본 연구에서는 유아용 생균제 개발을 위하여 1세 미만의 한국인 유아로부터 Bifidobacterium균을 분리 및 동정하여 생균제 특성이 우수한 균주를 선발하고자 하였다. 20명의 충북지역 유아 분변으로부터 선택배지를 이용한 plate법, 그람염색법을 이용하여 42종의 Bifidobacterium균을 분리하였고, F6PPK test, MIDI 및 PCR 방법을 통해 최종 7종의 Bifidobacterium균을 동정하였다. 동정된 7종의 Bifidobacterium균의 내산성 및 내담즙성 실험을 통하여 높은 효능을 나타내는 B. psedocatenulatum PBH-29와 B. bifidum PBH-30을 선발하였다. 그리고 병원성균 성장억제 실험에서 B. bifidum PBH-30이 Sal. typhimurium과 Staph. aureus에 대하여 B. psedocatenulatum PBH-29보다 효과적인 저해를 유도하였고, 10% skim milk에서도 48시간 동안 배양한 결과, B. bifidum PBH-30이 B. psedocatenulatum PBH-29보다 좀 더 높은 성장능을 나타냈다. 따라서 본 연구에서는 최종적으로 B. bifidum PBH-30을 유아용 생균제 개발을 위한 균주로 선발하였다.
수집균주들의 온도에 따른 특성을 분석하여 비교적 고온에 적응하는 균주를 선발하고 이를 이용하여 백색계동을 육성한 후 이 계통과 기존의 백색품종과의 교잡을 통하여 새로운 품종 '백로'를 육성하였다 백로 팽이버섯의 균사배양 최적온도는 $25^{\circ}C$이나 병재배시 배양온도는 비교적 높은 $18{\sim}20^{\circ}C$이므로 적정 배양일수는 21일로 기존 백색재배종보다 2~3일 빠른 시기에 실시하여야 발이가 균일하다. 자실체발생 적온은 기존품종과 같은 $7^{\circ}C$, 생육온도는 $25^{\circ}C$로 일본계 품종의 버섯 생육온도와 동일하다. 백로팽이는 갈색야생종과 교배로 육성된 계통이지만 자실체의 갓 및 대색깔이 순백계통의 백색이다. 또한 버섯발이가 고르고, 대가 긴 특징을 가진 고품질 다수성 품종으로 갓은 반구형이다. 백로는 기존 백색팽이 품종보다 환기를 더 많이 요구하기 때문이므로 이 품종에 맞는 재배환경으로 재배관리를 조절할 필요가 있다.
최근 기능성 화장품 시장의 증가와 더불어 안전성과 기능성을 가진 제품에 대한 소비자들의 요구가 증대됨에 따라 안전성, 기능성, 안정성을 가진 새로운 기능성 화장품 소재의 개발 필요성이 대두 되고 있다. 본 연구에서는 야생 버섯에 자생하는 균류에 대하여 tyrosinase 저해 활성 및 항산화 활성에 대하여 우수한 기능성을 가지는 균주를 선발 하였으며, 선발된 균주를 동정 후 T. viridescens SW-1으로 명명하였다. 배양 기간별 tyrosinase 저해 활성을 측정한 결과 3일차에서 가장 강한 활성을 나타내었으며, 3일차 배양 상등액을 이용하여 농도별 활성을 측정한 결과 상등액 5% 이상 처리시 94% 이상의 저해활성을 유지하는 것으로 확인 되었다. 상등액을 온도별 처리 후 저해율을 확인한 결과 tyrosinase 저해 활성이 유지되었으며 이에 따라 우수한 열 안정성을 확인 하였다. 세포생존율 측정 결과 10% 상등액 처리시까지 세포 독성이 나타나지 않았으며 세포에서의 멜라닌 함량 조사 결과 10% 상등액 처리시 세포내 27.1%, 세포외 7.5%의 저해율을 확인하였다. 본 연구에서 T. viridescens SW-1 배양 상등액의 세포독성 및 항균, 멜라닌 합성 저해 등의 기능성, 열처리 후 tyrosinase 저해활성 확인을 통한 열 안정성을 확인 하였다. 따라서 T. viridescens SW-1 배양 상등액을 활용한 미백기능성 원료로써 활용 가능성이 높기 때문에 향후 산업화를 위한 연구가 수행되어야 할 것이다.
전국에서 분리한 세균으로부터 항균력이 있는 길항세균들을 먼저 분리한 다음 그중 배양배지 속으로 강력한 항균력을 나타내는 peptide를 분비하는 A405균주를 선발, Biolog System 및 rDNA 염기서열을 이용하여 Bacillus subtilis로 동정하고 이 균주가 생성하는 항균 peptide의 항균력을 조사한 바 Botrytis cinerea, Cercospora sp., Fusarium oxysporum, Penicillium digitatum, Celletotrichum gloeosporioides, Rhizoctonia solani, Pythium ultimum, Pyricularia oryzae등의 식물병원균과 Escherichia coli, Pseudomonas spp. 등의 세균 및 효모인 Candida albicans의 성장도 억제하는 강력한 항균력을 보였다. 또한 이 균주가 생산하는 항균 peptide는 알콜, 아세톤과 같은 유기용매에 내성을 가지고 있었으며 proteinase K와 phenol 처리시에는 항균력이 감소되거나 소실되는 특성을 가지고 있었다. 이 항균 peptide를 SDS-PAGE, Native-PAGE 및 Tris-Tricine 전기영동으로 분자량이 3kDa인 작은 peptide임을 확인하였고 aspartic acid, glycine, serine, glutamine, valine, leucine, isoleucine, proline, tyrocine 등의 9가지 아미노산으로 구성되어 있음을 Amino Acid Analyzer로 확인하였으며 냉동건조한 항균 peptide 50 ug/ml을 체리토마토에 처리하여 과일의 선도유지를 조사한 결과 대조구에 비하여 월등한 선도유지 효과가 있음을 입증하였다.
1) 효모세포벽(酵母細胞壁) 용해활성(溶解活性)이 큰 미생물을 얻기 위하여 baker's yeast-peptone-bouillon agar 평판(平板)배지에서 투명하게 용해된 부위를 형성하는 균주(菌株)를 서울 및 경기지방의 토양 및 하수(下水)시료에서 156개 분리하였고 이들중 활성(活性)이 가장 큰 균주(菌株)로 K-42를 선발하여 Bacillus circulans로 동정(同定)하였다. 2) 균주(菌株) K-42에 의한 효모세포벽 용해효소의 생산을 보면 당류 첨가의 경우 배양 2일째에는 maltose>glucan>xylose>control의 순으로, 3일째에는 lactose>galactose>glucan>control의 순으로 나타났다. 무기 질소원의 경우는 배양2일째 ammonium acetat>sodium nitrate>control의 순으로, 3일째는 ammonium chloride>ammonium oxalate>control의 순으로 나타났으며 milk casein을 제외한 거의 모든 유기질소원은 배양 2일째 활성(活性)의 증가를 보였으나 3일째는 모두 감소하였다. 당류와 질소원의 배합첨가는 상승효과가 없었다. 3) 효소생산에 미치는 당류와 질소원의 첨가 효과는 배양기간 중 pH의 변화와 깊은 관계가 있었는 바 배양중 $pH\;7{\sim}8$을 계속 유지시켜 주면서 당류 또는 질소원을 첨가하면 높은 활성(活性)을 상당기간 계속 유지할 수 있었다. 4) K-42균주(菌株)가 분비(分泌)하는 세포벽(細胞壁) 용해효소의 작용최적(作用最適) 조건은 $pH\;7{\sim}8$, $60^{\circ}C$이었고 열처리(熱處理) 효모세포벽의 용해율은 65%이었다.
생리 및 상업적 응용분야에서 중요한 위치를 차지하는 단백질 분해효소는 펩타이드 결합의 가수분해를 촉매한다. 단백질 분해효소를 생산하는 신규 균주를 분리하기 위하여 부패한 나무로부터 균을 분리하여 1% skim milk가 포함된 LB 배지에서 투명환의 생성 능력이 높은 두 균주 WD12와 WD32를 선발하였다. 선발균주의 동정을 위하여 16S rRNA gene의 염기서열을 결정한 후 GenBank 상에 등록된 서열들과 상동성을 조사한 결과, WD12는 Pseudoxanthomonas mexicana와 97.8%, WD32는 99.8%의 상동성을 보여주었다. 계통적 유연관계를 조사한 결과 이들 균들은 P. mexicana와 P. japonensis와 cluster를 형성하였다. WD12와 WD32는 그람 음성 간균으로 catalase와 oxidase 활성을 보였다. WD12의 경우 P. mexicanna와 달리 malate를 동화할 수 있었으며, D-mannose를 동화할 수 없었다. 두 균주의 최적 단백질 분해효소를 생산하는 온도는 $35-37^{\circ}C$로 나타났으며, 최대활성은 WD12가 656 unit/ml, WD32가 267 unit/ml을 나타내었다.
김치에서로부터 배 파쇄물에서 생육과 산 생성이 우수한 유산균을 선발하였다. 선발된 균주는 Ln. mesenteroides로 동정되었으며, 국립농업과학원 농업유전자원센터에 KACC 91495P로 기탁하였다. KACC 91495P 균주를 배 파쇄물에 접종한 후 pH, 적정산도, 생균수의 변화를 경시적으로 분석하였다. 배양액의 pH는 배양 9시간 이후 pH 4.05로 급격히 감소한 후 배양 18시간에 pH 3.86까지 완만하게 감소하였다. 적정산도는 배양 초기부터 15시간까지 지속적으로 증가하여 1.09% 수준에서 평형을 이루었다. 생균수는 접종 후 9시간까지 급격히 증가하고 그 이후 완만하게 증가하여 배양 18시간에는 $2.9{\times}10^9\;CFU/g$까지 증가하였다. 유기산 농도는 배양시간에 비례하여 증가하여 18시간 배양 후 젖산이 0.213%, 초산이 0.259%, 사과산이 0.217%로 분석되었다. 또한 배 발효액의 총 폴리페놀 함량은 9시간 배양 후 $134\;{\mu}g$ tannic acid/mL에서 $185\;{\mu}g$ tannic acid/mL로 약 40% 증가하였으며 따라서 DPPH radical 소거활성도 향상되었다. 또한 $4^{\circ}C$에서 KACC 91495P 균주에 의한 배 발효물은 약 2주일의 저장기간 동안 pH, 적정산도, 총균수의 변화는 미미하였다.
갈색 팽이균주간의 유전적 특성을 보기 위하여 RAPD를 수행하여 유전적 계통도를 본 결과 85% 수준에서 5개의 그룹으로 구분되었다. 생리적 특성으로는 최적 온도는 $25^{\circ}C$이고, CBFM-002를 제외한 모든 균주가 pH 6.0~7.0 범위에서 균사 생장이 양호하였다. 균사생장은 MCM 배지에서 68.4~83.4 mm로 가장 좋았고 균사밀도는 WA배지를 제외한 모든 배지에서 균사밀도가 높았다. 균총과 자실체 간의 색깔 간에는 일정한 경향을 찾을 수 없었다. 갈색팽이버섯 재배에 적당한 배지 재료를 선발하기 위하여 검토한 결과, 배지별 이화학적 성분 분석에서 T-N은 미송+면실박+비트펄프 (6:2:2)가 가장 많았고, $P_2O_2$, $K_2O$, MgO는 미송+쌀겨(8:2)배지에서 가장 많이 함유되어 있었다. 배지혼용 처리에 따른 균사생장 정도는 CBFM-003, CBFM-007균주 모두 미송+면실박+비트펄프 (6:2:2) 배지에서 균사생장이 빠르고 균사밀도가 높았다. 혼용된 배지로 병재배시 자실체의 갓 직경, 대 직경, 대 길이는 CBFM-003, CBFM-007 균주는 모든 배지에서 비슷한 경향을 보였다. 병버섯 재배에서 배지 혼합비율에 따른 균주간 균사 및 자실체의 생육은 미송+쌀겨 (8:2)보다 미송+면실박+비트펄프 (6:2:2)배지에서 CBFM-003은 156.3 g, CBFM-007은 162.8 g으로 가장 좋은 수량을 보였다. 병재배에서 생육온도에 따른 수량은 $7^{\circ}C$에서 약간 높은 수량을 보였으나, 발이기간 동안 에너지 투입량 등 경제성을 고려하면 CBFM-007은 발이온도 $10^{\circ}C$가 적합한 것으로 판단되었다.
인삼 근권에 존재하는 토양 미생물중 esculin agar법을 이용하여 $\beta$-glucosidase를 생산하는 균주를 분리하고, 다시 ginsenoside $Rb_1$을 선택적으로 분해하는 균주 Gsoil 235를 선발 및 동정하였다. 16S rRNA 염기서열을 sequencing한 후, genebank에서 가장 가까운 type strain을 결정하여 유연 관계를 분석한 결과 Cellulosimicrobium 속의 funkei ATCC BAA-$886^T$(AY501364)와 99.7% 일치하는 균주임을 확인하였다. TSB, LB, NB등 3종류의 배지에서 균의 생장은 접종 후 12-24 시간에서 가장 잘 자라며, TSB>LB>NB의 순으로 잘 자라는 것을 알 수 있었다. ginsenoside $Rb_1$과 8, 24, 48시간 동안 반응시킨 후 TLC로 분석한 결과 NB>LB>TSB순으로 $Rb_1$ 분해 활성이 뛰어나 배지의 생장과 대조적인 결과를 얻었다. 반응시간이 증가할수록 Rd를 포함한 minor ginsenoside의 생성이 증가하였으며, 특히 다른 배지에 비해 균주 생장속도가 상대적으로 낮은 NB는 48시간 후 $Rb_1$을 거의 분해하여 강한 효소 활성을 확인할 수 있었다.
서류 및 각종 퇴비를 분리원으로 하여 전분 이용성이 좋은 균주는 분리하였고 이 균주를 이용하여 균체 및 지방질을 가장 많이 얻기 위한 최적 배양조건을 구명한 결과는 다음과 같다. 1. 선발된 우수 균주는 Mucor plumbeus로 동정되었다. 2. 이 균주는 전분을 탄소원으로 이용하여 그 함량이 21%일 경우 배양 20일 째에 균체량은 배지 50$m\ell$당 2.09$\pm$0.24g이고 지방질량은 건조 균체 당 37.43%이었다. 3. 질소원으로서는 질산나트륨, 질산칼륨, 질산마그네슘, 요소, 및 초산암모늄 중 요소를 이용하는 경우 균체 및 지방질 생산량이 가장 높았고 그 최적 농도는 2.14g/$\ell$으로 배양25일에서 균체량은 배지 50$m\ell$당 2.39$\pm$0.07g 지방질 함량은 건조균체당 50.73%이었다. 4. 무기질원으로 황산아연. 황산마그네슘, 인산이수소나트륨. 황산칼륨 및 염화제 2 철은 모두Mucor plumbeus FRI 0007 생장에 필요하나 필수적으로 요구되지는 않으며 황산칼륨을 0.44g/$\ell$ 혹은 황산마그네슘을 5.00g/$\ell$ 만을 첨가하는 경우에 소비 전분량에 대한 지방질 생산률은 14.96 및 15.37, 균체 생산률은 31.12 및 26.10으로 다른 처리구 보다 높았다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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