• KSBB Journal
• /
• 제19권4호
• /
• pp.327-330
• /
• 2004

Inducible system을 이용하여 (R)-hydroxybutyric acid (R3HB)를 생산하는 재조합 대장균을 개발하였다. Ralstonia eutropha에서 유래한 PHB depolymerase 유전자를 inducible promoter에 의하여 발현되게 만들고, PHB 생합성 유전자가 있는 vector에 cloning하였다. PHB 생합성 유전자와 depolymerase 유전자를 가지고 있는 재조합 대장균을 배양하여 먼저 PHB를 축적시킨 후에 depolymerase를 발현시켜 배지 내로 분비된 R3HB를 확인하였다. 그 결과 축적된 PHB의 대부분은 발현된 depolymerase에 의하여 분해되었으며, depolymerase의 발현 이후에도 재조합 대장균은 PHB를 축적하고 분해하여 R3HB의 농도는 배양시간에 따라 증가하였다. 이러한 결과는 inducible depolymerase를 갖는 재조합 대장균을 이용하여 높은 농도의 R3IB를 얻을 수 있다는 것을 보여준다.

• 한국미생물·생명공학회지
• /
• 제22권6호
• /
• pp.614-620
• /
• 1994

The effects of growth temperature and nutritional components on the synthesis of poly-3-hydroxybutyric acid, PHB, by filamentation-suppressed recombinant Escherichia coli XL1-Blue (pSYL107) were studied. After culturing XL1-Blue(pSYL107) for 48 hours in complex medium at 30$\circ$C, 7Al g/l of PHB could be obtained with the PHB content and PHB yield of 82% and 0.371 g PHB/g glucose, respectively. Lower concentration of PHB(3.2 g/l) was obtained when cultu- red at 37$\circ$C, which seemed to be due to the instability of this strain having amplified FtsZ activity. The PHB concentration of 3.75 g/l was obtained after culturing 60 hours in R medium supplemen- ted with 20 g/l glucose at 30$\circ$C, which was more than twice higher than that obtained with XL1-Blue(pSYL105). This suggested that the enhancement of PHB synthesis by suppressing filamenta- tion was more significant in a defined medium than complex medium. PHB synthesis could be further enhanced by supplementing a small amount of various complex nitrogen sources. When 5 g/l of beef extract was added to a defined medium, PHB concentration, PHB content, and PHB yield obtained after 60 hours of cultivation at 30$\circ$C were 7.46 g/l, 86%, and 0.375 g PHB/g glucose,respectively.

• 한국미생물·생명공학회지
• /
• 제32권3호
• /
• pp.243-248
• /
• 2004

산업적 R3HB의 생산을 위한 재조합 대장균의 pilot규모에서의 유가식 배양과 연속식 배양을 연구하였다. Pilot 규모에서의 R3HB생산을 위하여 안전한 two plasmid system pBRRed와 pMCS 105를 제작하였으며, 제작된 plasmids을 이용하여 여러 다른 대장균을 형질 전환하였다. 얻어진 재조합 대장균들을 30 l의 발효기에서 회분식 배양한 결과 대장균 XL-10 Gold(pBRRed, pMCS105)가 가장 높은 R3HB 농도를 보였다 30 1 발효기에서 대장균 XL-10 Gold (pBRRed, PMCS105)을 유가식 배양한 결과 22.4 g/1의 R3HB가 얻어졌으며, 생산성은 0.97 g/1-h를 보였다. 고농도의 R3HB를 고생산성으로 얻기 위하여 유가식 배양으로 높은 균체 농도를 얻은 후 연속 배양으로 R3HB를 생산하는 전략을 개발하였다. 그 결과 0.2 $h^{-1}$ 의 dilution rate에서 R3HB 생산성은 5.06 g/1-h를 보였다. 이러한 결과는 산업적 규모에서 재조합 대장균을 이용하여 R3HB를 고농도, 고생산성으로 얻을 수 있다는 것을 보여준다.

• 한국식품영양과학회지
• /
• 제31권3호
• /
• pp.475-481
• /
• 2002

분해성 천연 고분자인 PHB와 chitosan을 블렌드하여 필름을 제조한뒤 필름의 결정특성 및 물리적 성질을 측정한 결과 PHB/chitosan 필름의 X선 회절도 측정에서 상대 결정화도는 chitosan의 함량이 증가할수록 낮아졌으며 FT-lR 측정에서는 chitosan 비율이 증가할수록 PHB의 carbonyl기 의 피크가 작아졌다. DSC측정에 의한 필름의 열적 특성에서는chitosan의 첨가로 인해 열안정성과 결정성이 낮아지는 경향을 보였다. 시차주사현미경을 이용하여 관찰한 필름의 표면상태에서는 chitosan의 비율이 증가할수록 입자크기가 감소하는 것으로 나타났다. 필름의 물성은 PHB에 대한 chitosan의 함량이 증가할수록 인장강도와 신장률이 증가하여 chitosan 첨가로 인해 필름의 물성이 향상된 것을 알 수 있었다. PHB/chitosan필름의 색도 측정 결과 PHB에 chitosan의 함량이 증가할수록 L값과 b값은 낮아지고 필름의 투명도는 높아졌다.

• 폴리머
• /
• 제30권6호
• /
• pp.512-518
• /
• 2006

양친성 블록공중합체는 생분해성 고분자인 poly((R)-3-hydroxybutyrie acid), PHB와 친수성 고분자인 poly(ethylene glycol), PEG를 이용하여 제조되었다. 미생물에 의해 생산된 분자량이 수십만인 PHB는 약물전달용 재료로 적합하지 않으므로 산 촉매 가수분해를 통해 분자량이 $3000{\sim}30000$을 가지도록 조절되었다. 공중합체를 수용액에 넣으면, 고분자들은 자기 조립에 의해 친수성인 PEG가 소수성인 PHB를 감싸는 형태의 고분자 미셀을 형성한다. 형성된 고분자 미셀은 생분해성과 생체적합성을 가지면서 생체 내에서 낮은 독성과 환자 친화적인 특성을 가지므로 약물 전달체로의 이용이 가능하다. 양친성 블록 공중합체는 PHB에 PEG를 도입한 것으로 에스테르교환(transesterification) 반응을 통해 유도되었다. PEG는 친수성 블록의 형성과 반응성을 향상시키기 위해 말단의 작용기를 개질한 후 사용되었다. 양친성 블록 공중합체 형성에 대한 열적 특성과 화학적 구조 분석은 DSC, FTIR, $^1H-NMR$을 사용하여 알아보았다. 임계 미셀 농도(critical micelle concentration, CMC)는 고분자 미셀이 형성되는 시점으로 형광 분광기를 사용하여 분석한 결과 $5{\times}10^{-5}g/L$ 부근에서 측정되었다. 수용액 상의 고분자 미셀은 냉동 건조 후, 분말형태의 나노입자를 얻었다. 고분자 미셀의 크기는 dynamic light scattering으로 측정한 결과 약 130 nm 정도로 나타났다. 또한 atomic force microscopy 측정을 통해 크기가 약 130 nm 정도인 구형 입자를 확인하였다. 나노입자가 형성된 고분자 미셀은 소수성 약물을 담지하여 수동적 표적지향형 약물 전달용 수송체로 이용이 가능할 것이다.

• 한국미생물·생명공학회지
• /
• 제28권2호
• /
• pp.71-79
• /
• 2000

Two typess of copolyesters, poly(3-hydroxybutyric acid-co-4-hydroxy-butyric acid)[P(3HB-co-4HB] and poly(3-hydroxybutyric acid-co-3-hydroxyvaleric acid)[P(3HB-co-3HV)], with various monomer ratios and different degree of microstructural heterogeneity were synthesized from Ralstonia eutropha H16 and Hydrogenophaga pseudoflava by using ${\gamma}$-butyrolactone and ${\gamma}$-valerolactone, respectively. The two bacteria showed a large difference in the utilization of ${\gamma}$-butyrolactone for cell growth and PHA synthesis. H. pseudoflava synthesized P(3HB-co-4HB) copolyesters with a wide range of 4HB content from 13 to 96 mol% depending on culture conditions, whiel R. eutropha H16 was able to synthesize the copolyesters containing less than 20 mol% of 4HB. An increase in the 4HB content in the P(3HB-co-4HB) copolyesters synthesized by H. pseud-oflava induced an lowering of their melting temperatures as well as their enthalpies of fusion. The increase in the 4HB content, however, increased the rate of degradation by an extracellular P(3HB) depolymerase. NMR spectros-copy and differential scanning calorimetry showed that the P(3HB-co-4HB) copolyesters from H. pseudoflava were generally microstructurally heterogeneous. The P(3HB-co-4HB) copolyesters) synthesized by R. eutropha H16 were rather random copolymers showing less microstructural heterogeneity than those synthesized by H. pseudoflava. The NMR D value analysis suggested that the monomer distribution of the P(3HB-co-3HV) copolymers from the two bacteria were relatively random.

• 한국생물공학회:학술대회논문집
• /
• 한국생물공학회 2000년도 춘계학술발표대회
• /
• pp.579-582
• /
• 2000

Enantiomerically pure hydroxycarboxylic acids have great potential as chiral building blocks in fine chemicals due to their easily modificable two functional groups. Microbial polyhydroxyalkanoates (PHAs) can have more than one hundred of hydroxycarboxylic acids as monomeric constituents by growing cells under various conditions. All of the monomeric constituents are enantiomerically pure in (R)-conformation if there is a chiral center. Therefore, efficient production of enantiomerically pure hydroxycarboxylic acids by degrading PHAs is possible. In this presentation, we report on the development of a novel method for the preparation of (R)-hydroxybutyric acid by in vivo depolymerization of Polyhydroxybutyrae.

• 분석과학
• /
• 제29권1호
• /
• pp.49-55
• /
• 2016

케톤체는 생체 에너지 생산과정이 탄수화물보다는 지방산의 의존도가 높을 때 생성되며, 과도한 분비는 당뇨병성 케토시스나 선천성 유전성 대사이상질환을 의심할 수 있는 근거가 된다. 따라서 이의 신속 정확한 분석법의 개발이 필요하다. 본 연구에서는 혈장을 제단백한 후 hydroxylamine을 가하여 60 ℃에서 30 분간 반응시켜 oximation 후 BSTFA를 가한 후 trimethylsilylation 유도체화하여 혈장 중에서 케톤체를 신속하게 정량할 수 있는 GC-MS/SIM 분석법을 개발하였다. 케톤체의 직선성의 범위는 0.001-250 μg/mL 이었고, 혈장에서의 검출한계는 0.1 pg 이었다. 직선성을 가지는 범위에서의 상관계수(R2)는 0.998-0.999이었고, 회수율은 1 μg/mL의 표준품을 첨가하였을 때 88.2-92.3 %, 10 μg/mL의 농도를 첨가하였을 때 89.5-94.8 % 였으며 RSD는 6.3-9.4 %였다. 이 분석법을 정상인과 케토시스 환자의 검체에 적용하여 벨리데이션 하였으며, 본 분석방법은 어린이나 성인의 당뇨성 케토시스나 여러 유전성대사질환 환자 중 케토시스를 보이는 환자의 혈장 중 β-hydroxybutyric acid/acetoacetic acid의 비를 계산하여 케톤체를 신속하고 효율적으로 임상검체 분석에 응용할 수 있음을 보여주었다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
• /
• 제7권4호
• /
• pp.229-236
• /
• 1997

A gene, $phbC_{2.4.1}$ encoding poly-3-hydroxybutyric acid (PHB) synthase of Rhodobacter sphaeroides 2.4.1 was cloned by employing heterologous expression in Escherichia coli. R. sphaeroides chromosomal DNA partially digested with MboI was cloned in pUC19 followed by mobilization into E. coli harbouring $phbA,B_{AC}$ in pRK415, which code for ${\beta}$-ketothiolase and acetoacetyl CoA reductase of Alcaligenes eutrophus, respectively. Two E. coli clones carrying R. sphaeroides chromosomal fragment of $phbC_{2.4.1}$ in pUC19 were selected from ca. 10,000 colonies. The PHB-producing colonies had an opaque white appearance due to the intracellular accumulation of PHB. The structure of PHB produced by the recombinant E. coli as well as from R. sphaeroides 2.4.1 was confirmed by [$H^{+}$]-nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. Restriction analysis of the two pUC19 clones revealed that one insert DNA fragment is contained as a part of the other cloned fragment. An open reading frame of 601 amino acids of $phbC_{2.4.1}$ with approximate M.W. of 66 kDa was found from nucleotide sequence determination of the 2.8-kb SaiI-PstI restriction endonuclease fragment which had been narrowed down to support PHB synthesis through heterologous expression in the E. coli harbouring $phbA,B_{AC}$. The promoter (s) of the $phbC_{2.4.1}$ were localized within a 340-bp DNA region upstream of the $phbC_{2.4.1}$ start codon according to heterologous expression analysis.

• 대한유전성대사질환학회지
• /
• 제15권2호
• /
• pp.65-71
• /
• 2015

Since the secretion of specific chiral isomers in urine (or plasma) is very crucial to diagnose some inborn metabolic disorders, clinical application of dual column achiral differential method has been performed for the absolute configuration of chiral compounds. Extracted from the acidified urine with diethyl ether, carboxylic functional group of organic acid (stereoisomers of the volatile) was derivatized with (-)-menthylation or (S)-(+)-3-methyl-2-butylation and followed by O-trifluoroacylation. Each of the enantiomers was accurately separated from the library matched double column (achiral) with a retention index (I). In various inborn metabolic disease urines, absolute chirality was identified correctly in the urine (10 patients) with inborn metabolic disease (including secretion of D, L- lactic acid, D, L-3-hydroxybutyric acid, and D, L-2-hydroxyglutaric acid). In this study, we identified and isolated the volatile diastereomer as a useful diagnostic marker, this successful application to urine specimens may be useful for diagnostic classification of inherited metabolic disorders.