중고압 하에서 $\beta$-glucosidase효소반응을 물리화학적 관점에서 연구하였다. 모델 기질 (p-nitrophenyl-${\beta}$-D-glucopyranoside)에 대한 $\beta$-glucosidase 효소의 작용에 대한 압력 효과를 실험 하였다. 즉, 압력 조건(25MPa, 50 MPa, 75 MPa, 100 MPa)과 시간 (10분, 60분, 1시간, 6시간, 24시간, 40시간)의 처리 조건에서 효소 활성도를 분광학적인 표준방법에 따라 측정하였다. 효소-기질 반응의 단계를 크게 kinetic 구간과 평형 구간으로 구분하여 물리화학적 모델을 적용하여, 정 역반응속도 상수, 평형상수, 압력에 의한 부피 감소 등을 산출하였다. 대기압에서 100MPa까지 압력이 증가할수록 효소-기질 반응의 생성물이 더 많이 형성되었으며 전형적인 kinetic 구간과 평형 구간이 나타났다. 압력, 시간, 생성물농도 등의 데이터로부터 kinetic 구간과 평형에서의 생성물 예측 모델을 완성하였다. 결론적으로 중고압 처리에 의하여 효소-기질 반응이 촉진됨을 알 수 있었고, 임의의 압력 및 시간 조건에 따른 생성물의 농도를 예측할 수 있게 되었다.
Chitin을 35 mesh로 분쇄하여 강산과 강알카리로 처리하여 CHITA와 CHITB를 만들고 여기에 glutaraldehyde를 작용시켜 $\beta$-glucosidase를 고정하여 CHITA-Gase 및 CHITB-Gase를 제조하였다. 이 두 종류의 고정화 효소를 기질 p-nitropheol-$\beta$-D-gliucopyranoside(PNG)과 회분식 반응기, 연속 흐름 반응기 및 플러그 흐름 반응기에서 반응시켜 최적 온도, 최적 pH, 반응 속도 상수, 물질 전달 계수, 효율 인자 및 효소 불활성화 속도 등을 구하여 반응기별 효율을 검토하였다. 반응 최적 온도는 세가지의 반응기 모두 5$0^{\circ}C$였으며, 최적 pH는 플러그 흐름 반응기에서는 Nat-Gase와 같이 pH5.0이었고 회분식 반응기 및 연속 흐름 반응기에서는 최적 pH의 이동이 일어나 pH6.0으로 이었다. 반응기의 최적 조건에서 km값은 회분식 반응기에서 CHITB-Gase$1.725$\times$10^-^5M/1$가 CHITA-Gase($1.725$\times$10^-^5M/1$)보다 작았으며, 연속 흐름 반응기 및 플러그 흐름 반응기에서는 유속 증가에 따라 Km'치가 감소하는 경향을 보였고, CHITB-Gase가 CHITB-Gase보다 더 작았다. $V^m^a^x'$값은 회분식 반응기, 연속 흐름 반응기, 플러그 흐름 반응기에서 모두 CHITA-Gase가 CHITB-Gase보다 높은 것으로 나타났다. 그리고, 물질전달계수 및 효율인자, 효소 불활성화 속도등의 값은 환경은 CHITB-Gase의 것이 나은 것으로 나타났다. 이들의 결과에서 CHITA-Gase 및 CHITB-Gase는 기질과의 반응 환경이 좋으므로 chitind은 $\beta$-glucosidase의 좋은 지지체라고 판단되어 공업적 응용이 기대된다.
Streptomyces coelicolor A3(2)의 $\beta$-glucosidase 유전자를 분리하여 대장균에서 발현하여 특성을 조사하였다. 최적 활성을 나타내는 온도는 pH 5에서는 $20^{\circ}C$, pH 6에서는 $60^{\circ}C$에서 높은 활성을 나타냈다. pH에 따른 활성은 pH 3 이하와 pH 9 이상의 범위에서는 낮은 활성을 나타냈으며 pH 7에서 가장 높은 활성을 나타냈다. $\alpha$-pNPG($\rho$-nitrophenyl-$\alpha$-D-glucopyranoside), $\beta$-pNPG ($\rho$-nitrophenyl-$\beta$-D-glucopyranoside), $\beta$-pNPF($\\rho$-nitrophenyl-$\beta$-D-fucopyranoside)는 pH 3-10까지 비슷한 활성을 나타냈으며, $\alpha$-pNPG가 pH 7에서 다소 높은 활성을 보였다. $\beta$-pNPGA는 pH 5-9까지 높은 활성을 나타냈으며, 특히 pH 9에서 3배 이상의 높은 활성을 나타냈다. 기질 $\alpha$-pNPG, $\beta$-pNPG, $\beta$-pNPF의 온도에 따른 활성변화는 $\beta$-pNPF의 활성이 $60^{\circ}C$에서 증가하였고, $\beta$-pNPGA는 $30-50^{\circ}C$까지 활성이 증가하여 $50^{\circ}C$에서 최대활성을 나타내었다. 당화 flavonoid를 이용한 기질특이성의 상대활성은 daidzin, glycitin, genistin, 순으로 나타났으며 esculin과 apigenin-7-glucose는 기질로 사용하지 않았다. $\beta$-Glucosidase 활성은 EDTA, DTT에 의해 억제되었으며, $MnSO_4$, $CaCl_2$, KCl, $MgSO_4$에 의해 증가하였고, 특히 Mn이온에 의해 증가하였다. $CuSO_4$, NaCl에 의해 효소활성이 저해되었으며, 특히 $ZnSO_4$의 경우 효소활성이 강하게 억제되었다.
KIM, HYUNJIN;JI-YOUNG YANG;HYEON-GYU LEE;JAEHO, CHA
Journal of Microbiology and Biotechnology
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제11권4호
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pp.685-692
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2001
A gene, Egl, from Paenibacillus sp. KCTC 8848P encoding endo-${\circ}$-1,4-glucanase was cloned and expressed in Escherichia coli. It consisted of an open reading frame of 1,191 bp for a protein that consisted of 397 amino acids with a molecular weight of 44,539 Da. The deduced amino acid sequence of the endo-${\circ}$-1,4-glucanase gene had a 94% similarity to the endo-$\beta$-1,4-glucanase of Bacillus polymyxa. The Egl gene was also expressed in Saccharomyces cerevisiae secreting Endomyces fibuliger $\beta$-glucosidase (BGL1) under the control of the alcohol dehydrogenase (ADC1) gene promoter, S. cerevisiae transformant producing both endo-${\circ}$-1,4-glucanase and ${\circ}$-glucosidase grew on carboxymethyl cellulose as the sole carbon source.
Heterologous secretory expression of endoglucanase E (Clostridium thermocellum) and ${\beta}$-glucosidase 1 (Saccharomycopsis fibuligera) was achieved in Saccharomyces cerevisiae fermentation cultures as an ${\alpha}$-mating factor signal peptide fusion, based on the native enzyme coding sequence. Ethanol production depends on simultaneous saccharification of cellulose to glucose and fermentation of glucose to ethanol by a recombinant yeast strain as a microbial biocatalyst. Recombinant yeast strain expressing endoglucanase and ${\beta}$-glucosidase was able to produce ethanol from ${\beta}$-glucan, CMC and acid swollen cellulose. This indicates that the resultant yeast strain of this study acts efficiently as a whole cell biocatalyst.
본 연구에서는 제지 슬러지를 이용한 SSF 공정에 L..paracasei KLB58을 적용하여 젖산과 더불어 생균제용 균체를 경제적으로 대량 생산하고자 하였다. KLB58의 배양온도와 섬유소 가수분해 효소인 $\beta$-glucosidase의 농도를 조절하여 최적의 생산 조건을 확인해 본 결과, 37$^{\circ}C$ 에서 2 unit/ml의 $\beta$-glucosidase를 첨가하여 배양하였을 때 최대의 젖산과 균체를 생산하였다. 또한 $\beta$-glucosidase를 포함하지 않아도 상대적으로 많은 양의 젖산과 균체를 생산하였으므로, 이에 대한향후 연구가 기대된다.
A gene encoding ${\beta}$-glucosidase was cloned from Weissella cibaria 37, an isolate from human feces. Sequence analysis showed that the gene could encode a protein of 415 amino acids in length, and the translated amino acid sequence showed homology (34-31%) with glycosyl hydrolase family 1 ${\beta}$-glucosidases. The gene was overexpressed in E. coli BL21(DE3) using pET26b(+) and a 50 kDa protein was overproduced, which matched well with the calculated size of the enzyme, 49,950.87 Da. Recombinant ${\beta}$-glucosidase was purified by using a his-tag affinity column. The purified ${\beta}$-glucosidase had an optimum pH and a temperature of 5.5 and $45^{\circ}C$, respectively. Among the metal ions (5mM concentration), $Ca^{2+}$ slightly increased the activity (108.2%) whereas $Cu^{2+}$ (46.1%) and $Zn^{2+}$ (56.7%) reduced the activity. Among the enzyme inhibitors (1 mM concentration), SDS was the strongest inhibitor (16.9%), followed by pepstatin A (45.2%). The $K_m$ and $V_{max}$ values of purified enzyme were 4.04 mM and 0.92 ${\mu}mol/min$, respectively, when assayed using pNPG (p-nitrophenyl-${\beta}$-D-glucopyranoside) as the substrate. The enzyme liberated reducing sugars from carboxymethyl cellulose (CMC).
Various parameters such as solvent selection, concentration, solid/liquid ratio, soaking time, temperature, stationary, shaking conditions, and repeated extractions were investigated in order to determine the optimum extraction conditions of ${\beta}$-glucosidase from bagasse fermented by mixed culture of Aspergillus niger NRC 7A and Aspergillus oryzae NRRL 447. Among various solvents tested, non ionic detergents gave the best results than the inorganic or organic salt solutions and distilled water. The optimum conditions for extraction of ${\beta}$-glucosidase were 30 min soaking time at $40^{\circ}C$ under shaking condition at 150 rpm, with solid/liquid ratio 1:15 (w/v), which yielded $2882.74{\pm}95.52U/g$ fermented culture (g fc) of enzyme activity. With repeated washes under the above optimum conditions, the results showed that enzyme extracted in the $1^{st}$ and $2^{nd}$ washes represents about 90% of the total activity.
Trichoderma sp. FJ1의 cellulase 생산을 위한 배지조성의 검토에서, 질소원으로서 0.1% bacto peptone을 사용하였을 때 생산성이 향상되었으며, 순수 상업용기질인 avicel과 섬유소 폐기물인 볏짚의 혼합배양에서 높은 효소생산성이 얻어졌다. 경제적인 효소생산성을 위한 기질로 섬유소 폐기물의 농도와 혼합비를 검토한 결과, 1%농도에서 볏짚과 펄프를 50:50으로 사용했을시 CMCase, xylanase, ${\beta}-glucosidase$, avicelase는 24.3, 38.7, 1.5, 0.6 U/ml가 얻어졌다. 이러한 효소생산성은 타 보고서의 결과보다 동등이상의 우위를 보여주고 있으며 섬유소 폐기물의 생물학적 당화기술에 크게 기여하리라 사료된다.
The ${\beta}-glucosidase$ was purified to homogeneity from the culture filtrate of P. verruculosum by column chromatography. The enzyme was a glycoprotein with a relative size of approximately 220 kDa with an isoelectric point of 4.8, which was composed of dimeric protein of 105 kDa. The enzyme was stable up to $60^{\circ}C$ and the presence of glycerol significantly increased its thermostability. The enzyme was found to hydrolyze both ${\beta}-aryl$ and ${\beta}-alkyl-glucosides$ in addition to ${\beta}-glucosyl$ glucose and catalyzed glucosyl transfer to cellobiose. The enzyme attacked laminarin in an exotype-like fashion. The apparent Km's of the enzyme toward cellobiose, laminaribiose, laminarin were 0.53 mM, 0.35 mM and 1.11 mM, respectively. Glucose and glucono-${\delta}-lactone$ were competitive inhibitors for the enzyme. Copper ($Cu^{2+}$), mercury ($Hg^{2+}$) and p-chloromercuribenzoate were strong inhibitors of the enzyme. The immunoblotting result revealed that one form of ${\beta}-glucosidase$ was biosynthesized, irrespective of carbon sources used. Polyacrylamide gel electrophoresis analysis of the in vitro translated product of total RNA from avicel grown mycelium established that the P. verruculosum ${\beta}-glucosidase$ precursor was approximately 95 kDa in size. The amino acid composition and N-terminal amino acid sequence are given.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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