Korean Journal of Fisheries and Aquatic Sciences (한국수산과학회지)

The Korean Society of Fisheries and Aquatic Science (한국수산과학회)
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Screening of Anti-microbial and Anti-inflammatory Activity of Common Stalked Barnacle Pollicipes mitella Extract

거북손(Pollicipes mitella) 추출물의 항균 활성 및 항염증 활성 탐색

  • Ho Sung Moon (Department of Food Science and Biotechnology, Kunsan National University) ;
  • In-Ah Lee (Department of Chemistry, Kunsan National University) ;
  • Jung-Kil Seo (Department of Food Science and Biotechnology, Kunsan National University)
  • 문호성 (국립군산대학교 식품생명공학전공) ;
  • 이인아 (국립군산대학교 화학과) ;
  • 서정길 (국립군산대학교 식품생명공학전공)
  • Received : 2024.02.29
  • Accepted : 2024.06.19
  • Published : 2024.06.30
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Abstract

This study screened the antimicrobial and anti-inflammatory activities of three extracts [1% acetic acid (HAc), distilled water (D.W.), and ethanol] from the common stalked barnacle Pollicipes mitella. Among the extracts, the 1% HAc extract showed the strongest antibacterial activity against several bacteria, but exhibited no activity against Candida albicans. To improve the degree of separation of the 1% HAc extract, solid-phase extraction was performed using a C18 cartridge with three solvents (D.W., 60A, and 100A). The 1% HAc 60A eluate showed the strongest antibacterial activity and enzyme, salt, and temperature stability, with no hemolytic activity. In addition, strong DNA-binding ability but no bacterial membrane permeability was observed. These results indicate that the P. mitella 1% HAc 60A eluate may contain antibacterial organic compounds that target intracellular components but not bacterial membranes. In addition, the 1% HAc 60A eluate exhibited potent inhibitory activity to reduce the production of inflammatory mediators (nitric oxide and prostaglandin E2) and pro-inflammatory cytokines (tumor necrosis factor-α, interleukin (IL)-6, and IL-1β) with no cytotoxicity. Therefore, the P. mitella 1% HAc 60A eluate has anti-inflammatory activity. Collectively, our results suggest that the P. mitella 1% HAc 60A eluate can be used as a bioactive source with antibacterial and anti-inflammatory activities.

Keywords

서론

거북손(Pollicipes mitella)은 절지동물문 부처손목 부처손과에 속하며, 갑각류 종인 따개비의 일종으로 생긴 모습이 거북의 손을 닮았다고 하여 거북손이라 불린다(Lim and Hwang, 2006; Moon et al., 2016). 거북손은 부화 후 1개월 이상 동안 플랑크톤 유생단계(planktonic larvae stage)를 거친 후 부착생활 단계로 전환된다(Molares et al., 1994). 성체가 된 거북손의 길이는 30–40 mm 정도이며, 외관상의 구조는 상층부의 capitulum과 하층부의 peduncle로 나눌 수 있으며, capitulum은 carina, rostrum, scuta, terga 등으로 둘러 쌓여 있고, peduncle은 길쭉한 타원형의 석회질의 비늘(calcareous scales)로 둘러 쌓여 있다(NIBR, 2011) (Fig. 1A). 거북손의 내부 구조는 상층부의 capitulum에는 촉수(cirrus), 입(mouth), 폐각근(adductor muscle), 타액선(salivary gland), 위(stomach) 등이 포함되어 있으며, 하층부인 peduncle에는 근육조직(muscular tissue), 난소(ovary) 및 시멘트 관(cement duct) 등이 포함되어 있다(Molares et al., 1994). 거북손의 성장은 서식지의 해양환경조건과 먹이의 이용성에 달려 있으며, 상층부의 capitulum에 있는 촉수(cirrus)를 이용하여 수중의 플랑크톤을 여과섭식(filter-feeding)함으로써 먹이를 섭취하는 것으로 알려져 있다(Norton, 1996; Moon et al., 2016). 거북손은 한국, 일본, 필리핀, 대만, 인도 및 서태평양 등에서 서식할 뿐만 아니라 포르투갈이나 스페인 등에도 서식하는 것으로 알려져 있다(NIBR, 2011; Moon et al., 2016). 특히, 우리나라에서는 남해안, 제주도 및 서해안에 넓게 분포하고 있는 것으로 알려져 있다(Song and Yoon, 2013). 거북손은 우리나라에서는 남해안의 일부 지역에서는 식용으로 사용하고 있으나 일반인들에게는 식재료로서는 잘 알려져 있지는 않지만, 최근 들어서 대중매체에 의해서 조금씩 알려지기 시작하면서 매년 소비량이 증가하고 있는 추세이며, 일본과 스페인 및 포르투칼 등지에서는 식재료로서 널리 알려져 있다(Moon et al., 2016). 그러나 식재료로서 소비되고 있는 다른 해양생물들과 비교해서 거북손의 식재료로서의 특성과 기능성에 대해서는 상대적으로 덜 알려져 있는 실정이다.

Fig. 1. The external (top) and internal shape (bottom) of the common stalked barnacle Pollicipes mitella (A) and extraction procedures for experiment (B).

현재까지 수행된 거북손에 대한 연구는 생태와 분포 및 유전적 특성분석 등의 제한된 분야에서만 진행되었다. 특히, 우리나라에서는 거북손의 미토콘드리아 DNA의 서열분석, PCR을 이용한 거북손의 유전적 및 지질학적 차이 분석, 거북손의 미토콘드리아 DNA 서열 분석을 통한 종 다양성과 유전자 흐름에 대한 연구가 주로 수행되었으며, 최근 들어서 거북손의 일반 성분, 지방산, 무기질 함량 등을 포함하는 식품 영양학적 특성에 대해서도 연구가 수행되었다(Lim and Hwang, 2006; Song and Yoon, 2013; Yoon et al., 2013; Moon et al., 2016). 반면에 거북손에 포함된 생리활성탐색을 포함하는 기능성 소재로서의 활용 가능성에 대한 연구는 우리나라뿐만 아니라 세계적으로도 전무한 실정이다.

따라서 본 연구에서는 처음으로 거북손에 포함된 생리활성을 확인하기 위해서 거북손 내부조직을 1% acetic acid (HAc, 초산), distilled water (D.W., 증류수) 및 ethanol (EtOH, 에탄올)을 이용한 추출 및 solid-phase extraction 과정을 수행한 후, 추출물 및 용출액에 포함된 항균활성 및 항염증 활성을 탐색하였다. 이러한 결과를 토대로 거북손의 기능성 소재로서의 활용 가능성에 대한 기초자료를 제시하고자 한다.

재료 및 방법

실험 재료 및 시약

본 실험에 사용한 거북손(P. mitella)는 부산광역시 기장군(2023년 10월)에서 직접 채취하였으며, 채취 측시 냉동시켜 실험실로 운반한 후 추출 시까지 -70°C에 보관하였다.

항균활성 측정을 위한 배지성분으로 사용된 tryptic soy broth (TSB)와 sabouraud dextrose broth (SDB) 및 agarose type I (Low EEO Agar)은 Merck사(Merck, Darmstadt, Germany)와 Sigma사(St. Louis, MO, USA)에서 각각 구입하였으며, 세포배양을 위한 배지인 DMEM는 Sigma사에서 구입하였다. Solid-phase extraction을 위한 Sep-Pak C18 cartridge는 Waters사(Miliford, MA, USA)에서 구입하였으며, acetonitrile (CH3CN)은 Tedia사(Fairfield, OH, USA)에서 구입하였다. 효소처리 실험을 위한 trypsin과 chymotrypsin은 Fisher Scientific사(Fairlawn, NJ, USA)에서 구입하여 사용하였으며, cellulase, α-Lipase 및 DNase는 Sigma사에서 각각 구입하여 사용하였다. 용혈활성 측정에 사용된 defibrinated sheep blood는 KisanBio사(MB cell, KisanBio, Seoul, Korea)에서 구입하여 사용하였으며, 세균 내막 투과성 측정을 위해서 사용된 o-nitrophenyl-β-D-galacto-pyranoside (ONPG)는 Sigma사에서 구입하였다. 또한, DNA-binding ability 측정에 사용된 1 kb DNA ladder는 Bioneer사(Bioneer Corp., Daejeon, Korea)에서 구입하였다. 그 외의 모든 시약들은 특급을 사용하였다.

조직추출

-70°C에 보관중인 거북손을 얼음 위에서 서서히 해동시킨 후, 외부껍질 부위로부터 촉수와 muscle 등을 포함하는 내부 조직 부위(internal tissue)를 분리한 후 얼음 속의 냉각된 용기에 모았다(Fig. 1A). 모아진 내부조직을 균등하게 3등분하고, 각각을 1% HAc, D.W. 및 EtOH 추출과정에 사용하였다(Seo et al., 2005). 먼저, 1% HAc 추출과정과 D.W. 추출과정은 다음과 같은 과정으로 수행되었다(Fig. 1B). 내부조직에 가온된 4배량의 1% HAc 또는 D.W. (1:4, v/v)를 첨가하여 100°C에서 5분 동안 끓인 후, 얼음에 보관하면서 충분히 냉각시켰다. 냉각된 조직은 homogenizer (T10 basic ULTRA-TURRAX; IKA, Staufen, Germany)를 사용하여 얼음 속에서 완전히 파쇄시켰다(Speed #6, 2 min, on ice). 조직 파쇄액은 4°C에서 20분 동안 12,000 rpm으로 원심분리(VS-21SMT; Vision Scientific, Buchon, Korea)를 행한 후 각각의 상층액을 취하였다. 두 번째로 EtOH 추출과정은 다음과 같은 과정으로 수행되었다(Fig. 1B). 내부조직에 4 배량의 EtOH (1:4, v/v)을 첨가하고 진탕(25°C, 60 min, 120 rpm)시킨 후, 조직을 homogenizer (IKA)를 사용하여 실온에서 완전히 파쇄시켰다(Speed #6, 2 min, 실온). 조직 파쇄액은 4°C에서 20분 동안 12,000 rpm으로 원심분리(VS-21SMT; Vision Scientific)를 행한 후 상층액을 취하였다. 각각의 상층액은 실험에 사용될 때까지 -70°C에 보관하였다.

Solid-phase extraction

1% HAc 추출물을 Sep-Pak C18 cartridge (Waters, Miliford, MA, USA)에 도입시킨 후 solid-phase extraction 과정을 수행하였다(Lee and Seo, 2021a). 이를 위해서, 우선 Sep-Pak C18 cartridge에 40 mL의 acetonitrile (0.1% TFA 포함)과 40 mL의 D.W. (0.1% TFA 포함)를 연속적으로 도입시킴으로써 C18 cartridge 내의 resin을 팽창과 평형화(swelling과 equilibration) 및 세척(washing)시켰다. 평형화 및 세척된 Sep-Pak C18 cartridge에 1% HAc 추출물(20 mL)을 도입시켜서 추출물 내의 물질들을 C18 cartridge에 결합시키고, C18 cartridge를 통과한 용액(flow through, FT)은 분획하였다. C18 cartridge에 결합된 물질들은 40 mL D.W.(0.1% trifluoroacetic acid, TFA, 포함), 40 mL 60% acetonitrile (0.1% TFA 포함) 및 40 mL 100% acetonitrile (0.1% TFA 포함)를 순차적으로 사용하여 각각을 용출 및 분획(용출액 표시: D.W. 용출액, 60A 용출액, 100A 용출액)하였다(Fig. 1B). 각각의 용출된 분획은 진공회전증발농축기와 speed-vac (Modulspin 31; Hanil Science Industrial, Gimpo, Korea)을 사용하여 감압농축시킨 후 0.01% 초산에 용해시켜 활성측정 실험에 사용하였다.

항균활성 측정 및 사용 균주

항균활성 측정에는 그람 양성균인 Bacillus subtilis KCTC1021와 Staphylococcus aureus KCTC1621 및 그람 음성균인 Escherichia coli D31 (Noga 교수 제공, North Carolina State University, NC, USA), Escherichia coli ML35p (Noga 교수 제공, North Carolina State University)를 사용하였으며, 진균으로는 Candida albicans KCTC7965를 사용하였다. 또한 어병세균으로는 Aeromonas hydrophila KCTC2358, Streptococcus iniae KCTC3657 및 Vibrio parahaemolyticus RIMD2110633을 사용하였다. 항균활성 측정방법으로는 서로 다른 농도를 포함한 두 층의 배지(underlay와 overlay)를 사용하는 ultrasensitive radial diffusion assay (URDA)법을 이용하였다(Lehrer at al., 1991; Seo et al., 2005).

항균활성 측정에 사용된 세균과 진균은 각각 TSB 또는 SDB에서 배양(37°C, 18 h)한 후 colorimeter (Product No. 52-1210; BioMerieux, Inc., USA)를 사용하여 균 농도가 1×108 CFU/mL (세균용) 또는 1×106 CFU/mL (진균용)이 포함되도록 조정하였다. 그 후, 농도 조정된 균액 0.5 mL을 9.5 mL의 underlay gel에 첨가하고 혼합한 후에 plate에 부어 굳혔다. 굳은 plate에 직경 2.5 mm의 well을 뚫은 후 5 μL의 시료를 도입시키고 1차 배양(37°C, 3 h 배양) (Vibrio parahaemolyticus는 25°C, 3 h 배양)하였다. 1차 배양 후, underlay gel 위에 10 mL의 overlay gel을 부은 후에 2차 배양하였다(37°C, 18 h 배양) (Vibrio parahaemolyticus는 25°C, 18 h 배양) (Seo et al., 2005). 배양 후, well 주위에 형성된 clear zone의 크기를 측정함으로써 항균 활성 정도를 확인하였다. 항균활성 측정 동안 양성대조군으로는 미국산 잡종 농어(Morone saxatilis×Morone chrysops)의 mast cell에서 유래된 합성 항균 펩타이드인 piscidin 1을 사용하였고, 음성대조군으로는 0.01% 초산을 사용하였다(Silphaduang and Noga, 2001).

효소처리에 의한 1% HAc 60A 용출액에 포함된 항균 물질의 특성 확인

용출액에 포함된 항균물질의 특성을 확인하기 위해서 단백질 분해효소(trypsin과 chymotrypsin), 지방분해효소(α-Lipase), 섬유소분해효소(cellulase), 핵산분해효소(DNase) 처리 전·후의 항균활성 변화를 확인하였다(Lee and Seo, 2021b). 이를 위해서 용출액 5 μL에 각각의 효소용액(1,000 μg/mL) 1 μL를 첨가하고 37°C에서 60분 간 반응시킨 후 호염 어병세균인 V. parahaemolyticus에 대한 항균활성 변화를 URDA법으로 측정하였다.

1% HAc 60A 용출액에 포함된 항균물질의 salt 및 temperature 영향 확인

용출액에 포함된 항균물질에 대한 salt 영향을 확인하기 위해서 서로 다른 농도의 NaCl을 underlay에 첨가한 후 호염 어병세균인 V. parahaemolyticus에 대한 항균활성 변화를 측정하였다(Lee and Seo, 2021a). 이를 위해서 V. parahaemolyticus를 포함하는 underlay gel에 0%, 1.0%, 2.0% 및 3.0% 농도가 되도록 NaCl을 첨가하고 용출액을 도입시킨 후 URDA 법을 이용하여 항균활성 변화를 측정하였다. 또한, 용출액에 포함된 항균 물질의 온도에 대한 안정성을 확인하기 위해서 용출액을 멸균 처리(121°C, 10 min)한 후 어병세균인 V. parahaemolyticus에 대한 항균활성 변화를 URDA 법을 이용하여 측정하였다(Lee et al., 2018).

1% HAc 60A 용출액의 용혈활성 확인

용출액의 적혈구에 대한 용혈활성은 sheep erythrocyte (MB cell; KisanBio)를 사용하여 측정하였다(Tang et al., 2021). 이를 위해서 defibrinated sheep blood에 동량의 phosphate buffered saline (PBS; 50mM sodium phosphate, 150 mM NaCl, pH 7.4)을 혼합한 후 원심분리(3,000 g, 5 min, 4°C)하는 과정을 3회 반복 수행함으로써 실험에 사용할 적혈구를 얻었다. 얻어진 적혈구에 PBS를 첨가하여 2% hematocrit이 되도록 농도를 조정한 후 용혈활성 측정에 사용하였다. 이를 위해서 농도 조정된 적혈구 90 μL를 1.5 mL tube에 도입시키고 서로 다른 농도의 용출액 10 μL를 첨가한 후 배양하였다(37°C, 60 min). 배양 후 반응액을 원심분리(1,500 rpm, 10분, 4°C)하고 상층액 80 μL를 취해서 96-well plate에 옮긴 후 405 nm에서 흡광도를 측정함으로써 적혈구로부터 유출된 헤모글로빈 농도를 확인하였다. 적혈구의 100% 용혈은 1% triton X-100을 사용하여 측정하였으며, 다음 식을 사용하여 용출액의 용혈활성 정도를 계산하였다.

\(\begin{align}\begin{array}{l} \% \text {Hemolysis }= \\ {\left[\frac{\left.\text { Abs }_{405 \mathrm{~nm}} \text { in the eluate solution }-\mathrm{Abs}_{405 \mathrm{~nm}} \text { in buffer }\right)}{\left(\mathrm{Abs}_{405 \mathrm{~nm}} \text { in } 1 \% \text { Triton X- } 100-\mathrm{Abs}_{405 \mathrm{~nm}} \text { in buffer }\right)}\right] \times 100}\end{array}\end{align}\)

1% HAc 60A 용출액의 cytoplasmic membrane permeability assay

용출액에 포함된 항균물질들의 세균 내막 투과성 유무는 β-galactosidase 활성을 포함하는 E. coli ML35p와 non-membrane permeable chromogenic 기질인 ONPG가 포함된 용액에 용출액을 도입시키고 배양한 후 E. coli ML35p의 세포질로 부터 유출된 β-galactosidase의 활성을 측정함으로써 내막 투과성을 확인하였다(Skerlavaj et al., 1990). 이를 위해서 배양된 mid-log phase의 E. coli ML35p를 10 mM sodium phosphate buffer (pH 7.4)로 세척한 후, 1.5 mM의 ONPG를 포함하는 동일 buffer에 현탁시켰다. 그 후, 측정할 용출액(4 μL)을 첨가한 뒤 37°C에서 60동안 배양하면서 10분 간격으로 유출된 β-galactosidase에 의한 ONPG의 가수분해산물인 o-nitrophenol의 농도를 405 nm에서 측정하였다. 막 투과성을 위한 표준 물질로는 강한 세균 내막 투과성을 가지는 것으로 알려진 항균 펩타이드인 piscidin 1 (4 μg/mL)을 사용하였다.

1% HAc 60A 용출액의 DNA binding assay

용출액에 존재하는 DNA 결합성 물질의 존재 유무는 용출액과 DNA의 상호작용에 의한 DNA의 agarose gel-electrophoresis에서의 이동저해 정도를 DNA-binding assay를 통해서 확인하였다(Hsu et al., 2005). 이를 위해서 1 kb DNA ladder (0.1 μg)와 용출액(1 μL)을 혼합해서 37°C에서 60분 동안 반응시키고, 0.5 μg/mL EtBr을 포함하는 1.4% agarose gel에서 전기영동을 수행한 후 DNA band의 유무 및 이동 정도를 확인함으로써 DNA-binding 정도(유무)를 확인하였다.

1% HAc 60A 용출액의 대식세포 생존율에 대한 영향 확인

용출액의 세포독성을 확인하기 위해서 마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포(KCLB 40071; Korean Cell Line Bank, Seoul, Korea)의 세포 생존율에 대한 영향을 crystal violet 염색법을 이용하여 측정하였다(Choi et al., 2020; Cho and Kang, 2020). 먼저, RAW 264.7 세포를 1×105 cells/well의 농도로 24 well plate에 분주하고 24 h 동안 전 배양한 후 용출액을 농도별(100, 200, 300 μg/mL)로 첨가하고 추가 배양(37°C, 5% CO2 24 h)하였다. 배양 후, 배양액을 제거하고 1xPBS로 세척 및 10% formalin 용액으로 세포를 고정하고, 1% crystal violet 200 μL을 각 well에 첨가한 후 상온에서 10분간 염색하고 증류수로 세척하였다. 세척 후, glacial acetic acid (Samchun Chemicals Co., Ltd., Seoul, Korea) 용액을 각 well에 250 μL씩 첨가하고, 희석한 용액을 96 well plate로 옮긴 후 595nm에서 흡광도를 측정하였다. 용출액의 세포독성은 용출액을 첨가하지 않은 흡광도 값을 100% 생존율로 간주하고 용출액 첨가군의 흡광도 값을 상대적인 생존율 %로 나타내었다.

1% HAc 60A 용출액의 염증성 매개인자 nitric oxide (NO) 생성 억제 효과 측정

LPS 처리에 의해 RAW 264.7 세포로부터 유도된 NO 생성량에 대한 용출액의 영향은 Green 등의 방법에 따라 griess 반응을 이용하여 용출액 처리에 따른 세포 배양액 중의 NO-2의 농도를 측정함으로써 수행되었다(Green et al., 1982). 이를 위해서 1×106 cells/mL 농도로 조정된 RAW 264.7 cell을 24 well plate에 분주하고 배양하였다(37°C, 5% CO2, 24 h). 배양 후 용출액을 100, 200, 300 μg/mL 농도로 첨가하고, 1 μg/mL의 LPS (lipopolysaccharide)를 처리한 후 18시간 동안 배양하였다(37°C, 5% CO2). 배양 후, 원심분리(4°C, 1,500 rpm, 10 min) 과정을 수행한 후 상층액을 취하여 NO-2의 정량 실험에 사용하였다. 얻어진 상층액을 Griess 시약(1% sulfanilamide+0.1% naphthylendiamine dihydro- chloride, 1:1)과 동일비율(1:1, v/v)로 혼합하고 상온에서 10 분간 반응시킨 후 microplate reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. Sodium nitrite (NaNO2) (Duksan Science, Seoul, Korea)의 농도별 표준곡선을 활용하여 배양액 내의 NO-2 농도를 결정하였다.

1% HAc 60A 용출액의 염증성 매개인자 PEG2와 염증성 cytokines 생성 억제 효과 측정

LPS 처리에 의해 RAW 264.7 세포로부터 유도되는 염증성 매개인자인 PEG2와 염증성 cytokine들(IL-6, IL-1β, TNF-α)의 생성량에 대한 1% HAc 60A 용출액의 영향을 측정하였다(Kang et al., 2021; Kim et al., 2021). 이를 위해서 1×105 cells/mL 농도로 조정된 RAW 264.7 cell을 24 well plate에 분주하고 배양하였다(37°C, 5% CO2, 24 h). 24시간 배양 후, 1% HAc 60A 용출액을 100, 200, 300 μg/mL 농도로 첨가하고 1 μg/mL의 LPS를 처리한 후 배양하였다(37°C, 5% CO2, 18 h). 배양 후, 원심분리(4°C, 1,500 rpm, 10 min) 과정을 수행하여 상층액을 취한 후 염증성 매개인자인 PEG2와 염증성 cytokine들(IL-6, IL-1β 및 TNF-α)의 농도는 ELISA kit (Mouse ELISA set; BD Bioscience, San Jose, CA, USA)를 이용한 흡광도 측정으로 확인하였다.

통계처리

모든 실험은 3회 이상 반복 실시하였으며, 실험 결과는 각 항목에 따라 평균치±표준편차(standard division, S.D.)를 구하고, Mann-Whitney U Test를 통해 신뢰수준 P<0.05일 때 통계적 유의차가 있다고 평가하였다.

결과 및 고찰

추출물의 항균활성

거북손(P. mitella)으로부터 채취한 내부 조직부위(internal tissue)는 1% HAc, D.W. 및 EtOH을 이용한 추출과정을 수행하였으며, 각 추출물의 항균활성은 URDA법을 이용하여 B. subtilis, E. coli D31 및 C. albicans에 대해서 측정하였다(Fig. 1). 측정 결과, 1% HAc 추출물만이 항세균활성을 나타내었으며, 활성정도는 E. coli D31 보다는 B. subtilis에 대해서 더 강한 항균활성을 나타내었다(Fig. 2). 반면에 D.W. 추출물과 EtOH 추출물은 두 균주에 대해서 거의 항균활성을 나타내지 않았다. 또한. 3 가지 추출물들은 모두 진균인 C. albicans에 대해서는 항균활성을 나타내지 않았다. 표준물질로 사용된 piscidin 1은 측정에 사용된 3가지 균주들에 대해서 강한 항균활성을 나타낸 반면에 음성대조군으로 사용된 추출물의 용해에 사용된 0.01% HAc는 항균활성을 나타내지 않았다. 이러한 결과는 거북손 내부조직 추출물 중에서 1% HAc 추출물에 주요한 항균물질이 포함되어 있으며, 포함된 항균물질의 활성 spectrum은 세균에 한정되어 있다는 것을 의미하는 것이다. 이와 유사하게, 몇몇의 해양무척추동물 추출물들의 항균 spectrum이 세균에 한정된 경우가 보고되어 있다(Seo, 2016).

Fig. 2. Antimicrobial activity of the crude extract obtained from the internal tissue of common stalked barnacle Pollicipes mitella using three different extraction methods with 1% HAc, D.W., and EtOH. Antimicrobial activities of the extract and controls (positive, piscidin 1; negative, 0.01% HAc) were tested against Bacillus subtilis KCTC1021, Escherichia coli D31, and Candida albicans KCTC7965 using URDA method. D.W., Distilled water; URDA, Ultrasensitive radial diffusion assay. Scale bar indicates 5 mm.

추출물 중에서 가장 강한 항균활성을 나타낸 1% HAc 추출물에 포함된 항균물질들의 순도를 개선시키기 위해서 1% HAc 추출물을 Sep-Pak C18 cartridge를 사용한 solid-phase extraction 과정을 수행한 후 얻어진 각 용출액들의 항세균활성을 측정하였다(Fig. 1B) (Fig. 3). 측정결과, 1% HAc 추출물의 F.T. 용출액과 D.W. 용출액은 B. subtilis에 대해서만 항균활성을 나타낸 반면에 60A 용출액은 측정에 사용된 모든 세균들에 대해서 유효한 항균활성을 나타내었다(Fig. 3A). 특히, 60A 용출액은 측정에 사용된 3종의 어병세균에 대해서도 유효한 항균활성을 나타내었다(Fig. 3B). 이러한 결과는 1% HAc 추출물의 60A 용출액에 포함된 항균물질은 거북손의 해양유래 병원균에 대한 방어작용에 기여할 가능성이 있으며, 1% HAc 추출물의 solid-phase extraction 분획물 중에서는 60A 용출액이 가장 유효한 항균활성 물질을 포함하고 있다는 것을 나타내는 것이다. 이러한 결과를 토대로 유효한 항균활성을 나타낸 1% HAc 추출물의 60A 용출액을 사용하여 거북손에 존재하는 항균활성 물질의 특성을 탐색하였다.

Fig. 3. Antimicrobial activity of each eluate of 1% HAc extract obtained from the solid-phase extraction using a Sep-Pak C18 cartridge. A, Antibacterial activity of each eluate of 1% HAc extract was tested against Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli D31, and E. coli ML35p using URDA method; B, Antibacterial activity of each eluate of 1% HAc extract was tested against three fish pathogenic bacteria including Aeromonas hydrophila, Staphylococcus iniae, and Vibrio parahaemolyticus using URDA method. FT, Flow through eluate; D.W., Distilled water eluate; 10A, 10% acetonitrile eluate; 60A, 60% acetonitrile eluate; 100A, 100% acetonitrile eluate. URDA, Ultrasensitive radial diffusion assay. Scale bar indicates 5 mm.

효소처리에 의한 1% HAc 60A 용출액 내 항균물질의 특성 확인

현재까지 해양무척추동물 추출물로부터 다양한 항균활성 물질들이 보고되었으며, 특히 1% 초산 추출물로부터 여러 종류의 항균 펩타이드가 보고되었다(Seo et al., 2005; Oh et al., 2016). 이러한 결과를 토대로 1% HAc 추출물의 60A 용출액에 포함된 항균활성 물질의 특성을 확인하였다. 이를 위해서 1% HAc 추출물의 60A 용출액에 단백질 분해효소인 trypsin, chymotrypsin, 지방분해효소인 α-Lipase, 섬유소분해효소인 cellulase 및 핵산분해효소인 DNase를 처리한 후 호염세균인 V. parahaemolyticus에 대한 항균활성 변화를 URDA법을 사용하여 측정하였다(Fig. 4A). 측정 결과, 1% HAc 60A 용출액은 trypsin과 chymotrypsin 처리 후에도 V. parahaemolyticus에 대한 항균활성은 거의 변화가 없는 것으로 나타났다. 또한, 1% HAc 추출물의 60A 용출액은 지방분해효소인 α-Lipase, 섬유소분해효소인 cellulase 및 핵산분해효소인 DNase를 처리한 후에도 역시 V. parahaemolyticus에 대한 항균활성은 큰 변화를 나타내지 않았다. 이러한 결과는 1% HAc 추출물의 60A 용출액에 포함된 항균물질은 단백질, 섬유소, 지방 및 핵산과는 연관성이 없는 유기화합물일 가능성을 나타내는 것이다(Lee and Seo, 2021b).

Fig. 4. Characterization of antimicrobial compounds in 1% HAc extract 60A eluate. A, Antimicrobial activity of 1% HAc extract 60A eluate was tested against Vibrio parahaemolyticus using URDA method after treated with trypsin, chymotrypsin, α-lipase, cellulase, and DNase; B, Hemolytic activity of 1% HAc extract 60A eluate was tested against sheep erythrocytes. 1% triton X-100 and buffer were used as the positive and the negative control; C, Antimicrobial activity of 1% HAc extract 60A eluate was tested by incubating 60A eluate in the various NaCl concentrations (0-3.0 %) against V. parahaemolyticus using URDA method; D, Antimicrobial activity of 1% HAc extract 60A eluate was tested after being autoclaved (121 °C for 10 min) against V. parahaemolyticus using URDA method. URDA, Ultrasensitive radial diffusion assay. Scale bar indicates 5 mm.

1% HAc 60A 용출액의 용혈활성 측정

1% HAc 추출물 60A 용출액에 포함된 독성물질의 존재 유무 및 항균활성 물질의 세포독성 유무를 확인하기 위해서 sheep erythrocyte에 대한 용혈활성을 측정하였다(Fig. 4B). 측정결과, 표준물질로 사용된 1% triton X-100은 강한 용혈활성을 나타낸 반면에 0.63–10 μL의 60A 용출액은 sheep erythrocyte에 대해서 용혈활성을 거의 나타내지 않았다. 이러한 결과는 60A 용출액에 포함된 물질들은 sheep erythrocyte에 대한 독성이 거의 없다는 것을 의미하는 것이다(Seo, 2016).

1% HAc 60A 용출액에 포함된 항균물질의 salt-effect

1% HAc 추출물의 60A 용출액에 포함된 항균물질의 salt effect를 확인하기 위해서 0–3% NaCl이 존재하는 조건에서 호염성 어병세균인 V. parahaemolyticus에 대한 60A 용출액의 항균 활성 변화를 URDA법을 사용하여 측정하였다(Fig. 4C). 측정 결과, 60A 용출액의 항균활성은 3% NaCl 농도(sea water salinity, –3.5% salinity)까지 큰 변화없이 유지되는 것으로 나타났다(Cole et al., 1997). 이러한 결과는 1% HAc 추출물의 60A 용출액에 포함된 항균물질은 salt에 영향을 받지 않으며, 거북손의 hemocytes 내부보다는 외부에서 항균작용을 수행할 가능성이 있음을 의미하는 것이다. 실제로 몇몇 해양생물 유래 항균 물질의 경우에는 NaCl에 의해 영향을 받지 않으며, 외부로 분비되는 특성을 가지는 경우가 보고되어 있다(Lee et al., 1997; Kerenga et al., 2019).

1% HAc 60A 용출액에 포함된 항균물질의 temperature-effect

1% HAc 추출물의 60A 용출액에 포함된 항균물질의 온도에 대한 안정성을 확인하기 위해서 60A 용출액을 멸균처리(121°C, 10 min)한 후 어병세균인 V. parahaemolyticus에 대한 항균활성 변화를 URDA법을 사용하여 측정하였다(Fig. 4D). 측정결과, 60A 용출액의 항균활성은 멸균처리 후에도 큰 변화를 나타내지 않았다. 이러한 결과는 60A 용출액에 포함된 항균 물질은 온도와 압력에 대해서 안정성을 가진다는 것을 나타내는 것이다.

1% HAc 60A 용출액의 cytoplasmic membrane permeability assay

1% HAc 추출물의 60A 용출액에 포함된 항균물질의 target site로서 세균 막과의 상호작용을 확인하기 위해서 E. coli ML35p에 대한 inner membrane permeability assay를 수행하였다(Fig. 5A). 측정결과, 양성 대조군으로 사용한 piscidin 1은 강한 내막 투과성을 나타낸 반면에 60A 용출액은 거의 세균 내막 투과성을 나타내지 않았다(Perrin et al., 2014). 이러한 결과는 60A 용출액에 포함된 항균물질은 세균의 세포막에 직접적으로 작용하여 세포질 물질을 세포 외부로 유출시키는 현상을 유도하지는 않는다는 것을 나타내는 것이다(Lee and Seo, 2021a).

Fig. 5. Cytoplasmic membrane permeability of Escherichia coli ML35p by 1% HAc extract 60A eluate and gel retardation analysis or the binding of 1% HAc extract 60A eluate to DNA. A, Cytoplasmic membrane permeability of 1% HAc extract 60A eluate was monitored by an increase in absorbance intensity by hydrolysis of the impermeable, chromogenic substrate (ONPG) in the presence of piscidin 1 (4 μg/mL) or 60A eluate (4 μL); B, The binding ability of 60A eluate (1 μL) to DNA was assessed by measurement of the migration of a commercial 1 kb DNA ladder (0.1 μg) through an agarose gel (1.4%). M, 1 kb DNA ladder (0.1 μg); lane 1, 1 μL 1% HAc extract 60A eluate; lane 2, negative control, 5 μL 0.01% HAc; lane 3, positive control, 1 μg piscidin 1.

1% HAc 60A 용출액의 DNA binding assay

1% HAc 추출물의 60A 용출액에 포함된 항균물질의 target site로서 intracellular components 중의 하나인 DNA와의 상호작용을 확인하기 위해서 60A 용출액과 DNA (1 kb DNA ladder)와의 상호작용에 의한 DNA migration 저해 활성을 측정하였다(Fig. 5B). 측정결과, 양성 대조군으로 사용한 piscidin 1은 1 kb DNA ladder에 대해서 강한 DNA migration 저해 활성을 나타내었다. 이와 유사하게 60A 용출액도 1 kb DNA ladder에 대해서 강한 DNA migration 저해활성을 나타내었다. 이러한 결과는 60A 용출액에 존재하는 항균물질은 negative charge를 나타내는 DNA의 인산기와의 상호작용(DNA-binding)을 통하여 DNA의 인산기에 존재하는 negative charge를 중화시킴으로써 전기장에서의 DNA migration을 저해했을 가능성이 있음을 의미하는 것이다(Seo et al., 2021). 따라서 60A 용출액에 포함된 항균물질은 세포막을 직접적인 target site로 작용하기 보다는 세균의 intracellular components (DNA 또는 단백질 등)들과 상호작용함으로써 항균활성을 나타낼 가능성이 있는 것으로 판단된다(Huo et al., 2011).

1% HAc 60A 용출액의 세포독성 측정

1% HAc 추출물 60A 용출액의 대식세포에 대한 세포독성을 확인하기 위해서 마우스 대식세포주인 RAW 264.7 (KCLB 40071) 세포의 증식에 대한 영향을 crystal violet 염색법을 사용하여 측정하였다(Cho and Kang, 2020; Choi et al., 2020). 60A 용출액을 첨가하지 않은 것(0 μg/mL)을 기준으로 농도별(100, 200, 300 μg/mL)로 60A 용출액을 첨가한 결과를 상대적인 cell viability로 나타내었다(Fig. 6A). 측정결과, 1% HAc 추출물의 60A 용출액은 300 μg/mL의 농도까지 대식세포 생존율에는 거의 영향을 주지않는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 마우스 대식세포에 대해서는 1% HAc 추출물의 60A 용출액은 세포독성이 거의 없다는 것을 나타내는 것이다(Lee and Seo, 2021b).

Fig. 6. Effect of 1% HAc extract 60A eluate on cell viability (A) and the production of nitric oxide (NO) (B) or prostaglandin E2 (PGE2) (C) in RAW 264.7 cells. A, Cell viability of 1% HAc extract 60A eluate was determined by crystal violet assay using RAW 264.7 macrophages. The data are expressed cell viability as % of untreated control (Mean±SD, *P<0.05, Elute treated vs untreated control); B, RAW 264.7 cells were treated with various concentrations (100, 200, and 300 μg/mL) of 60A eluate and LPS (1 μg/mL), and then incubated for 18 h. Nitrite levels in the culture media were determined by using the Griess reagent and were presumed to reflect the levels of NO; C, RAW 264.7 cells were treated with various concentrations (100, 200, and 300 μg/mL) of 60A eluate and LPS (1 μg/mL), and then incubated for 18 h. PGE2 levels in the culture media were determined by using ELISA kit. The values shown are mean±SD of three independent experiments. *P<0.05 vs the LPS-induced group.

1% HAc 60A 용출액의 염증매개인자(nitric oxide, prostaglandin E2) 생성 억제 효과 측정

그람 음성균의 병원체 관련 분자 패턴(pathogen-associated molecular patterns) 중의 하나로 알려진 LPS (lipopolysaccharide)가 선천면역을 담당하는 탐식세포인 대식세포의 패턴인지 수용체(pattern recognition receptor)인 TLR-4에 의해 인식되면 NO (nitric oxide) 또는 PGE2 (prostaglandin E2) 등의 염증매개인자의 생성을 유발함으로써 염증반응이 유도된다고 알려져 있다(Mogensen, 2009; Kim et al., 2014; Kim et al., 2018). 그러나 과도하게 생성된 NO 또는 PGE2 등의 염증성 매개인자를 조절하지 않으면 염증성 질환의 발병에 영향을 주게 되므로 과도한 염증반응은 효과적으로 조절되어야 한다(Choi and Kim, 2013; Bae et al., 2016). 이러한 NO 또는 PGE2 생성과 (만성)염증반응 간의 연관성을 토대로 마우스 대식세포주인 Raw 264.7 세포의 염증반응에서의 NO와 PGE2 생성에 대한 1% HAc 추출물의 60A 용출액의 영향을 측정함으로써 항염증 활성을 탐색하였다. 이를 위해서 대식세포 배양액에 1 μg/mL의 LPS를 처리해서 염증반응을 자극하고 서로 다른 농도(100, 200, 300 μg/mL)의 60A 용출액을 혼합하고 18 h 배양한 후, 세포 배양액에 존재하는 NO의 농도는 Griess 시약을 이용한 nitrite/nitrate assay kit를 사용하여 흡광도를 측정하였으며, PEG2의 농도는 ELISA kit를 사용하여 흡광도를 측정하였다(Fig. 6B, 6C). 측정결과, LPS 처리에 의해서 대식세포로부터 강하게 NO 및 PGE2의 생성이 유도되었으며, 유도된 NO와 PGE2의 농도는 60A 용출액의 처리에 의해서 농도 의존적으로 유효하게 감소되는 것으로 나타났다(Fig. 6B, 6C). 이러한 결과는 1% HAc 추출물의 60A 용출액은 농도 의존적으로 염증성 매개인자인 NO와 PGE2의 생성을 억제시키는 항염증 물질을 포함하고 있다는 것을 나타내는 것이다.

1% HAc 60A 용출액의 전염증성 cytokines 생성 억제 효과 측정

과도한 면역반응의 결과로 생성된 전염증성 cytokine (TNF-α, IL-6, IL-1β)들은 조직 및 세포의 손상을 유발하며, 면역체계의 불균형을 초래하게 되어 자가 면역질환, 알레르기, 아토피 등을 유발할 수 있으므로 전염증성 cytokine의 발현조절은 면역체계 균형 유지를 위한 매우 중요한 작용으로 알려져 있다(Kang et al., 2015). 따라서 1% HAc 추출물 60A 용출액의 전염증성 cytokines 발현에 미치는 영향을 ELISA법을 이용하여 측정하였다. 이를 위해서 Raw264.7 cell에 1 μg/mL의 LPS를 처리해서 염증반응을 자극하고, 서로 다른 농도(100, 200, 300 μg/mL)의 1% HAc 추출물 60A 용출액을 혼합하고 18 h 배양한 후, 세포 상층액에 존재하는 전염증성 cytokine들(TNF-α, IL-6, IL-1β)의 농도변화를 측정하였다. 측정결과, LPS 처리에 의해서 Raw264.7 cell로부터 강하게 TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 발현이 유도되었으며, 유도된 전염증성 cytokine들의 농도는 60A 용출액의 처리에 의해서 농도 의존적으로 생성량이 유효하게 감소되는 것으로 나타났다(Fig. 7). 이러한 결과는 1% HAc 추출물의 60A 용출액은 농도 의존적으로 TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 생성을 억제하는 항염증 효과를 나타내는 물질들이 포함되어 있다는 것을 나타내는 것이다.

Fig. 7. Effect of 1% HAc extract 60A eluates on the production of TNF-α (A), IL-6 (B) and IL-1β (C) in RAW 264.7 cells. RAW 264.7 cells were treated with various concentrations (100, 200, and 300 μg/mL) of 1% HAc extract 60A eluate and LPS (1 μg/mL), and then incubated for 18 h. The levels of pro-inflammatory cytokines (TNF-α, IL-6 and IL-1β) in the cell culture media were determined by using ELISA kit. TNF, Tumor necrosis factor; IL, Interleukin. The values shown are mean±SD of three independent experiments. *P<0.05 vs the LPS-induced group.

본 연구결과 거북손 내부조직의 1% HAc 추출물 60A 용출액은 세포독성은 거의 없는 반면에 어병세균을 포함하는 다양한 세균에 대해서 유효한 항균활성을 나타내었으며, 포함된 항균물질은 비단백질성의 유기화합물로서 효소, salt 및 temperature에 대한 안정성을 가지는 것으로 확인되었다. 또한, 거북손 내부조직의 1% HAc 추출물 60A 용출액은 대식세포에서 염증성 매개인자(NO, PEG2)와 전염증성 cytokines (IL-6, IL-1β, TNF-α)의 발현을 억제하는 항염증 효과가 있는 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 거북손 추출물의 생리활성 연구 및 기능성 연구에 대한 기초자료로서 활용 가능할 것으로 판단된다.

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