이 연구의 목적은 자연 천연한 청국장에서 분비되는 혈전용해효소를 생산하는 Bacillus Iicheniformis HK-12의 혈전용해활성과 특성을 조사하기 위하여 실시한 것이다. 먼저 균주 HK-12의 생리생화학적 특성에 대하여 조사하였다. BIOLOG GP2 MicroPlate system과 16S rRNA 염기서열 분석을 통하여 균주를 동정하였고, 그 결과 Bacillus licheniformis로 확인되었고, B. licheniformis HK-12로 명명하였으며, 이 균주는 GenBank에 [Eu288193]로 등재하였다. 16S rRNA 염기서열 분석에 근거하여, B. licheniformis HK-12의 계통수를 작성하였다. B. licheniformis HK-12의 배양기간동안 세균의 생장, 혈전용해활성, pH의 변화를 모니터링하였다. 36시간배양 후, 배양의 최대 혈전용해활성은 대조군으로서 플라스민과 비교하여 약 2.25배로 나타났다. 혈전용해활성과 관련하여, B. licheniformis HK-12의 생장에서 최적 pH와 온도는 각각 초기 pH 7.0과 40$^{\circ}C$로 나타났다.
국내 시판 무 (Baekwoon) 의 씨앗으로부터 항 진균 단백질들을 (RAP-l,2)분리 하였으며[12] 이들 항 진균 단백질을 MALDI-TOF실험결과, 2S storage albumin, Rs-AFP등 지하부 식물의 defensin protein과[15] 일치함을 확인하였고 이에 시판되는 7종의 각각의 무 씨앗으로부터 조 단백질과 Total RNA를 분리 하여 항 효모 (Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans.) 및 항 곰팡이 (Botrytis cenma)에 대한 항 진균성을 실험한 결과 항 곰팡이 활성은 모든 품종에서 보였으나 항 효모 활성은2 종 (Myungsan, Baekwoon) 의 무에서만 보였 다 . 또한 기존에 알려진 항 진균 단백질 (Rs-AFP)의 유전자를 Gene Bank/EMBL 에서 획득하여 씨앗으로부터 분리한 Total RNA 에 RT-PCR 한결과, 7종 중 2종은 0.2kb 의 산물이 보이지 않았다. 이들 Ks-AFP 유전자산물을 염기서열을 분석하였으며 이 염기서열에서 얻어진 아미노산 서열을 Clustal W를 이용한 pairwise alignment 분석에 의해 국내 시판 무 의 품종간 각clone의 계통수를 분석한 결과를 보고한다.
trnL-F 지역은 엽록체 게놈 large single-copy 지역에 위치하며, trnL gene, trnL intron, trnL-F IGS로 구성된다. 본 연구는 한국산 꿩의다리속 내에서 trnL-F 지역의 분자진화와 유연관계를 분석하였다. 갭형질을 이용한 자료의 베이시안과 파시모니 분석에서 몇몇 indels evolution는 분계조를 지지하여 해상력이 좋은 계통수가 나타났다. 한국산 꿩의다리속 내에 cpDNA trnL-F 지역의 indel events는 계통학적으로 유용한 정보를 가지고 있는 것으로 판단된다. 산꿩의다리절(그늘꿩의다리 제외)은 속내에서 가장 먼저 분기한 것으로 나타났고, 나머지 절은 강하게 분계조를 형성하며 분기하였다. 한국산 꿩의다리속 내에 trnL-F 지역은 뉴클레오티드의 다양한 공간적 분포 변이와 주로 transversion에 따른 염기치환 등 다양한 진화적 패턴을 가지고 있었다.
Sphingomonas chungbukensis DJ77의 유전체 서열분식 과정에서 969개의 nucleotide로 구성된 sphingosine kinase 유전자를 동정하였다. 이 sphingosine kinase 단백질의 아미노산 서열은 Zymomonas mobilis subsp. mobilis ZM4의 sphingosine kinase 아미노산 서열과 $55\%$의 상동성을 보였다. 또한 다중서열정렬을 통해 각각 진핵세포의 sphingosine kinase의 C2, C3, C5 domain에 속하는 3개의 conserved sequence를 발견하였다. 그 중 하나는 sphingosine kinase에서 ATP-binding site일 것으로 예상되어지는nucleotide-binding motif(GGDG)였고 나머지 둘은 아직 기능이 알려지지 않은 conserved sequences 였다. 이러한 다중서열정렬을 바탕으로 계통수를 그려본 결과, S. chungbukensis DJ77의 sphingosine kinase (SPK)는 COG1597 그룹과 유사했으며, COG1597 내에서 동일종의 diacylglycerol kinase와는 서로 다른 그룹에 속하는 것으로 나타났다. 재조합 SPK는 이종(異種)세포인 Escherichia coli내에서 성공적으로 과발현 되었으나, 세포 내에서 불용성 복합체(inclusion body)를 형성하였다.
S. chungbukensis DJ77로부터 16S rRNA유전자의 염기서열을 분식하였다. 염기서열은 총 1,502 bp로 2000 년에 등록된 부분 서열(1,435 bp)보다 5' 방향과 3' 방향으로 29 bp와 37 bp 길이만큼 각각 확장하였으며, 1 bp가 추가로 삽입되었다. E. coli의 16S rRNA유전자를 모델로 이차구조를 제작하였으며, 네 부위가 특이적임을 발견하였다. Sphnigomonas spp.의 16S rRNA 서열과 S. chungbukensis DJ77의 다중서열검색 결과, Sphingomonas종에서만 나타나는 보존부위와 가변부위를 발견할 수 있었다. 특히, Campylobacter jejuni에서만 나타나는 것으로 알려진 긴 stem loop구조가 서열은 조금 다르지만 구조적 일치를 보이는 유사한 구조를 S. chungbukensis DJ77에서도 발견하였다. 결과적으로, 다중서열검색을 통해 제작한 계통수와 nucleotide signatures분석에 근거하여 S. chugukensis DJ77을 cluster II (Sphingobium)로 분류하였다.
두툽상어 (Scyliorhinus torazame)부터 분리된 항산화 효소 Cu,Zn-superoxide dismutase (Cu,Zn-SOD 또는 SOD1)의 핵산 염기서열 및 추정 아미노산 서열을 대상으로 분자 계통학적 분석을 실시하였다. 종래 알려져 있는 척추동물의 Cu,Zn-SOD 서열들을 포함하여 neighbor-joining (NJ), maximum parsimony (MP), maximum likelihood (ML) 및 Bayesian 분석 등을 포함한 다양한 계통 분석을 수행하였으며, 이를 통해 연골어류인 본 어종의 척추동물 분류군 내에서의 계통적 위치를 추정하고자 하였다. 다양한 분자 계통수로부터 얻어진 대부분의 consensus tree들에서 분석에 사용한 분류군들은 종래 알려진 분류학적 위치와 비교적 잘 일치하였고, 이중 두툽상어는 같은 연골어류종인 blue shark와 높은 유연관계를 나타내면서 보다 진화한 경골어류들과는 확연히 구분되는 분지를 형성하였다. 특히 핵산 염기서열을 바탕으로 한 neighbor-joining 분석에서 두툽상어는 경골어류와 양막동물에 비해 보다 원시형태의 척추동물 Cu,Zn-SOD 유전자의 한 형태를 보유하고 있는 것으로 나타났다.
본 연구는 2000년 7월에 전남 장흥군에서 채집한 불가사리의 장내에 존재하는 종속영양세균의 다양성에 대해서 알아보았다. 불가사리 장내에 존재하는 균체수를 측정하였으며, 순수 분리된 균주를 대상으로 16S rDNA 증폭기법을 이용하여 세균의 다양성을 조사하였다. 불가사리 장내에 분포하는 종속영양세균의 균체수는 8.65${\pm}$0.65${\times}10^3\;dfu\;g^{-1}$이었다. 29 균주의 세균이 순수 분리되었으며, 그 중 그람양성 세균은 분리된 균주의 59% (17균주)를 차지하였다. 불가사리 장내에서 분리된 균주는 Bacillus속, Microbacterium 속, 그리고 Marinobacter 속 등이 우점이었으며, 이외에도 Staphylococcus 속, Psychrobacter 속, Paracoccus 속, Erythrobacter 속, Zoogloea 속, Kocuria 속과 Arthrobacter 속 등이 포함되었다. 분리된 균주 가운데 Bacillus 속에 속하는 8균주 중 3균주는 type strain과 97% 이상의 유사도를 보인 반면, 5 균주는 유사도가 90%로 비교적 낮은 유사도를 보여 현재까지 알려지지 않은 신종일 가능성이 높다고 하겠다.
피나무속 식물은 화경의 아래에 부착된 선형의 포를 특징적으로 가지고 있으며 이러한 형질은 아욱과의 다른 속과 구분된다. 본 연구는 피나무속의 종간 계통학적 유연관계를 규명하고자 하였다. 계통학적 분석은 한국과 일본의 피나무속 10종, outgroup으로 멕시코목화를 선정하여 수행하였다. nrDNA의 ITS와 cpDNA의 trnL-F, rpl32-trnL의 염기서열을 확보하여 분석하였다. ITS, trnL-F 와 rpl32-trnL의 data를 유합한 결과 계통수는 6개의 분계조로 구성되었다. 구주피나무는 outgroup과 가장 가깝게 나타났다. 피나무 , 뽕잎피나무 그리고 털피나무는 한 분계조를 형성하였다. 연밥피나무, 섬피나무, 일본피나무는 각각 독립적인 분계조를 형성하였다. 섬피나무는 일본피나무와 가장 가까운 관계를 보여주었다. 보리자나무, 찰피나무, 염주나무는 하나의 분계조를 형성하여 서로 근연관계에 있음을 보여주었다.
분자생물학적 자료에 의한 한국산 백합강 식물에 대한 분류학적 재검토를 시도하였다. 2가지의 다른 자료, 즉 엽록체 DNA인 rbcL 및 atpB sequence 자료분석에서 대체적으로 일치하는 계통수를 얻었다. 즉, 한국산 백합강은 Dahlgren 등의 분류체계에 의한 비짜루목, 백합목, 마목의 3목으로 구분되었다. 이중 비짜루목과 백합목의 유연관계를 추론하는 분자생물학적 연구에서 마목의 분류군이 군외분류군으로 사용되었다. 두 엽록체 DNA인 rbcL 및 atpB sequence 분석에서 붓꽃과는 백합과 보다는 비짜루과에 더 가까운 유연관계를 보여주었다. 그러나, 넓은 의미의 Narthecaceae (종전의 Melanthiaceae [국명부재]에 속한 분류군)는 비짜루목이나 백합목에 속하는 분류군들과 가까운 유연관계를 보이지 않았다. 이전의 은방울꽃과 [Ruscaceae] 내에 취급되었던 애기나리속, 나도옥잠화속, 죽대아재비속 등은 각각 Colchiaceae, 백합과, Caloghortaceae로 이전 되어야 한다는 결론이 내려졌다. 마지막으로 한국산 백합강에 속하는 과의 체계에 대해서 토의하였다.
Racemic epoxide에 대한 입체선택적 가수분해능을 가지고 있는 곰팡이, Aspergillus niger LK로부터 epoxide hydrolase (EH, EC 3.3.2.3) 유전자의 진화적 유연관계 분석을 행하였다. A. niger LK의 EH 염기서열로부터 유추한 EH 단백질 아미노산 서열은 여러 박테리아의 EH들 및 포유동물의 microsomal EH들과 유의적인 유사성을 가지고 있었으며 a/$\beta$ hydrolase fold family에 속하였다. A. niger LK의 EH 단백질의 입체구조예측은 Protein Data Bank에 수록된 lqo7의 3D 결정구조와 90.6% identity를 가지는 것으로 나타났으며 다른 EH들의 아미노산 서열비교를 행한 결과 Asp$^{192}$ , Asp$^{348}$ 및 His$^{374}$ 이 catalytic triad를 구성하고 있는 것으로 추정되었다. 여러 생물종의 EH서열을 기능적 및 구조적 domain 서열을 기초로 하여 multiple sequence alignment를 행하고 Neighbor-Joining/UPGMA method를 이용하여 계통수를 복원한 결과 다른 생물종들의 EH와의 진화거리는 서로 1.841∼2.682로 멀었으나 EH의 기능을 가지기 위한 oxyanion hole 및 a/$\beta$ hydrolase fold family의 catalytic triad는 잘 보존되고 있어 공통조상으로부터 진화되어 왔음을 알 수 있었다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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