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Anti-inflammatory Efficacy of HK Shiitake Mushroom Mycelium in LPS-treated RAW 264.7 Cells Through Down-regulation of NF-κB Activation

LPS로 활성화한 RAW 264.7 세포에서 HK표고버섯균사체의 NF-κB 활성 억제를 통한 항염증 효과

  • Received : 2022.03.07
  • Accepted : 2022.07.11
  • Published : 2022.07.30
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Abstract

HK shiitake mushroom mycelium (HKSMM), containing 14% β-glucan, is a health functional food ingredient individually approved by the Korea Ministry of Food and Drug Safety for liver health. The anti-inflammatory effect of a 50% aqueous ethanol extract of HKSMM (designated HKSMM50) was studied in RAW 264.7 macrophage cells treated with lipopolysaccharide (LPS). An active hexose correlated compound (AHCC) was used as a positive control. LPS-activated RAW 264.7 cells were treated with HKSMM50 and AHCC (0, 20, 100, 500 ㎍/ml) and cultured for 24 hr. Inflammation-related elements in the supernatant were measured using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kits, and the expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) and cyclooxygenase-2 (COX-2) proteins in the cells was analyzed by Western blotting. The HKSMM50 lowered iNOS and COX-2 protein expressions, and nuclear factor-kappa B (NF-κB), nitric oxide (NO) and prostaglandin E2 (PGE2) contents in a concentration-dependent manner as compared to LPS treatment. Similarly, the HKSMM50 lowered the content of pro-inflammatory cytokines interleukin-1β (IL-1β), tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-4 (IL-4) and interleukin-6 (IL-6) contents and increased the activity of antioxidant enzymes superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT). The efficacy of the AHCC treatment was similar to that of the HKSSM50 treatments. These results indicate that HKSMM50 showed an anti-inflammatory effect in LPS-treated RAW 264.7 cells by down-regulation of NF-κB signaling and suggest that HKSMM could be used as a health functional food ingredient to help improve immune function.

HK표고버섯균사체(HK shiitake mushroom mycelium, HKSMM)는 간 건강 개별 인정 건강기능식품이다. LPS로 활성화된 RAW 264.7 세포에서 HKSMM50 (HKSMM의 50% ethanol 수용액 추출물)의 항염증효과를 연구하였다. AHCC는 positive control로 사용하였다. LPS로 활성화된 RAW 264.7 세포에 HKSMM50 및 AHCC를 처리(0, 20, 100, 500 ㎍/ml)하고 24시간 배양하여 배양물의 염증 관련 인자는 ELISA kits로, 세포에 함유된 iNOS와 COX-2 protein 발현은 Western blotting으로 측정하였다. HKSMM50는 LPS 처리에 비해 농도 의존적으로 NF-κB 함량을 낮추었고, iNOS와 COX-2 protein 발현을 억제하여 NO와 PGE2 함량을 낮추었다. 더불어 HKSMM50는 LPS 처리에 비해 IL-1β, TNF-α, IL-4 및 IL-6의 함량을 낮추었으나 SOD와 CAT의 활성은 증가시켰다. AHCC도 HKSSM50 처리와 비슷한 효과를 나타내었다. 이 결과는 HKSMM50이 LPS로 활성화된 RAW 264.7 세포에서 NF-κB 신호전달을 억제하여 항염증효과를 나타내었으며, HKSMM은 면역기능증진에 도움을 줄 수 있는 건강기능식품원료로 사용할 수 있을 것이다.

Keywords

서론

염증(inflammation)은 외부 병원균으로부터 몸을 보호하는 선천성 면역반응(innate immunity reaction)으로 대식세포(macrophage)가 주로 관여한다[22, 26]. Gram negative bacteria cell wall의 lipopolysaccharide (LPS)는 대식세포 표면에 발현하는 toll-like receptor 4 (TLR4)에 결합하여 inflammatory mediators인 nitric oxide (NO) 및 prostaglandin E (PGE)와 pro-inflammatory cytokines인 tumor necrosis 2 2 factor-α (TNF-α), interleukin-6 (IL-6), interleukin-1β (IL-1β)등을 생성하여 염증반응을 유발한다[22, 23, 25].

Inflammatory mediators 및 cytokines의 과잉생산은 관절염, 천식, 다발성 경화증, 염증성 장질환 및 동맥경화증 등을 일으킨다[5, 20]. 과다한 inducible nitric oxide synthase (iNOS) 단백질 발현은 뇌암, 유방암, 폐암, 전립선암, 췌장암과 같은 많은 악성종양과 관련이 있다[11, 25]. 또한 과다한 cyclooxygenase-2 (COX-2)의 발현은 세포 손상, 부종, 신생혈관 형성 및 전이 같은 종양 생성과 깊은 관련이 있다[22, 25]. 따라서 이들 inflammatory mediators 및 cyto- kines의 생성을 억제할 수 있는 생리활성 물질에 대한 관심이 높아지고 있다.

Aspirin 및 non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) 같은 분자량이 작은 항염증물질은 COX-2 활성을 비가역적으로 저해하여 PGE의 생성을 낮춘다[8]. 또한 indome- 2 thacin 및 dexamethasone과 같은 inflammatory drugs도 NO 와 PGE2 합성을 억제하지만[29], 부작용이 따른다. 따라서 부작용 없이 안전하게 염증반응을 억제하는 천연물 소재를 개발이 요구된다.

표고버섯을 비롯한 다양한 식용 버섯은 in vitro 또는 in vivo에서 항염증작용이 있음이 밝혀졌는데, 이들 버섯에서 항염증작용을 갖는 물질은 주로 다당체 인 β-glucan 이다[2, 6, 9, 30, 36, 37]. 표고버섯에는 β-glucan인 lentinan (LNT; 1→3/1→6 결합)이 다량 함유되어있다[1, 4, 7]. 또한 표고버섯균사체로부터 제조한 active hexose correlated compound (AHCC)에는 74%가 β-glucan이고, 약 20%가 분자량이 5,000정도 되는 acethyl된 α-1,4-glucans으로 구성되어 있어. 병원균 침입과 암 발생에 대한 면역조절제로 사용되고 있다[38].

HK표고버섯균사체(HK Shiitake mushroom mycelium: HKSMM)는 β-glucan이 14% 함유된 식품의약품안전처의개별 인정 형 간 건강 건강기능식품이다[28]. HKSMM은CCl로 간 독성을 유발한 rats와 ethanol로 간 독성을 유발 4 한 rats에서 glutamate-oxalate transaminase (GOT), gluta- mate-pyruvate transaminase (GPT), 및 lactic dehydrogenase (LDH)를 감소시켰고 항산화효소[superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT)]활성을 증가시켜 간 기능 보호 효과가 우수한 것으로 확인되었다[12, 14]. 또한 한국인의 장기간 알코올 섭취자의 간 기능 개선에 도움이 될 수 있음이 확인되었다[16]. 따라서 β-glucan이 14% 함유되어 있는 HKSMM을 면역기능 증진 건강기능식품으로 활용하기 위한 면역효과 연구를 수행하였다.

본 연구에서는 HKSMM의 면역증진에 따른 항염증효과를 구명하기 위하여 HKSMM의 50% ethanol 수용액 추출물(HKSMM50)을 LPS로 활성화한 RAW 264.7 세포에 처리하여 nuclear factor-kappa B (NF-κB), COX-2 및 iNOS 와 염증 관련 cytokines을 측정하였다. AHCC를 positive control로 사용하였다.

재료 및 방법

재료 및 시약

HKSMM은 ㈜HK바이오텍(경남 진주시), AHCC는 KCFKOREA (서울)로부터 제공받았다. RAW 264.7 cells 은 ATCC (Koram Biotech Corp, 서울)에서 구입하였다. Fetal bovine serum (FBS), penicillin (100 U/ml), streptomycin (100 µg/ml), RPMI 1640, fetal bovine serum (FBS)은 Gibco사(MA, USA)에서 구입하였다. Sulfanilamide, phosphoric acid, N-1-naphthylethylenediamine dihydrochloride (NED), sodium nitrate와 LPS는 Sigma-Aldrich사(MO, USA) 에서 구입하였다. Cell counting kit-8 (CCK-8) (Enzo Life Sciences, MN, USA), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) assay kits (TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-4, NF-kB, SOD, CAT)는 Abcam사(Cambridge, UK)로부터 구입하였다. RIPA buffer (Thermo Scientific, MA, USA), Western blotting de-tecting reagents (GE Healthcare Life Sciences, Buckingham- shire, UK), Pierce bicinchoninic acid protein assay kit와 polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane (Millipore, MA, USA). Primary antibody rabbit anti-iNOS, COX-2 goat polyclonal, β-actin mouse polyclonal, anti-goat IgG horseradish HRP conjugate secondary antibody는 Santa Cruz사 (CA, USA)로부터 구입하였다. Enhanced chemiluminescence kit (ECL)는 Bio-Rad사(CA, USA)로 구입하여 사 용하였다. 그 외 사용된 시약은 reagent grade 이상이었다.

HKSMM 시료의 ethanol 수용액 추출물 제조

HKSMM (100 g)을 ethanol 수용액(0, 30, 50, 70, 95%) 1.0 l에 첨가하고 충분히 혼합한 다음 하룻밤 방치하였다. 혼합기로 균질화하고 원심분리(7,000 rpm, 4℃, 30 min)하여 얻은 상등액의 ethanol을 진공농축하여 제거하였다(50 ℃). Ethanol을 제거한 HKSMM 농축물은 동결건조하여 분말화하였다. HKSMM의 50% 수용성 ethanol 추출물(HKSMM50)을 RAW 264.7 세포 처리 시료로 사용하였다 (Fig. 1).

세포배양

RAW 264.7 세포는 10% FBS와 penicillin (100 U/ml), streptomycin (100 µg/ml)이 함유된 RPMI 1640 배지에서 배양(37℃, 5% CO2 incubator)하였다. RPMI 1640 배지에서 배양된 RAW 264.7 세포 1×105 cells/200 μl을 96 well plate 의 well에 분주 후 다시 24시간 배양하고 배양액을 제거하 였다. 여기에 LPS 1μg/100 μl을 분주한 다음 1시간 후에, HKSMM50 시료를 함유한 RPMI 1640 배지 일정량을 분주하고 24시간 배양하였다. AHCC도 HKSMM50 시료와동일한 방법으로 처리하고 배양하였다. Griess assay를 위한 시료 농도는 0, 40 μg/100 μl였고, CCK-8 assay를 위한시료 농도는 0, 8, 40, 200, 1,000 μg/90 μl였고, biochemical markers를 위한 시료 농도는 0, 4, 20, 100 μg/100 μl였다.

RAW264.7세포처리용HKSMM수용성ethanol 추출 물 선정(Griess assay)

RAW 264.7 세포에 LPS와 시료를 처리하고 24시간 배양한 배양액 100 μl를 96 well plate의 well에 분주하였다. 여기에 sulfamilamide solution (1% sulfanilamide/5% phosphoric acid) 50 μl를 분주하고 10분 후 NED solution (0.1% 수용액) 50 μl 분주하여 10분간 반응시켜(상온, 암실), ELSA microreader (SpectraMax i3, Molecular devices, CA, USA)로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준용액 (NaNO2 용액)도 시료와 동일한 방법으로 처리하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

시료의 세포독성 측정(CCK-8 assay)

LPS와 시료가 처리된 RAW 264.7 세포를 24시간 배양한 well에 CCK-8 용액 10 μl 첨가하고 2시간 배양한 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

Biochemical markers 및 SOD 및 CAT 활성 측정

LPS와 시료가 처리된 RAW 264.7 세포를 24시간 배양한 배양액은 biochemical marker assay (ELISA kit 사용)에 사용하였다. 각 biochemical marker assay는 ELISA kit 제조사의 분석방법에 준하여 분석하였다.

Western blotting

COX-2 및 iNOS protein 발현은 Raha 등[33]의 방법에 준하여 Western blotting으로 분석하였다. RAW 264.7 세포는 60 mm plate의 well에 5×105 cells을 seeding하였다. LPS 와 시료(HKSMM50 및 AHCC)를 처리하고 24시간 배양하였다. 이들 세포를 RIPA buffer로 lysis한 후 원심분리 (14,000 rpm, 30 min, 4℃)하였다. 배양액의 protein 함량은 Pierce bicinchoninic acid protein assay kit로 분석하였다. Protein (10 µg)을 10% SDS-PAGE로 분리한 후 PVDF membrane (Immunobilon-P, 0.45 mm)으로 transfer하였다. 분리된 protein band는 iNOS, COX-2, 및 actin 항체와 반응시켰다. Membrane을 ECL kit와 Western blotting detecting reagent로 처리하고 나타난 밴드는 ImageJ software (http:// imagej.nih.gov)로 정량화 하였다.

β-Glucan, total flavonoid및total isoflavonoid함량 분석

HKSMM50 시료의 β-glucan, total flavonoid 및 total iso-flavonoid 함량은 건강기능식품 기준 및 규격의 3-25 β- glucan, 3-48 total flavonoid, 및 3-53 대두 isoflavonoid 분석법에 준하여 분석하였다[27].

통계처리

Data는 3반복 결과를 mean ± SD (표준편차)로 표시하였다. Data 분석은 ANOVA를 통하여 분석하고 Duncan’s multiple range test 또는 Student’s t-test로 유의성 검증을 하였다.

결과

RAW264.7 세포에처리할HKSMM의수용성ethanol 추출물 선정

Fig. 1은 HKSMM 시료 100 g이 수용성 ethanol 용액 1.0 l에 용해되는 물질을 추출하고 동결건조 한 결과를 나타내고 있다. HKSMM의 수용성 ethanol 용액에 용해되는 물질은 증류수(0% ethanol)에 24.9%, 50% ethanol에 43.6%, 70% ethanol 용액에 43.0% 그리고 95% ethanol 용액에 23.1%였다. HKSMM 수용성 ethanol 추출물의 동결건조물 색깔은 증류수 추출물은 황갈색이었고, 나머지 수용성 ethanol 추출물은 갈색이었다.

Fig. 1. Yields of freeze-dried aqueous ethanolic solutions of HKSMM sample. HKSMM sample (100 g) was ex- tracted with various aqueous ethanolic solutions (1.0 l) by hand-shaking for 10 min, followed by storing at room temperature for over-night. After being cen- trifugation (7,000 rpm, 4℃), the supernatant was freeze-dried to get powder samples.

RWA 264.7 세포에 처리할 HKSMM 수용성 ethanol 추출물을 선정하기 위하여 LPS로 활성화된 RAW 264.7 세포에 HKSMM 수용성 ethanol 추출물 200 μg/ml을 처리하여 생성된 NO를 Griess assay로 측정하였다(Fig. 2). LPS 처리에 비해 모든 HKSMM 수용성 ethanol 추출물은 NO를 유의성있게 감소시켰지만(p<0.001), 50% ethanol 추출물이 가장 많은 NO를 감소시켰다. 따라서 RAW 264.7 세포에 처리할 HKSMM 수용성 ethanol 추출물은 50% 수용성 ethanol 추출물(HKSMM50)이 가장 적당하였다. HKSMM50에는 β-glucan 15.4%, total flavonoid 1.98 mg/g 및 total isoflavonoid 1.42 mg/g 함유되어 있었다.

Fig. 2. Relative NO production of various ethanolic solutions of HKSMM samples (0, 30, 50, 70, 95%) in the LPS-treated RAW 264.7 cells when analyzed by Griess assay. LPS-activated RAW 264.7 cells were treated with 200 μg/ml ethanolic extracts of HKSMM samples, followed by 24 hr incubation (5%, CO2, 37℃). Star markers represent significant differences by t-test against LPS treatment (*, p<0.05; **, p<0.01, and ***, p<0.001). Means with different letters represent sig- nificances at p<0.05 by Duncan’s multiple range test.

HKSMM50 시료의 cell viability

LPS로 활성화된 RAW 264.7 세포에 HKSMM50 시료를 최대 5,000 μg/ml 처리하고 24시간 배양한 후 CCK-8 방법으로 세포 viability를 측정하였다(Fig. 3). LPS 처리에 비해 HKSMM50 시료 5,000 μg/ml에서도 세포 생육에 크게 영향을 미치지 않았다. Positive control인 AHCC도 5,000 μg/ml 농도에서 세포 생육에 크게 영향을 미치지 않았다. 이 결과는 LPS로 활성화된 RAW 264.7 세포 실험에 HKSMM50 을 최대 5,000 μg/ml 처리할 수 있음을 의미한다.

Fig. 3. Cell viability of LPS-treated RAW 264.7 cells by HKSMM50 and AHCC samples. LPS-treated RAW 264.7 cells were incubated for 24 hr (5% CO2, 37℃) with various amount of HKSMM50 or AHCC sample. Cell proliferation was analyzed with CCK-8 assay. Means with different letters represent significances at p<0.05 by Duncan’s multiple range test.

HKSMM50의 NF-κB의 활성 억제

RAW 264.7 세포의 염증반응에서 가장 중요한 인자는 NF-κB이다. LPS로 활성화한 RAW 264.7 세포에 HKSMM50 시료(0, 20, 100, 500 μg/ml)를 처리하고 24시간 배양한 후 배양액의 NF-κB 함량을 ELISA kit를 사용하여 측정하였다(Fig. 4). Positive control인 AHCC는 100 μg/ml을 처리하 였다.

LPS 처리에 비해 HKSMM50 처리는 농도 의존적으로 유의성 있게 NF-κB 함량을 감소시켰다(p<0.01~p<0.001). HKSMM50 시료의 500 μg/ml 처리는 Control 수준으로 NF- κB의 함량을 감소시켰다. AHCC 시료 100 μg/g도 HKSMM50 시료 100 ug/g과 유사한 결과를 나타내었다. 이 결과는 HKSMM50 시료가 LPS로 활성화한 RAW 264.7 세포에서 NF-κB 활성을 down regulation함을 의미한다.

Fig. 4. Suppression of NF- κB production in LPS-treated RAW 264.7 cells by HKSMM50. LPS-treated RAW 264.7 cells were incubated for 24 hr (5% CO2, 37℃) with various concentrations of HKSMM50. Supernatants were used for NF-κB concentration assay, using its ELISA kit. Star marks represent significant differences by t-test against LPS treatment (*, p<0.05; **, p<0.01, and ***, p<0.001). Means with different letters repre- sent significances at p<0.05 by Duncan’s multiple range test. AHCC is a positive control.

HKSMM50시료의염증mediator인NO및PGE2함량 감소

LPS로 활성화한 RAW 264.7 세포에 HKSMM50 시료(0, 20, 100, 500 μg/ml)를 처리하고 24시간 배양한 후 배양액의 NO와 PGE2의 함량을 ELISA kit를 사용하여 측정하였다 (Fig. 5). Positive control로 AHCC 100 μg/ml를 처리하였다. LPS 처리에 비해 HKSMM50 시료 처리는 NO와 PGE 2 의 함량을 농도 의존적으로 유의성 있게 감소시켰다(p< 0.01~p<0.001). HKSMM50 시료 500 μg/ml 처리는 NO와 PGE2 함량을 Control 수준으로 감소시켰다. AHCC 100 μg/ ml도 동일한 농도의 HKSMM50 시료 효과와 유사하였다.

Fig. 5. Suppression of NO and PGE2 productions in LPS-treated RAW264.7 cells by HKSMM50 samples. LPS-treated RAW264.7 cells were incubated for 24 hr (5% CO2, 37℃) with various concentrations of HKSMM50 samples. Supernatants were used for NO and PGE assays, using their corresponding ELISA kits. Star marks represent significant differences by 2 t-test against LPS treatment (*, p<0.05; **, p<0.01, and ***, p<0.001). Means with different letters represent significances at p<0.05 by Duncan’s multiple range test. AHCC is a positive control.

HKSMM50 시료에 의한 NO와 PGE2의 함량 감소를 검증하기 위하여 LPS로 활성화한 RAW 264.7 세포에 HKSMM50 시료(0, 20, 100, 500 μg/ml)를 처리하고 24시간 배양한 후 세포에 함유된 iNOS와 COX-2 protein 발현을 Western blotting으로 분석하였다(Fig. 6). Positive control인 AHCC 시료도 HKSMM 시료와 동일한 농도(0, 20, 100, 500 μg/ml)를 처리하였다. LPS 처리에 비해 HKSMM50 처리는 iNOS와 COX-2 protein의 발현을 유의성 있게 감소 시켰다(p<0.001). iNOS와 COX-2 protein의 발현은 HKSMM 50 시료 농도 의존적으로 유의성 있게 감소되었다(p<0.001). HKSMM50 시료는 AHCC 시료보다 iNOS 및 COX-2 protein 발현을 더 강하게 억제하였다.

Fig. 6. Suppression of iNOS and COX-2 protein expressions in LPS-treated RAW264.7 cells by HKSMM50 samples. LPS-treated RAW264.7 cells were incubated for 24 hr (5% CO2, 37℃) with various concentrations of HKSMM50 and AHCC samples. The iNOS and COX-2 protein expressions were measured in lysates of the cells by Western blotting. Star marks represent significant differences by t-test against LPS treatment (*, p<0.05; **, p<0.01, and ***, p<0.001). Means with different letters represent significances at p<0.05 by Duncan’s multiple range test.

이들 결과는 HKSMM50은 LPS로 활성화된 RAW 264.7 세포에서 iNOS와 COX-2 protein 발현을 억제하여 NO와 PGE2 함량을 감소시켰음을 의미한다.

HKSMM50 시료의 pro-inflammatory cytokines 감소

LPS로 활성화한 RAW 264.7 세포에 HKSMM50 시료(0, 20, 100, 500 μg/ml)를 처리하고 24시간 배양한 후 배양액의 IL-1β, TNF-α, IL-4 및 IL-6의 함량을 ELISA kit를 사용하여 측정하였다(Fig. 7). Positive control로 AHCC 100 μg/ ml을 처리하였다.

Fig. 7. Suppression of some pro-inflammatory cytokines in LPS-treated RAW 264.7 cells by HKSMM50 samples. LPS-treated RAW264.7 cells were incubated for 24 hr (5% CO2, 37℃) with various concentrations of HKSMM50 samples. Supernatants were used for IL-1β, TNF-α, IL-6 and IL-4 assays, using their corresponding ELISA kits. Star marks represent significant differences by t-test against LPS treatment (*, p<0.05; **, p<0.01, and ***, p<0.001). Means with different letters represent significances at p<0.05 by Duncan’s multiple range test. AHCC was a positive control.

LPS 처리에 비해 HKSMM50 시료 처리는 IL-1β, TNF-α, IL-4 및 IL-6의 함량을 농도 의존적으로 유의성 있게 감소시켰다(p<0.05 - p<0.001). HKSMM50 시료 500 μg/ml 처리는 Control 수준으로 TNF-α와 IL-6의 함량을 감소시켰다. AHCC 100 μg/ml 처리도 HKSMM50 시료 100 μg/ml 처리 효과와 유사하였다. 이 결과는 HKSMM50 시료가 LPS로 활성화한 RAW 264.7 세포에서 IL-1β, TNF-α, IL-4 및 IL-6 의 함량을 감소시켰음을 의미한다.

HKSMM50 시료의 항산화효소SOD 및CAT 활성 증가

Fig. 8에서는 LPS로 활성화한 RAW 264.7 세포에 HKSMM50 시료(0, 20, 100, 500 μg/ml)를 처리하고 24시간 배양한 후 배양액의 SOD와 CAT의 활성을 나타내고 있다. LPS 처리는 SOD 효소 활성을 Control 처리에 비해 유의성 있게 감소시켰다(p<0.001). 그러나 HKSMM50 처리는 SOD 활성은 Control 수준으로 증가시켰다. AHCC처리 역시 유사한 결과를 보였다. CAT 효소 활성에서도 LPS 처리는 Control 수준으로 감소시켰지만(p<0.001), HKSMM50 처리는 농도 의존적으로 CAT 활성을 Control 수준으로 증가시켰다. AHCC 처리 결과도 동일한 HKSMM50 처리 농도와 유사하였다.

Fig. 8. Enhancements of superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) activities in LPS-treated RAW 264.7 cells by HKSMM50 samples. LPS-treated RAW264.7 cells were incubated for 24 hr (5% CO2, 37℃) with various concentrations of HKSMM50 samples. Supernatants were used for SOD and CAT activity assays, using their corresponding ELISA kits. Star marks represent significant differences by t-test against LPS treatment (*, p<0.05; **, p<0.01, and ***, p<0.001). Means with different letters represent significances at p<0.05 by Duncan’s multiple range test. AHCC was a positive control.

이 결과는 HKSMM50 시료는 LPS로 활성화된 RAW 264.7 세포에서 SOD와 CAT의 활성을 증가시켜 항산화효과가 있음을 의미한다.

고찰

NF-κB 신호전달을 통해 과도하게 생성된 NO와 PGE2 를 매개로 하는 염증반응은 다양한 질병과 관련이 있다. 따라서 본연구에서는 HKSMM50 [β-glucan 15.4%, total flavonoid 1.98 mg/g 및 total isoflavonoid 1.42 mg/g함유]의 LPS로 활성화된 RAW 264.7 세포에서 항염증 효과를 연 구하였다. HKSMM50은 NF-κB의 활성을 낮추었고 (Fig. 4), iNOS 및 COX-2 protein 발현을 억제하여(Fig. 6), NO와 PGE2의 함량을 감소시켰다(Fig. 5). 또한 pro-inflammatory cytokine인, IL-1β, TNF-α, IL-4 및 IL-6의 함량도 감소시켰다(Fig. 7). 반면에 HKSMM50는 항산화효소인 SOD와CAT의 활성을 증가시켰다(Fig. 8). 따라서 HKSMM50은 LPS로 활성화된 RAW 264.7 세포에서 핵 내의 NF-κB의함량을 감소시켜, iNOS와 COX-2 유전자 발현 억제에 따른 NO 및 PGE2의 생성을 감소시키고, pro-inflammatory cytokines의 생성을 억제하여 항염증효과를 나타내었다 (Fig. 9).

LPS로 활성화시킨 RAW 264.7 세포는 다양한 버섯의 항염증 효과 연구에 사용되었다[10, 37]. LPS로 활성화한 RAW 264.7 세포에서 표고버섯의 LNT가 NO와 TNF-α를 억제하여 항염증효과를 나타내었다[37], 표고버섯의 ethanol 추출물[10]과 표고버섯균사체의 열수추출물도 항염증효과가 있음이 보고되었다[10]. 더불어, 다양한 버섯의 열수 추출물(동충하초, 꽃송이버섯, 영지버섯 및 잎새버 섯)[13, 18, 17]과 ethanol 추출물(애린기버섯 양송이버섯, 느타리버섯, 만가닥버섯 차가버섯)[3, 21, 24, 31, 39, 41, 44]이 LPS로 활성화 된 RAW 264.7 세포에서 항염증효과가 있음이 보고되었다. 본 연구에서 50% ethanol 수용성추출물인 HKSMM50의 항염증효과는 이들 연구결과와 유사하다.

RAW 264.7 세포의 iNOS 및 COX-2 유전자의 promoter 영역에는 NF-κB, AP-1, CCAAT-enhancer box protein (C/ EBP), cAMP reaction element binding protein (CREB), inter- feron과 같은 전사인자 결합부위가 있다[40]. 이 중 NF-κB, AP-1은 LPS로 활성화된 RAW 264.7 세포에서 iNOS 및 COX-2 유전자 발현에 필요하다[15]. 따라서 NF-κB는 핵으로 이동해서 iNOS와 COX-2의 발현을 up-regulation 시킨다[22]. Xu 등[42]은 표고버섯에서 분리한 LNT가 LPS 로 활성화된 RAW 264.7 cells에서 MAP kinases, JNK1/2 및 ERK1/2를 활성화시켜 NF-κB (p65)의 핵에로의 이전을 억제하여 하였고, pro-infla- mmatory cytokines TNF- α와 NO를 억제하였다. 마찬가지로, 본 연구의 HKSMM50도 NF-κB의 활성을 억제하여 iNOS와 COX-2의 발현을 억제함으로서 NO 및 PGE2의 생성을 감소시켜 염증반응을 억제하였다(Fig. 9). 즉, HKSMM50은 LPS로 활성화된 RAW 264.7 cell에서 NF-kB 활성을 down regulation하여 항염증효과를 보였다.

Fig. 9. A proposed mechanism by which HKSMM50 exhibited anti-inflammatory effects in LPS-treated RAW264.7 cells through down-regulation of NF-kB activation. HKSMMS containing β-glucan (LNT) interacted with Dectin-1 and TLR2 and/or other receptor on the surface of the cells, resulting in the reduction of NF-κB trans- location into nucleus from cytosol. These reactions de- crease in iNOS and COX-2 protein expressions, and in pro-inflammatory cytokines TNF-α, IL-1β, IL-4 and IL-6 productions. Antioxidant actions of HKSMM50 were also involved in this process through LNT and polyphenols (PP). OS represents oxidative stress.

β-Glucan은 대식세포 표면에 존재하는 Dectin-1에 의해 주로 인식되고 TLR2에 의해서도 인식된다[2, 15, 30, 42]. Xu 등[42]은 표고버섯에서 유래한 LNT가 LPS로 자극하지 않은 RAW 264.7 세포의 Dectin-1과는 강하게, TLR2와는 약하게 결합하였으나 LPS로 자극된 RAW 264.7 세포에서 Detin-1을 anti-Dectin-1 mAb (Dectin-1의 blocking)로 결합시킨 후에도 여전히 거의 동일하게 NO 생성을 억제하였다. 이 연구결과는 β-glucan이 Dectin-1 및 TLR2 re- ceptor가 아닌 다른 β-glucan receptor와 결합함을 의미한 다. Xu 등[43]은 LNT가 아닌 baker's yeast-derived β-glucan (BBG)도 LPS로 활성화한 RAW 264.7 세포에서 Dectin-1 이 아닌 TLR2와 mitogen-activated protein kinase (MAPK) 불활성화를 통해 NO의 생성이 억제하였다고 보고하였다. 본 연구에서의 HKSMM50의 β-glucan은 LPS로 활성화한 RAW 264.7 세포의 어느 receptor와 결합하여 NF-κB의 활성을 down regulation하는지에 관해서는 더 연구를 하여야할 것이다.

HKSMM50은 LPS로 활성화한 RAW 264.7 세포에서SOD와 CAT의 활성을 증가시켰다(Fig. 8). SOD는 체내에서 여러 생화학반응에 의해 생성되는 superoxide anion (O2-)을 H2O2로 전환하는 항산화효소이고, CAT는 SOD나 다른 생화학반응에 의해 생성된 H2O2를 O2와 H2O로 전환하는 항산화효소이다. 따라서 이들 두 효소는 생체 내에서 reactive oxygen species (ROS)를 제거하여 oxidative stress (OS)를 줄이는데 중요한 역할을 한다. 인체는 항산화계를 가지고 있으나 ROS를 완전히 제거하기에는 부족하다[1, 44]. 따라서 표고버섯 등에 포함되어 있는 nutraceuticals 및 pharmaceuticals를 섭취하여 ROS를 제거하고 있다[32, 34]. 표고버섯이나 표고버섯균사체에는 LNT, mannoglucan, polysaccharide protein complex, eritadenine, lentinacin, polyphenol 화합물과 같은 아주 다양한 생리활성물질을 포함하고 있다[1, 2, 4, 6, 7]. 표고버섯자실체 열 수추출물, 다당체의 분자량에 따른 분획물, 다당체의 crude extract (LEP)와 표고버섯균사체 exudates (DE)의 항산화 효과는 주로 phenol 화합물에 기인한다고 보고되었다[19, 32, 34-36]. 따라서 본 연구에서 HKSMM50의 SOD 및 CAT 활성 증가효과는 페놀성화합물(flavonoids, isoflavonoids 등) 등에 기인한다고 볼 수 있다. OS가 NF-κB 활성의 up-regulation에 관여하기 때문에[39], HKSMM50 은 OS를 제거하여 NK-κB의 활성을 down regulation하여 항염증효과를 나타낸다고 볼 수 있다(Fig. 9).

결론적으로, 14% β-glucan과 페놀화합물을 비롯한 다양한 생리활성물질을 함유한 HKSMM50은 LPS로 활성화한 RAW 264.7 세포에서 NF-κB 활성을 down-regulation하였다. 따라서 NF-κB가 세포질에서 핵으로의 이동이 감소되어 COX-2와 iNOS의 발현 억제로 PGE2 와 NO의 합성이 감소되었다. 또한 HKSMM50은 pro-inflammatory cytokine IL-1β, TNF-α, IL-2, IL-6의 합성을 억제하였으나 SOD와 CAT 효소 활성은 증가시켰다. 결과적으로, HKSMM50은 NF-κB 활성 down-regulation에 의해 항염증작용을 보였다 (Fig. 9). 따라서, HKSMM은 인체의 면역기능을 증진시키는 소재로 활용할 수 있을 것이다.

감사의 글

본 연구는 2021 경상남도 항노화미래선도사업지원사업의 지원을 받아 수행되었습니다. ㈜HK바이오텍 김경은 연구원의 그래프 작도에 대해 감사드립니다.

The Conflict of Interest Statement

The authors declare that they have no conflicts of interest with the contents of this article.

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