보다 우수하였다. 일정속도의 유가배양에서도 M40-10 변이주의 최대 균체농도는 46.4g-DCW/1, RNA 농도는 6270mg-RNA/1, RNA 함량은 135mg-RNA/g-DCW을 보였다. 이들 유가배양에서 배양 중반기인 20시간 전후에서는 모균주에 비해 변이주의 세포농도는 30%, RNA 농도는 10% 정도 증가되었다. 또한 유가배양 말기까지도 RNA 분해는 거의 일어나지 않아, M40-10 변이주는 산성 RNase 활성이 크게 감소한 변이주임을 알 수 있었다.
관중 에탄올 추출물의 Listeria monocytogenes 5 균주에 대한 최소증식저해농도(MIC)는 $100ppm{\sim}500ppm$이었고, 헥산 분획물의 경우 MIC는 50ppm 이하이었다. 헥산 분획물의 항균 활성물질을 분리, 정제하여 얻은 D8-2-5 획분의 경우는 MIC가 20ppm이었다. 항균활성이 인정된 D8-2-5 획분의 살균 효과를 알아보기 위해 생균수를 측정한 결과 초기 접종균수보다 $4{\sim}6$ log cycle 정도 감소하여 살균효과가 입증되었다. 또한 D8-2-5 획분을 처리한 균체와 처리하지 않은 균체를 투과 전자현미경으로 관찰했을 때 D8-2-5 획분을 처리하지 않은 균체 세포벽의 비정상적인 형태를 관찰할 수 있었다. 또한 관중 헥산 분획물의 항균 spectrum을 관찰한 결과 Vibrio parahaemolyticus와 Bacillus cereus에 대하여 50ppm 첨가 수준에서 균증식을 완전히 억제시켰으며, Staphylococcus aureus의 경우 25ppm 첨가시에도 균증식이 완전히 억제되었다.
Methylobacterium organophilum을 이용하여 메탄올로부터 유가식 배양법으로 고점도 다당류인 메틸란(methylan)의 생산시, 메틸란 배양액의 점성특성과 산소전달속도와 메틸란 생산 수율과의 관계를 조사하였다. 균체 농도의 증가는 배양액의 점성에 거의 영향을 주지 않았으나 배양시간의 경과에 따른 메틸란의 축적은 배양액의 점성특성을 비뉴톤성으로 변화시키며 동시에 급격한 점도 증가를 보였다. 배양시간의 경과에 따른 같은 농도하에서 메틸란의 점도를 측정한 결과 배양시간이 증가함에 따라, 점도가 현저하게 증가 하였고 pseudoplasticity 정도는 약간 증가하였다. 그 원인을 조사하기 위하여 메틸란 구성 성분의 화학조성을 분석 하였다. 구성성분 중의 유기산(pyruvic acid, uronic acid, acetic acid)의 함량이 메틸란 생성 초기인 34시간에 10%에서 배양말기인 72시간에서는 17%로 증가하였다. 즉, (-)전하를 띠는 산의 함량이 증가함으로 인하여 메틸란 분자네 chain간의 전기적 반발로 인하여 수용액 상태에서 메틸란 분자의 hydrodynamic domain의 증가로 추측되었다. 이와같이 메틸란의 농도 증가에 따른 점도의 증가는 배양도중 산소전달속도($k_La$)의 급격한 감소를 초래하여 균체증식과 메틸란의 생산을 감소시켰다. 그러나 균체의 메틸란 생산능력에는 큰변화가 없어 단위 균체당 메틸란 수율(P/X)은 큰 차이가 없었다. 산소전달속도를 증가시키기 위하여 교반속도를 증가시킨 결과 메틸란의 농도, 비생산 속도 및 생산 수율이 거의 비례적으로 증가됨을 확인하였다.
본 연구는 구취생성의 주요 원인균에 대한 nanosilver의 항균효과를 조사하기 위해서 시행되었으며, 이와 더불어 이들 세균의 증식 조건도 함께 연구하였다. 포항공과대학교 나노기술센터로부터 $NANOVER^{TM}$, WA 1000 현탁액을 제공 받아 희석하여 사용하였으며, 공시균으로는 주요 구취생성균으로 알려진 Fusobacterium nucleatum (KCTC 2640), Prevotella melaninogenica (KCTC 3689), Klebsiella pneumonia (KCTC 1560) 3종의 세균류를 한국생명공학연구원 생명자원센터로부터 구입하여 사용하였다. 공시균의 배양에 혐기성세균 배양에 이용되는 tryptone- yeast extract-ammonium acetate(TYA) 배지와 chopped beef meat(CBM) 배지를 이용하였다. 1. 최적배양조건으로 감압배양, CBM 배지가 적당한 것으로 나타났다. 2. 간균인 K. pneumonia에 Nanover(5 및 10 ppm)를 처리하고 주사형 전자현미경으로 균체의 형태를 관찰한 결과는 세균의 생장점 부근에서 세포벽에 손상을 주어 세포벽을 절단하여 다량의 막상 편린을 생성하고 autolysin을 불활성화 시켜 filament형 균체를 형성하여 균의 증식은 일시적으로 억제시킬 수 있었으나 완전히 사멸시키지는 못하였으며, 구취 세균을 전혀 다른 형태로 변화시키는 것으로 나타났다. 그러나 항균제로서의 역할은 가진 것으로 확인되었다.
탄화수소 자화성균인 C. tropicalis와 비(非)자화성인 T. cutaneum의 혼합배양에 있어서 두 효모간의 상호작용을 구명하였다. 즉 본균(本菌)인 C. tropicalis는 n-paraffin을 자화하여 증식하면서 유리지방산을 대사산물로 배양액에 축적하는 동시에 자신이 이 지방산에 의해 생육저해를 받는다. 공생균(共生菌)인 T. cutaneum은 본균(本菌)의 대사산물인 유리지방산을 탄소원으로 생육하므로써 생육저해작용을 해소하여 본균(本菌)의 증식 속도와 균체수율을 향상시키는 commensalistic system을 형성하는 것으로 판단되었다.
낙산균 Cl. butyricum ID의 자가분해 최적 조건과 특징을 조사하였다. 영양세포의 자가분해 최적 pH는 0.05M 완충용액에서 7.0 이었으며, 최적 온도는 37$^{\circ}C$였다. 자가분해 속도는 대수기의 영양세포가 가장 높았으며, 대수기 이후의 영양세포에서는 급격히 감소하였다. 대수기의 영양세포는 0.3M 이상의 NaCl, sucrose, glucose를 포함하는 배양액에서는 자가분해가 일어나 정상적인 증식을 할 수 없었다. 자가분해 효소는 균체내에서 세포벽에 결합된 상태로 존재하였고 배양중 대수 증식기에 체외로 배출되어 배양액에도 존재하였다.
대장균군 및 대장균의 정성실험에 건조필름을 이용할 수 있는지를 평가하였다. 대장균군의 정성실험에 있어서 lactose broth 배양법의 경우는 검출율이 가장 높은데 반하여 비교적 선택성이 낮고, 검출에 48시간이 소요되며, 실험 시마다 배지를 제조하여야 하는 등 번거로운 조작을 필요로 하였다. Desoxycholate lactose agar 평판배양법의 경우는 검출율이 건조필름보다 다소 높지만 유의적인 차이를 보이지 않는 정도이며, 실험시마다 배지를 제조하여 적당한 온도로 식혀서 분주하여야 하는 등 번거로운 조작을 필요로 하였다. 반면에 건조필름을 사용 할 경우는 검출율이 다소 낮지만 시료액의 균체농도가 1 cfu/$m{\ell}$ 이상에서는 E. coli KCCM11234의 경우 34.3%, E. aerogenes KCCM12177의 경우 67.4%, K. pneumoniae subsp. pneumoniae KCCM40890의 경우 58.3%의 검출율을 보이므로, 최대 3개의 배지에 접종하여 실험할 경우 시료 중에 대장균군의 존재 여부를 확인할 수 있는 수준이며, 선택성이 높고, 별다른 준비나 조작을 필요로 하지 않으므로 쉽게 대장균군을 검출하는데 사용할 수 있었다. 대장균의 정성실험에 있어서 EC broth 배양법은 검출율은 높으나 선택성이 떨어지며 실험조작이 번거로운 반면 건조필름법은 검출율이 다소 낮다. 시료액의 균체농도가 1 cfu/$m{\ell}$이상에서는 37.1%의 검출율을 보이므로 3개의 배지에 접종하여 실험할 경우 시료 중에 대장균의 존재 여부를 확인할 수 있는 수준이며, 선택성이 높고, 별다른 준비나 조작을 필요로 하지 않으므로 쉽게 대장균을 검출하는데 사용할 수 있었다. 단지 건조필름법은 균주에 대한 선택성이 높아서 손상된 균체의 검출이 어려웠으며 손상된 균체가 증식하는데 보다 많은 시간이 소요되므로 정확한 실험을 위해서는 대략 36시간 정도의 배양이 필요하였다. 전반적인 상황으로 판단해 볼 때 건조필름은 대장균군 및 대장균의 정성실험을 행하는데 있어서 현장에서도 손쉽게 실시할 수 있는 방법으로 기존의 방법을 대체하여 사용될 수 있을 것으로 판단되었다.
본 연구의 목적은 한국잔디에 발생하는 병해 중 가장 큰 피해를 나타내는 갈색퍼짐병의 생물학적 방제를 위해 새로운 길항 미생물을 분리하고 그 방제효과를 기내 및 생물검정을 통해 확인하는 것이다. 갈색퍼짐병에 항균활성을 갖는 길항미생물을 선발하고자 토양으로부터 미생물을 분리하여 R. solani AG2-2 (IV)와의 대치배양을 통해 61균주를 1차로 선발하였으며, 선발 균주 중 R. solani AG2-2(IV)의 균사 생육 억제력이 가장 큰 3종의 균주 I-009, FRIN-001-1 및 YPIN-022를 최종 길항미생물로 선발하였다. 이들 세 분리균주의 16s rRNA 염기서열을 분석한 결과 I-009와 FRIN-001-1은 Bacillus 속에 속하였고, YPIN-022 균주는 Pseudomonas 속의 미생물로 확인되었다. 배양여액을 이용한 R. solani AG2-2 (IV)의 균체량 측정결과 선발 길항미생물 모두 51.7-63.5%의 균체 증식 억제력을 확인하였다. 장성에서 수확한 들잔디의 일종인 장성중지를 생육상에서 활착시킨 후 조사한 생물검정에서 잔디줄기 위에 균체 발생율은 I-009와 YPIN-022 균주 처리구에서 각각 60.3%와 65.0%로 갈색퍼짐병 병원균 단독처리구에 비하여 28.1%와 23.7%의 병 발생 억제효과를 나타냈으나, FRIN-001-1 균주 처리구는 47.8%의 균체발생율을 보여 비교적 높은 43.0%의 병 발생 억제율을 보였다. 본 연구결과 한국잔디 갈색퍼짐병에 대한 병 발생 억제율이 가장 우수한 선발 길항미생물 균주는 FRIN-001-1였고, 향후 추가적인 포장검증을 통해 한국잔디 이용지역을 위한 생물농약 개발에 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
Katsuobushi에서 곰팡이, 세균, 효모 등 총 70여 균주를 분리하였으며 이중 곰팡이는 가다랑이 추출물에 밀기울을 가한 배지에서 생육이 양호하였다. protease활성이 높고 고미생성도가 적은 균주는 Aspergillus niger로 동정된 OK-63 strain이었으며 배양 6일만에 균체의 최대증식, protease의 최대 효소활성을 나타내었다. 효소정제는 150배 정제, 활성수율은 45%였으며 polyacryamide gel 전기영동에 의해 단일 band로 확인되었다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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