Korean Journal of Fisheries and Aquatic Sciences (한국수산과학회지)

The Korean Society of Fisheries and Aquatic Science (한국수산과학회)
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Cross-breeding of Neopyropia spp. (Bangiales, Rhodophyta) Using CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence) Markers

CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence) 마커를 적용한 김 교잡육종 기술 개발

  • Eun-Jeong, Park (Aquatic Plant Variety Center, National Institute of Fisheries Science)
  • 박은정 (국립수산과학원 수산식물품)
  • Received : 2022.12.19
  • Accepted : 2023.01.30
  • Published : 2023.02.28
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Abstract

This study aimed to cross between Korean and Japanese pure lines of Neopyropia strains to establish cross breeding technology and identify a superior variety that harbors the strength of both parents. Four crossing combinations were tried using three methods, resulting in 1,476 single conchocelis colonies. The three co-dominant Cleaved Amplified Polymorphic Sequence (CAPS) markers (EF-1α/Mse I, TOP2/Mse I, car A/ApaL I) were used to distinguish heterozygotic sporophytes and their maternal lines obtained from the inter and intraspecific cross-fertilization within the wild type of Neopyropia strains. Of the 1,476 colonies, 26.9% (218) were heterozygotes obtained from the nuclear CAPS markers. Their maternal line was clearly confirmed using organelle CAPS marker and chimeric thallus was obtained from crossing experiment of Japanese N. yezoensis (♀) and Korean N. yezoensis (♂). The use of CAPS markers improved the efficiency of crossbreeding by quickly screening heterozygotes and maternal lines in the conchocelis phase, which otherwise required pigmentation mutants as genetic markers.

Keywords

서론

김(Neopyropia spp.)은 국내 해조류 양식생산 품목 중 가장 부가가치가 높은 품목으로 2021년 기준으로 양식생산량은 약 55만톤, 생산금액은 약 4,750억원으로 국내 해조류 양식생산금액의 63%를 차지하고 있다(MOF, 2021). 특히, 2021년에는 전 세계 114개국을 대상으로 수출 6.93억달러를 달성하여 농수산식품 중 1위 수출품목이 되었으며, 라면 6.8억달러와 궐련 6.7억 달러보다 높은 실적을 올렸다. 국내 김 양식 대표종인 방사무늬김(Neopyropia yezoensis Ueda)은 연간 양식생산량의 약 70%를 점유하고 있으며, 잇바디돌김(Neoporphyra dentata Kjellman)과 모무늬돌김 Neoporphyra seriata Kjellman)에 비해 얇고 부드러워 주로 김밥용 김과 수출에 사용되는 마른김으로 가공되고 있다. 따라서 고생산성, 고품질, 고수온 대응 품종 개발에 대한 산업적인 수요가 지속되고 있다. 한편, 우리나라는 지난 2002년에 국제식물신품종보호동맹(International Union for the Protection of New Varieties of Plants, UPOV)에 가입하였으며, UPOV 협약에 따라 가입 후 10년이 되는 2012년 1월 7일에 품종보호대상을 모든 식물로 확대하게 되어 해조류도 품종보호를 받는 작물에 포함되었다. 이에 따라 국내에 출원·등록된 김 품종을 사용할 경우에는 품종의 육성자에게 품종 사용료(로열티)를 지불해야 하는 문제가 발생했다. 게다가 2012년에는 품종보호제도가 전면적으로 시행됨에도 불구하고 국내에서 양식 생산되고 있는 방사무늬김의 약 40%가 일본에서 개발된 품종을 사용하여 양식되는 것으로 추정되어 김 육종기술 개발뿐만 아니라 자체 우량 신품종의 개발 및 보급의 필요성이 크게 대두되었다(NFRDI, 2008). 이렇듯 우리나라의 김 육종 연구는 일본 방사무늬김 품종을 대체하기 위한 목적으로 가속화 되었으며, 국내 김 자생품종의 단점인 채묘 이후 육묘기에 단포자를 대량 방출하는 점을 개선하여 채묘 과밀에 따른 생장저하를 방지하여 생산성을 높이는 것에 주안점을 두고 있다. 국내의 김 육종 연구는 대부분 전통적인 선발육종으로 품종개량을 시도했으며, 잇바디돌김과 긴잎돌김(Pyropia pseudolinearis Ueda)의 종간 교잡종의 생리특성에 관한 보고(Kim, 2000)와 세포배양기술에 의한 내저염성 품종개발에 대한 보고(Hong et al., 1989) 등이 있다. 하지만 전통적인 선발육종법에 의한 신품종 개발은 목적형질에 맞는 모조를 획득하는 과정에서 우연성에 크게 의존해야 하며, 육성된 신품종이 당초의 육종 목적과 맞지 않을 수 있다는 단점이 있다. 반면, 교잡육종법은 양친의 우량 형질이 동시에 발현되는 품종개발이 가능하다는 장점이 있지만, 자가수정의 확률이 높은 자웅동주체 간의 교잡에서 타가수정을 유도하기 위해서는 고도의 기술이 요구되며, 교잡 확인용 마커로 색소변이체 또는 DNA 마커가 필요하다는 단점이 있다(Miura and Kunifuji, 1980; Ohme et al., 1986; Ohme and Miura, 1988; Niwa et al., 1993, 2002). 또한, 교잡육종을 위해서는 교잡체 유도, 교잡 여부 확인, 모계 확인, 우량 개체군 선발 등 기술적인 요소뿐만 아니라 많은 시간과 공간을 필요로 해왔다. 하지만, 최근 공우성 Cleaved Amplified Polymorphic Sequence (CAPS) 마커의 개발로 김류의 유전적 다양성 조사 (Niwa et al., 2009a, 2009b)뿐만 아니라 교잡을 위한 대상 선정 및 교잡 여부 확인에 활용되고 있다(Niwa et al., 2004, 2005,2009a, 2020, 2021; Park et al., 2007, 2008a, 2008b; Choi et al., 2008; Abe et al., 2010).

본 연구에서는 교잡육종법을 통해 일본품종과 자생품종의 형질을 동시에 나타내는 우량 계통주를 선발하고자 하였다. 또한, CAPS 마커를 적용하여 2n 상태의 사상체(conchocelis) 단계에서 교잡여부 및 교잡체의 모계를 확인함으로써 교잡육종 기술 확립뿐만 아니라 교잡의 효율성을 높이고자 하였으며, 방사무늬김의 종내 및 근연종인 참김(N. tenera Kjellman)과의 종간 교잡 시 타가수정률을 높이기 위한 다양한 교잡방법을 제시하고자 한다.

재료 및 방법

종내 및 종간 교잡체 유도

종내 및 종간 교잡체 유도를 위해 한국산 참김 진도(Korean N. tenera, KNT), 한국산 방사무늬김 완도(Korean N. yezoensis, KNY), 일본산 방사무늬김 TKR 10-1 (Japanese N. yezoensis, JNY)의 3 계통주를 이용하였으며, Park (2006)의 방법으로 순계주(pure-line)를 유도하였다(Fig. 1). 한국산과 일본산 계통주의 형질특성을 모두 나타내는 교잡체를 얻기 위해 다음과 같은 네 가지 조합으로 교잡실험을 하였다; ① KNY (♀)×JNY (♂), ② JNY (♀)×KNY (♂), ③ KNT (♀)×JNY (♂), ④ JNY (♀)×KNT (♂). 또한 자웅동주인 방사무늬김과 참김의 특성을 고려하여 다음과 같은 세 가지 방법을 적용하여 타가 수정률을 높이고자 하였다. 첫 번째 방법(crossing A)은 야생형(wild type) 간의 교잡실험 후, 암배우체로 가정한 엽체를 형질특성으로 쉽게 구분하기 위해 (♀) 2–3개체와 (♂) 10–12개체의 성숙한 엽체를 15°C, 80 μmol·m-2·s-1의, 10L (light):14D (dark) 조건의 인큐베이터(MTI-202B; EYELA, Tokyo, Japan)에서 PES (provasoli’s enfiched seawater) 배지(Provasoli, 1968)가 담긴 동일 플라스크에 그대로 넣어 5일간 통기배양하였다(Fig. 2). 두 번째 방법(crossing B)은 암·수배우체로 가정한 엽체에서 각각 성숙부위만을 약 1 cm2 크기로 절단한 2–3개 및 10–12개의 엽체 조각을 동일 플라스크에 넣어 crossing A와 같은 배양조건에서 5일간 통기배양하였다(Fig. 2). 세 번째 방법 (crossing C)은 가장 보편적으로 이용되어 온 방법으로 암·수배우체의 가정 없이 양친으로 사용된 엽체의 성숙부위만을 약 1cm2 크기로 8–10개씩 절단하여 동일 플라스크에 넣고 crossing A와 같은 배양조건에서 5일간 통기배양하였다(Fig. 2). 그 후, crossing A, B 실험에서는 암배우체로 가정하여 넣은 엽체와 엽체 조각을, crossing C 실험에서는 암·수배우체 구분없이 넣은 엽체 조각을 꺼내어 petri dish에 옮겼다. 과포자 방출을 확인한 후, 육안으로 사상체군이 확인될 때까지 20°C, 30μmol·m-2·s-1, 14L:10D 조건의 인큐베이터(MTI-202B; EYELA)에서 정치배양(stock culture)하였다. 이후, 단일 사상체군을 무작위로 선별하여 12 well plate에 분리하여 DNA 추출을 위해 약 45일 동안 정치배양하였다(Fig. 2).

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Fig. 1. Gametophytic thalli of the three Neopyropia strains (A) used in crossing experiments and their reproductive parts (B-D). A, Korean N. tenera, Korean N. yezoensis, and Japanese N. yezoensis; B, Surface view of spermatangia and carpogonia of the Korean N. tenera; C, Surface view of spermatangia and carpogonia of the Korean N. yezoensis; D, Surface view of spermatangia and carpogonia of the Japanese N. yezoensis; Scale bar 100 μm.

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Fig. 2. Schematic view of the three method of crossing experiment used in this study (A-C). A, Crossing A was made by coculturing with a large number of mature paternal thalli and a small number of mature maternal thalli; B, Crossing B was made by coculturing with a large number of mature paternal parts and a small number of mature maternal parts; C, Crossing C was made by coculturing with the same number of mature parts obtained from the paternal and maternal thalli.

DNA 추출

총 네 가지 조합 및 세 가지 방법을 적용한 교잡실험으로부터 1,476개의 단일 사상체군을 무작위로 선별하여 배양하였다. 교잡여부 및 모계 확인을 위한 CAPS 분석 대상으로 생장이 양호하고 규조류 등의 오염이 적은 808개의 사상체군에서 DNA를 추출하였다. 사상체의 수분은 paper towel을 이용하여 제거하였으며, 습중량 0.5 mg의 사상체를 Chelex® 100 수지(Bio Rad, Hercules, CA, USA) 0.02 g과 TE buffer [10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 8.0)] 200 μL가 들어있는 1.5 mL 원심튜브에 넣었다. 분쇄봉(As One, Osaka, Japan)을 사용하여 사상체를 잘게 갈아 혼합액으로 만들었으며, 100°C에서 10분 동안 배양한 후, 12,000 g의 속도로 10분 동안 원심분리하여 상층액을 얻어냈다.

CAPS 마커를 이용한 교잡여부 및 모계 확인

교잡실험 후 분리하여 배양한 사상체를 대상으로 교잡여부 및 교잡체의 모계를 확인하기 위해 Park (2006)와 Choi et al. (2008)의 연구에서 보고된 CAPS 마커를 이용하였으며 (Table 1, Table 2), 본 연구에서 사용된 순계사상체를 대상으로 적용 가능성을 확인하였다. KNY (♀)×JNY (♂)와 JNY (♀)×KNY (♂)의 교잡실험에서 얻어진 사상체군의 교잡여부 확인은 EF-1α (ORF)의 PCR (polymerase chain reaction) 산물을 Mse I으로 처리한 CAPS 마커 분석을 통해 이루어졌다. 그리고 KNT (♀)×JNY (♂)와 JNY (♀)×KNT (♂)의 교잡실험에서 얻어진 사상체군의 교잡여부 확인은 Top2의 PCR 산물을 Mse I으로 처리하여 CAPS 밴드 유형을 분석하였다(Table 1, Table 2). 또한 타가수정으로 확인된 교잡사상체군에 대한 모계 확인은 엽록체 DNA 유래의 carA의 PCR 산물을 ApaL I의 처리를 통해 이루어졌다(Table 1, Table 2; Choi et al., 2008). 각각의 CAPS 밴드 유형은 자동전기영동장치(MultiNA MCE-202; Shimadzu Co., Tokyo, Japan)를 이용하여 분석하였다.

Table 1. List of primers used in the CAPS analysis and their PCR amplification conditions for screening heterozygotes and their maternal line

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TA, Annealing temperature; CAPS, Cleaved Amplified Polymorphic Sequence; PCR, Polymerase chain reaction.

Table 2. CAPS makers for screening heterozygotes and their maternal line

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CAPS, Cleaved Amplified Polymorphic Sequence; KNY, Korean Neopyropia yezoensis; JNY, Japanese Neopyropia yezoensis.

우량 교잡체 선발

우량한 형질의 교잡체를 선발하기 위하여 교잡체로 확인된 사상체 중 KNY (♀)×JNY (♂)의 교배실험으로 얻어진 B-②-41 계통주에서 각포자 방출과 발아를 유도한 후, 유엽의 온도별 생장도를 조사하였다. 사상체의 생장을 위해 20°C, 30 μmol·m-2·s-1, 10L:14D 조건의 인큐베이터(MTI-202B; EYELA)에서 PES배지(Provasoli, 1968)가 담긴 300 mL의 플라스크에 넣어 통기배양 하였다. 이후 각포자낭의 형성을 위해 14L:10D 조건으로 옮겨 통기배양 하였으며, 각포자낭 형성 후 유엽을 유도하기 위해 15°C, 80 μmol·m-2·s-1, 10L:14D으로 옮겨 5 cm의 배양실을 5–10개 넣고 통기배양 하였다. 엽장, 엽폭, 엽장/엽폭비는 5, 10, 15 및 20°C의 온도별로 광도 40 μmol·m-2·sec-1와 10L:14D의 조건에서 총 12주 동안 1주 간격으로 총 24개 엽체를 측정하여 조사하였다.

결과

종내 및 종간 교잡체 유도에는 순계로 개발된 KNT, KNY, JNY TKR 10-1을 이용하였으며, 네 가지 교잡조합과 타가 수정률을 높이기 위한 세 가지 교잡방법을 적용하여 총 18회의 교잡실험을 수행하였다(Fig. 1, Fig. 2, Table 3). KNY (♀·♂)×JNY (♂·♀)의 교잡실험에서 총 720개의 단일 사상체를 분리하였으며, KNT (♀·♂)×JNY (♂·♀)의 교잡실험에서 총 756개의 단일 사상체를 분리하여 총 1,476개의 단일 사상 체군을 확보하였다(Table 3).

Table 3. The number of crossing times and the separated conchocelis according to the combination and method of crossing experiments

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KNY, Korean Neopyropia yezoensis; JNY, Japanese Neopyropia yezoensis.

KNY (♀·♂)×JNY (♂·♀)의 교잡실험으로부터 얻어진 720개의 사상체 중에서 오염이 적고 생장이 양호한 414개의 사상체군을 대상으로 한 EF-1α (ORF)의 PCR 산물은 약 1,200bp 크기로 확인되었다(Fig. 3A, Table 1). 교잡여부를 확인하기 위한 CAPS 분석으로 Mse I을 처리한 결과, 사상체 24, 26, 27, 39–44에서는 KNY의 밴드 유형인 약 760, 460 bp의 2개의 밴드와 JNY의 밴드 유형인 약 1,200 bp의 단일 밴드로 나타나는 양친의 CAPS 유형이 모두 확인되었다. 나머지 15개의 사상체군은 모두 JNY의 밴드 유형만을 나타내어 JNY의 자가수정 유래임을 확인하였다(Fig. 3B, Table 2). 총 414개의 사상체군을 대상으로 한 EF-1α (ORF)/Mse I의 CAPS 분석으로 양친의 밴드 유형을 모두 나타낸 107개의 교잡사상체를 분리하였다(Table 4).

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Fig. 3. Confirmation of cross-fertilization within conchocelis colonies obtained from the crossing experiment JNY (♀)×KNY (♂) by EF-1α (ORF)/Mse I CAPS marker (21-45). JNY, Japanese Neopyropia yezoensis; KNY, Korean Neopyropia yezoensis.

Table 4. The number of the heterozygotic conchocelis and the information of their maternal line according to the crossing experiments​​​​​​​

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KNY, Korean Neopyropia yezoensis; JNY, Japanese Neopyropia yezoensis.

총 107개의 교잡사상체를 대상으로 모계를 조사한 결과, KNY가 모계인 개체군은 95개(88.8%), JNY가 모계인 개체군은 12개(11.2%)로 분석되었다(Table 4). 약 950 bp 크기의 carA의 PCR 산물을 ApaL I으로 처리한 CAPS 분석 결과를 보면, 조사한 모든 교잡사상체에서 950 bp의 단일 밴드로 나타나는 JNY의 유형으로 확인되어 JNY가 모계인 교잡사상체로 확인되었다(Fig. 4, Table 2, Table 4).

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Fig. 4. Confirmation of maternal line within heterozygotic conchocelis obtained from the crossing experiment KNY (♀·♂)×JNY (♂·♀) by car A/ApaL I CAPS marker (22-44). KNY, Korean Neopyropia yezoensis; JNY, Japanese Neopyropia yezoensis.​​​​​​​

KNT (♀·♂)×JNY (♂·♀)의 교잡실험으로부터 얻어진 756개의 사상체군 중 오염이 적고 생장이 양호한 394개의 사상체군을 대상으로 한 TOP2의 PCR 산물은 약 1,200 bp 크기로 확인되었다(Fig. 5A, Table 1). 교잡여부를 확인하기 위한 CAPS 분석으로 Mse I을 처리한 결과, 사상체 52, 53, 65, 67, 70–72, 74에서는 KNT의 밴드 유형인 약 570, 450, 190 bp와 JNY의 밴드 유형인 약 750, 240, 210 bp로 모두 6개의 밴드 유형이 나타나 교잡체로 확인되었으며, 나머지 17개의 사상체군은 모두 KNT (51, 54–64, 66, 68, 69, 75) 또는 JNY (73)만의 밴드 유형을 나타내어 각각의 자가수정 유래의 사상체임을 확인하였다(Fig. 5B, Table 2). 총 394개의 사상체군을 대상으로 한 TOP2/Mse I의 CAPS 분석으로 양친의 밴드 유형을 모두 나타낸 111개(28.1%)의 교잡사상체를 분리하였다(Table 4).

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Fig. 5. Confirmation of cross-fertilization within conchocelis colonies obtained form the crossing experiment KNT (♀·♂)×JNY (♂·♀) by TOP2/Mse I CAPS marker (51-75). KNY, Korean Neopyropia yezoensis; JNY, Japanese Neopyropia yezoensis.​​​​​​​

총 111개의 교잡사상체를 대상으로 모계를 조사한 결과, KNT가 모친인 개체군은 105개(94.6%), JNY가 모친인 개체군은 6개(5.4%)로 분석되었다(Table 3). CAPS 분석 결과를 보면, 약 950 bp 크기의 carA의 PCR 산물을 ApaL I으로 처리한 후, 조사한 교잡사상체 중 52, 53, 65, 74는 KNT의 540, 410 bp의 밴드 유형을 나타내어 KNT가 모계인 교잡사상체임을 확인하였다. 반면, 67, 70–72는 JNY의 약 950 bp의 밴드 유형을 나타내어 JNY가 모계인 교잡사상체임을 확인하였다(Fig. 6, Table 2, Table 4).

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Fig. 6. Confirmation of maternal line within heterozygotic conchocelis obtained from the crossing experiment KNT (♀·♂)×JNY (♂·♀) by car A/ApaL I CAPS marker (52-74). KNY, Korean Neopyropia yezoensis; JNY, Japanese Neopyropia yezoensis.​​​​​​​

이상의 CAPS 분석 결과를 요약해 보면, 총 1,476개의 사상체군 중에서 선별한 808개의 사상체군을 대상으로 두 가지 세트의 마커로 분석한 결과, 양친의 밴드 유형을 모두 나타낸 교잡사상체군은 종내 교잡실험에서 107개와 종간 교잡실험에서 111개로 총 218개로써 타가수정률은 26.9%로 나타났다(Fig. 3B, Fig. 5B, Table 4).

JNY (♀)×KNY (♂)의 교잡 조합으로 crossing B 방법에서 얻어졌으며, JNY가 모계인 교잡사상체 B-②-41에서 각포자 방출과 발아를 유도한 후, 유엽의 온도별 생장도를 12주 동안 조사하였다. 5, 15, 20, 25°C 조건에서는 5주 이후부터 엽체의 생장이 급격하게 저조해짐과 동시에 엽체가 심하게 탈락하여 형질특성 조사를 종료하였다. 10°C에서의 초기 유엽 생장은 6주까지는 다소 느리게 나타나 엽장 6.2 mm±2.3 mm, 엽폭 3.3 mm±0.9 mm, 엽장/엽폭 2.0±0.8이였으나, 그 이후부터는 빠르게 생장하여 12주에는 엽장 113.3 mm±83.0 mm, 엽폭 27.2 mm±10.0 mm, 엽장/엽폭은 7.7±16.8로 엽장이 길고 엽폭이 좁은 형태의 세장형 대형 엽체로 생장하였다(Fig. 7). 특히, 10°C에서는 다른 엽체들에 비해 생장속도가 월등하게 빠른 엽체가 선발되었으며, 엽체의 생장은 16주까지 지속되어 엽장 124 cm, 엽폭 15 cm로 나타났다. CAPS 마커로 사상체 단계에서 교잡여부 및 모계를 확인한 이후에 얻어진 F1 세대로 엽체 일부분에 양친의 엽색(JNY, 연갈색; KNY, 진갈색)이 모두 발현되는 색상 구분 키메라(chimeric thallus)로 확인되어 육안으로도 교잡여부를 확인하였다(Fig. 8).

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Fig. 7. Blade length, blade width and the ratio of blade length/width of the hybrid B-②-41 originated from the crossing with JNY (♀)×KNY (♂) under the different temperature conditions. Bar indicate the mean±standard deviation. JNY, Japanese Neopyropia yezoensis; KNY, Korean Neopyropia yezoensis.

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Fig. 8. Chimeric F1 thallus selected from the hybrid conchocelis of B-②-41 strain which was originated from crossing with JNY (♀)×KNY (♂). JNY, Japanese Neopyropia yezoensis; KNY, Korean Neopyropia yezoensis.

고찰

본 연구에서는 자웅동주체인 방사무늬김 간의 종내 교잡 및 근연종인 참김과의 종간 교잡 시 타가수정율을 높이기 위한 세 가지 교잡방법을 시도하였다. 기존의 교잡연구에서는 주로 crossing B 방법을 사용하였으며(Niwa, 2010; Niwa et al., 2010), 모계로 설정한 엽체의 성숙부위 1조각과 부계로 설정한 엽체의 성숙부위 3조각을 함께 배양한 후 키메라 엽체의 출현비를 조사하여 재조합 비율 등을 제시하였다(Niwa, 2010; Niwa et al., 2010). 본 연구에서 제시한 세 가지 교잡방법 중에서 crossing C의 타가수정율은 KNY (♀·♂)×JNY (♂·♀) 조합에서 15.7% 와 KNT (♀·♂)×JNY (♂·♀)의 조합에서는 12.8%로 나타났다(Fig. 2, Table 4). 이는 crossing A와 B의 실험에서 최고 100%와 최저 21%로 나타난 타가수정율에 비하면 낮은 수치이지만, 교잡체를 확보하기에는 안정적인 교잡방법으로 확인되었다(Fig. 2, Table 4). 즉, CAPS 분석으로 교잡여부 및 모계를 확인할 수 있기 때문에 모계 및 부계의 설정이 필요하지 않으며, 자가수정율이 높아지는 것이 불가피하여 타가수정율의 향상은 어려운 것으로 판단된다. 반면, crossing C에 비해 crossing A와 B에서는 교잡체가 하나도 얻어지지 않아 0%의 타가수정율을 나타내거나, 분석한 모든 사상체가 교잡체로 확인되어 100%의 타가수정율을 나타내는 등 극단적인 결과들이 얻어졌다(Fig. 2, Table 4). 이는 교잡에 사용된 모계의 엽체가 이미 자가수정이 이루어졌거나, 자가수정 되기 전에 교잡에 활용되어 교잡의 최적 조건이었기 때문으로 추정된다. 즉, crossing A와 B는 타가 수정율을 높이기 위해 부계의 엽체 또는 엽체의 조각을 모계 보다 4–5배 많이 넣어 함께 배양했기 때문에 crossing C 보다 타가수정이 일어날 수 있는 적절한 타이밍이 크게 작용하는 것으로 생각된다(Fig. 2).

본 연구에서는 총 808개의 사상체를 대상으로 교잡여부를 확인하였으며, 양친의 CAPS 유형을 동시에 나타내는 218개의 교잡사상체를 확보하여 자웅동주체인 참김과 방사무늬김을 이용한 교잡실험임에도 불구하고 타가수정율은 26.9%로 나타났으며, 교잡사상체의 모계를 신속·정확하게 판독하였다. 본 연구를 통해 소량의 DNA를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 실시한 후, 특정 제한효소를 처리하는 CAPS 분석법은 김의 교잡유무와 모계를 신속하고 간단하게 확인할 수 있는 유용한 기법임을 재확인하였다(Park, 2006; Choi et al., 2008; Niwa and Kobiyama, 2009). 과거에는 교잡여부 및 모계 확인을 위해 형질 마커로 녹색 또는 적색의 색소변이체가 반드시 필요했다 (Miura and Shin, 1989; Niwa et al., 1993, 2002, 2010; Shin, 1999; Jiang et al., 2020). 그 이유는 김이 가진 특성으로써 참김과 방사무늬김의 경우 자웅동주체로 자가수정의 확률이 매우 높고, 형태학적 특징도 극히 단순해서 형태 형질로는 교잡여부를 확인하기 어렵기 때문이다(Hwang et al., 2010; Niwa et al., 2010). 하지만, 본 연구에서는 교잡 이후 얻어진 복상(2n)의 사상체 단계에서 CAPS 마커를 적용하여 근연종 간의 교잡여부와 모계를 신속·정확하게 판독할 수 있는 방법을 제시함으로써 교잡 확인을 위한 색소변이체 유도는 더 이상 필요 없게 되었다. 또한 갈색의 야생형 간의 교잡이 가능해져 자웅동주체의 종간 또는 종내 교잡 적용 범위가 크게 확대될 뿐만 아니라 교잡육종에 소요되는 시간, 공간, 노동력이 획기적으로 줄어들게 되어 김교잡육종의 효율성이 크게 향상될 것으로 기대된다.

기존의 김 교잡을 통한 키메라 엽체의 출현은 여러 연구에서 보고된 바 있다. 김은 복상(2n)의 각포자(conchospore)가 발아할 때 첫 두 단계의 분열에서 감수분열(meiosis)이 일어난다고 알려져 있으며(Ma and Miura, 1984; Ohme and Miura, 1988; Mitman and van der Meer, 1994; Yan et al., 2005), 포자체 세대인 사상체(2n)가 이형접합체일 경우에는 각포자에서 발아한 배우체 세대인 엽체에서 키메라로 나타나게 된다. 본 연구에서는 모계는 일본산 방사무늬김이 부계는 한국산 방사무늬김으로 교잡된 사상체에서 얻어진 F1 세대의 엽체에서 키메라 출현을 확인하였다.

특히 본 연구는 야생형 방사무늬김의 종내 및 근연종인 참김과의 종간 교잡을 시도하여 자웅동주체의 특성을 가진 종의 교잡실험에서 타가수정율을 높일 수 있는 방법을 제시했으며, CAPS 마커를 활용하여 교잡 여부 및 모계를 신속·정확하게 판독하는 기술을 적용하여 김 교잡육종의 효율성을 크게 높였다. 또한 교잡사상체에서 각포자를 방출시켜 얻어진 F1 엽체 중에서 야생형 양친의 색상이 모두 나타난 키메라 엽체 확보에 대한 최초의 보고이다. 본 연구에서 확보한 키메라 엽체의 최적 생장 수온의 범위가 다소 좁은 것으로 확인되었지만, 생장속도가 빠르고 성숙 시기까지 지연되어 고생산성 품종으로의 개발이 가능할 것으로 판단된다.

사사

본 연구는 해양수산부 국립수산과학원(R2023022)의 지원으로 수행되었습니다.

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