Korean Journal of Pharmacognosy (생약학회지)

The Korean Society of Pharmacognosy (한국생약학회)
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Secoiridoids, Iridoids and Flavonol Glycosides from Hydrangea paniculata Flowers and their C2C12 Myotube Hypertrophic Activity

나무수국 꽃의 Secoiridoid, Iridoid 및 Flavonol 배당체의 골격근세포 비대 유도 효능

  • Received : 2022.05.18
  • Accepted : 2022.06.22
  • Published : 2022.06.30
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Abstract

Five secoiridoids (1-3, 5, 10), a iridoid (4) three flavonol glycosides (7-9) and a coumarin (6), were isolated from the flowers of Hydrangea paniculata. Their chemical structures were elucidated as kingiside (1), morroniside (2), sweroside (3), loganin (4), vogeloside (5), umbelliferone (6), quercetin-3-O-sambubioside (7), quercetin-3-O-neohesperidoside (8), kaempferol 3-O-sambubioside (9) and secologanin dimethyl acetal (10), respectively, by spectroscopic analysis. All isolated compounds 1-10 were assessed for their ability to induce C2C12 myotube hypertrophy. Among them, loganin (4) and kaempferol 3-O-sambubioside (9) increase the diameter of C2C12 myotubes. All isolated compounds 1-10 were firstly reported from the flowers of Hydrangea paniculata, and the skeletal muscle hypertrophic activity of 4 and 9 was also reported for the first time.

Keywords

골격근(骨格筋, skeletal muscle)은 가로무니근(횡문근)의일종이고 골격에 붙어있는 근육이다. 골격근은 체중의 40~50%를 차지한다.1) 노화(근육감소증)와, 질병(악액질) 혹은 무기력(수축) 기간 동안 골격근 질량의 손실이 발생한다. 골격근 단백질 손실은 근육 단백질의 합성과 분해 속도가 불균형을 이루면 발생한다.2) 하지만 현재까지 이러한 질병들에 대한 치료제는 없는 상태이다.1-3) 따라서 골격근 감소 개선을 위한 천연물 소재에 대한 연구가 활발히 진행중이다.

나무수국(Hydrangea paniculata Siebold)은 범의귀과 (Saxifragaceae)의 낙엽관목으로 높이 2-3 m이다. 잎은 마주나거나 3장씩 돌려나며, 타원형 또는 난형으로 길이 5-12 cm, 폭 3-8 cm, 끝은 뾰족하고 가장자리에 톱니가 있다. 꽃은 7- 8월에 가지 끝에 26 cm 정도인 원추꽃차례로 피며, 흰색이고 붉은빛을 띠기도 한다. 꽃받침은 타원형 또는 원형이며 꽃잎처럼 생겼다. 주로 관상용으로 식재하며, 한국, 러시아, 일본, 중국 등에 분포한다.4) 나무수국의 coumarin 성분은 신장 독성을 보호하는 활성을 나타내었으며, 5-8) 줄기에서 간 보호 활성과 신경보호활성을 나타내는 coumarin과 iridoid, secoiridoid 성분이 분리 보고 되었다.9, 10) 나무수국의 성분연구는 주로 가지와 잎 등 지상부에 관한 연구가 대부분으로 coumarin과 secoiridoid 및 phenylpropanoid 계열의 화합물이 분리 분리 보고 되었다.11-14)

본 연구는 나무수국 꽃으로부터 10종의 화합물을 분리 정제하고 그 구조를 동정하였으며, 골격근 비대를 촉진 활성을 검색하여 loganin(4)과 kaempferol 3-O-sambubioside(9) 가 골격근 비대 촉진 효능을 나타낸다는 사실을 보고하고자 한다.

재료 및 방법

실험재료 − 본 실험에 사용한 나무수국(H. paniculata) 의꽃은 한양대학교 에리카캠퍼스 내의 약초원에서 채집하였다. 표본(HYUP-HP-001)은 한양대학교 에리카캠퍼스 약학대학 생약학 실험실에 보관하였다.

시약 및 기기 − 추출 및 분획용 시약과 TLC 및 column용시약은 1급 용매를 사용하였다. Column chromatography는 Diaion HP-20 resin(Mitsubishi Chemical Co., Japan)을 사용하였다. HPLC 분석은 Agilent 1260 HPLC system(Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)을 사용하였으며, 분취용으로는 Gilson 321 HPLC pump와 Waters 2487 검출기를 이용하였고 HPLC column으로는 HECTOR C18 column (5µm, 250×21.2 mm, RS Tech Corp, Cheongju, South Korea), HILIC column(250mm×20mm, Cosmosil, Kyoto, Japan)과 5C18-PAQ(150mm×20mm, Cosmosil, Kyoto, Japan)을 사용하였다.

추출물 분획 − 나무수국 꽃(850 g)을 완전히 건조한 후 methanol을 추출 용매로 하여 초음파추출법을 이용하여 1 시간씩 총 3회 추출하였다. 감압농축기와 동결건조기를 이용하여 제거하여 methanol 추출물(95.05 g)을 얻었다. 나무수국 꽃 추출물(95.05 g)을 증류수 1 L에 현탁시켜 n-hexane, ethyl acetate, n-butanol 순으로 각각 3회씩 반복하여 분획한 후 농축하여 n-hexane 분획물(4.04 g), ethyl acetate 분획물 (7.27 g), n-butanol 분획물(25.43 g)을 얻었다. n-Butanol 가용분획(19.86 g)은 methanol 기울기 용리 Diaion HP-20 column chromatography를 시행하여 세부 분획으로 나누었다. 이중 30% methanol 분획물은 HILIC column을 사용하여 3% acetonitrile을 이동상으로 분리하여 화합물 1과 화합물 2를 얻었다. 40% methanol 분획물은 12% acetonitrile을 이동상으로 Hector column을 사용하여 분리정제하여 화합물 3-6을 얻었으며, 50% methanol 분획물에서 5C18-PAQ 칼럼상에서 17% acetonitrile을 이동상으로 하여 화합물 7 - 10을 얻었다.

화합물의 구조 동정 − 분리한 화합물의 구조분석을 위해 Bruker model digital AVANCE III 400(Bruker, Germany)를이용하여 NMR을 측정하였으며, ESI-MS 데이터는 Waters ZQ single quadrupole-mass spectrometer(Waters Corp., Milford, MA)를 이용하여 얻었다.

화합물 1−ESI-MS (m/z): 405.2 [M+H]+, 403.2 [M-H]-; 1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 1.52 (3H, d, J=6.9 Hz, H-10), 2.42 (1H, ddd, J=7.6, 6.0, 4.1 Hz, H-9), 2.62 (1H, dd, J=17.0, 6.0 Hz, H-6a), 3.01 (1H, dd, J=17.0, 7.6 Hz, H-6b), 3.31 (1H, m, H-5), 3.72 (3H, s, OCH3), 4.69 (1H, d, J=7.9 Hz, H-1'), 4.80 (1H, qd, J=6.9, 4.2 Hz, H-8), 5.66 (1H, d, J=6.0 Hz, H-1), 7.51 (1H, d, J=0.7 Hz, H-3); 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ: 18.4 (CH3, C-10), 28.0 (CH, C-5), 34.3 (CH2, C-6), 39.9 (CH, C-9), 51.8 (OCH3), 62.8 (CH3, C-6'), 71.6 (CH, C-4') 74.8 (CH, C-2'), 76.7 (CH, C-8), 78.0 (CH, C-3'), 78.5 (CH, C-5'), 94.4 (CH, C-1), 100.1 (CH, C-1'), 111.4 (C, C-4), 154.3 (CH, C-3), 168.2 (C, C-11), 174.3 (C, C-7).

화합물 2 − ESI-MS (m/z): 407.2 [M+H]+, 405.2 [M-H]-; 1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 1.17 (1H, m, H-6a), 1.39 (3H, d, J=6.8 Hz, H-10), 1.77 (1H, ddd, J=9.3, 4.8, 2.2 Hz, H-9), 2.03 (1H, ddd, J=13.2, 4.5, 2.4 Hz, H-6b), 2.82 (1H, dt, J=12.9, 4.6 Hz, H-5), 3.22 (1H, m, H-8), 3.70 (3H, s, OCH3), 4.79 (1H, d, J=7.9 Hz, H-1'), 4.83 (1H, H-7), 5.83 (1H, d, J=9.3 Hz, H-1), 7.52 (1H, d, J=1.9 Hz, H-3); 13C- NMR (100 MHz, CD3OD) δ: 19.8 (CH3, C-10), 32.0 (CH, C-5), 37.2 (CH2, C-6), 39.8 (CH, C-9), 51.8 (OCH3), 62.8 (CH3, C-6'), 71.6 (CH, C-4'), 74.1 (CH, C-2'), 75.0 (CH, C-8), 77.9 (CH, C-3'), 78.4 (CH, C-5'), 95.9 (CH, C-1), 97.0 (CH, C-7), 100.0 (CH, C-1'), 110.8 (C, C-4), 154.4 (CH, C-3), 168.6 (C, C-11).

화합물 3 − ESI-MS (m/z): 359.2 [M+H]+, 357.2 [M-H]-; 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 1.51 (1H, qd, J=12.9, 4.4 Hz, H-6a), 1.75 (1H, m, H-6b), 2.66 (1H, ddd, J=9.4, 5.4, 1.7 Hz, H-5), 3.05 (1H, d, J=9.1 Hz, H-9), 4.28 (1H, td, J=11.7, 2.2 Hz, H-7a), 4.36 (1H, ddd, J=11.0, 4.5, 2.1 Hz, H-7b), 4.50 (1H, d, J=7.9 Hz, H-1'), 5.26 (1H, td, J=10.6, 2.2 Hz, H-10a), 5.33 (1H, d, J=2.2 Hz, H-10b), 5.43 (1H, d, J=1.7 Hz, H-1), 5.47 (1H, m, H-8), 7.48 (1H, d, J=2.5 Hz, H-3); 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 24.3 (CH2, C-6), 26.8 (CH, C-5), 41.6 (CH, C-9), 61.1 (CH3, C-6'), 67.7 (CH2, C-7), 70.1 (CH, C-4'), 73.1 (CH, C- 2'), 76.4 (CH, C-3'), 77.4 (CH, C-5'), 95.6 (CH, C-1), 98.1 (CH, C-1'), 104.9 (C, C-4), 120.3 (CH2, C-10), 132.4 (CH, C-8), 151.5 (CH, C-3) 164.7 (C, C-11).

화합물 4 − ESI-MS (m/z): 781.5 [2M+H]+, 389.4 [M-H]-; 1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 1.10 (1H, d, J=6.9 Hz, H-10), 1.62 (1H, ddd, J=14.1, 7.7, 5.0 Hz, H-6a), 1.87 (1H, ddd, J=9.4, 7.0, 4.7, H-8), 2.03 (1H, td, J=9.2, 4.5 Hz, H-9), 2.22 (1H, m, H-6b), 3.11 (1H, q, J=8.0 Hz, H-5), 3.69 (3H, s, OCH3), 4.04 (1H, td, J=4.9, 1.5 Hz, H-7), 4.65 (1H, d, J=7.9 Hz, H-1'), 5.27 (1H, d, J=4.5 Hz, H-1), 7.39 (1H, d, J=1.3 Hz, H-3); 13C-NMR (100 MHz, CD3OD) δ: 13.4 (CH3, C- 10), 2.2 (CH, C-5), 42.2 (CH, C-8), 42.7 (CH2, C-6), 46.5 (CH, C-9), 51.6 (OCH3), 62.8 (CH3, C-6'), 71.6 (CH, C-4'), 74.7 (CH, C-7), 75.1 (CH, C-2'), 78.0 (CH, C-3'), 78.4 (CH, C-5'), 97.7 (CH, C-1), 100.1 (CH, C-1') 114.0 (C, C-4), 152.1 (CH, C-3), 169.5 (C, C-11).

화합물 5 − ESI-MS (m/z): 389.2 [M+H]+, 387.2 [M-H]-; 1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 1.72 (1H, td, J=13.7, 2.9 Hz, H-6a), 1.87 (1H, m, H-6b), 2.65 (1H, ddd, J=9.6, 5.5, 1.8 Hz, H-9), 3.37 (1H, m, H-5), 3.52 (3H, s, OCH3), 4.35 (1H, d, J=7.7 Hz, H-7), 4.69 (1H, d, J=7.9 Hz, H-1'), 5.28 (2H, m, H-10), 5.51 (1H, m, H-8), 5.56 (1H, d, J=1.8 Hz, H-1), 7.62 (1H, d, J=2.5 Hz, H-3); 13C-NMR (100 MHz, CD3OD) δ: 22.8 (CH, C-5), 30.2 (CH2, C-6), 43.6 (CH, C-9), 57.0 (OCH3), 62.7 (CH3, C-6'), 71.5 (CH, C-4'), 74.6 (CH, C-2'), 78.1 (CH, C-3'), 78.4 (CH, C-5'), 98.6 (CH, C-1), 100.3 (CH, C-1'), 103.3 (CH, C-7), 105.9 (C, C-4), 121.0 (CH2, C-10), 133.4 (CH, C-8), 154.5 (CH, C-3), 167.4 (C, C-11).

화합물 6−1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 6.16 (1H, d, J=9.4 Hz, H-3), 6.69 (1H, s, H-8), 6.76 (1H, d, J=8.3 Hz, H-6), 7.47 (1H, d, J=8.3 Hz, H-5), 7.86 (1H, d, J=9.4 Hz, H-4); 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 102.2 (CH, C-8), 111.3 (CH, C-3), 111.4 (C, C-4a), 113.1 (CH, C-6), 129.7 (CH, C-5), 144.4 (CH, C-4), 155.6 (C, C-8a), 160.5 (C, C-7), 161.3 (C, C-2).

화합물 7−ESI-MS (m/z): 597.1 [M+H]+, 595.2 [M-H]-; 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 4.55 (1H, d, J=7.2 Hz, H-1'''), 5.70 (1H, d, J=7.7 Hz, H-1''), 6.18 (1H, brs, H-8), 6.39 (1H, brs, H-6), 6.82 (1H, d, J=8.6 Hz, H-5'), 7.52 (1H, d, J=2.2 Hz, H-6'), 7.76 (1H, dd, J=8.6, 2.2 Hz, H-2'); 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 60.0 (CH2, C-6''), 65.7 (CH2, C-5'''), 67.7 (CH, C-4'''), 69.4 (CH, C-4''), 73.6 (CH, C-3''), 74.0 (CH, C-5''), 75.9 (CH, C-2'''), 76.2 (CH, C-3'''), 79.9 (CH, C-2''), 93.4 (C, C-8), 98.3 (CH, C-1''), 98.6 (CH, C-6), 103.8 (CH, C-10), 104.7 (CH, C- 1'''), 115.2 (CH, C-2'), 115.8 (CH, C-5'), 121.2 (C, C-6'), 122.3 (CH, C-1'), 133.1 (C, C-3), 144.9 (C, C-3'), 148.5 (C, C-4'), 155.2 (C, C-9), 156.2 (C, C-2), 161.3 (C, C-5), 164.0 (C, C-7), 177.4 (C, C-4).

화합물 8−ESI-MS (m/z): 611.1 [M+H]+, 609.22 [M-H]-; 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.77 (1H, d, J=6.2 Hz, H-6'''), 5.08 (1H, d, J=1.5 Hz, H-1'''), 5.65 (1H, d, J=7.7 Hz, H-1''), 6.19 (1H, brs, H-8), 6.39 (1H, brs, H-6), 6.83 (1H, d, J=8.5 Hz, H-5'), 7.53 (1H, d, J=2.2 Hz, H-5'), 7.60 (1H, dd, J=8.5, 2.2 Hz, H-6'); 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 17.2 (CH3, C-6'''), 60.9 (CH2, C-6''), 68.2 (CH, C-5'''), 70.2 (CH, C-4''), 70.5 (CH, C-3'''), 70.6 (CH, C-2'''), 71.8 (CH, C-4'''), 77.3 (CH, C-3''), 77.3 (CH, C-5''), 77.5 (CH, C-2''), 93.4 (CH, C-8), 98.3 (CH, C-1''), 98.7 (CH, C-6), 100.5 (CH, C-1'''), 103.9 (C, C-10), 115.1 (CH, C-5'), 115.9 (CH, C- 2'), 121.1 (C, C-1'), 121.6 (CH, C-6'), 132.8 (C, C-3), 144.8 (C, C-3'), 148.4 (C, C-4'), 156.0 (C, C-9), 156.2 (C, C-2), 161.2 (C, C-5), 164.1 (C, C-7), 177.3 (C, C-4).

화합물 9−ESI-MS (m/z): 581.1 [M+H]+, 579.2 [M-H]-; 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 4.56 (1H, d, J=7.2 Hz, H-1'''), 5.69 (1H, d, J=7.6 Hz, H-1''), 6.18 (1H, d, J=2.0 Hz, H-6), 6.42 (1H, d, J=2.0, H-8), 6.87 (2H, d, J=8.9 Hz, H-3', 5'), 8.12 (1H, d, J=8.9 Hz, H-2', 6'); 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 60.0 (CH2, C-6''), 65.8 (CH2, C-5'''), 67.7 (CH, C-4'''), 69.4 (CH, C-4''), 73.6 (CH, C-3''), 73.9 (CH, C-5''), 75.9 (CH, C-2'''), 76.2 (CH, C-3'''), 79.8 (CH, C-2''), 93.6 (C, C-8), 98.3 (CH, C-1''), 98.7 (CH, C-6), 103.8 (C, C-10), 104.7 (CH, C-1'''), 115.1 (CH, C-3', C-5'), 120.9 (C, C-1'), 131.0 (CH, C-2', C-6'), 132.9 (C, C-3), 155.2 (C, C-2), 156.3 (C, C-9), 160.0 (C, C-4'), 161.2 (C, C-5), 164.2 (C, C-7), 177.4 (C, C-4).

화합물 10−ESI-MS (m/z): 435.6 [M+H]+, 415.0 [M- H2O-H]-; 1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 1.63 (1H, ddd, J=14.0, 8.0, 4.5 Hz, H-6a), 2.06 (1H, dq, J=14.0, 7.0 Hz, H-6b), 2.67 (1H, dt, J=8.8, 5.4 Hz, H-9), 2.9 (1H, m, H-5), 3.28 (3H, s, OCH3), 3.30 (3H, s, OCH3), 3.70 (3H, s, OCH3), 4.49 (1H, dd, J=7.0, 4.5 Hz, H-7), 4.67 (1H, d, J=7.9 Hz, H-1'), 5.31 (1H, ddd, J=10.4, 1.7, 0.9, H-10a), 5.34 (1H, ddd, J=17.3, 1.7, 0.7, H-10b), 5.51 (1H, d, J=5.4 Hz, H-1), 5.76 (1H, ddd, J=17.3, 10.4, 8.8 Hz, H-8), 7.43 (1H, d, J=1.2Hz, H-3); 13C-NMR (100 MHz, CD3OD) δ: 29.4 (CH, C-5), 33.2 (CH2, C-6), 45.3 (CH, C-9), 51.7 (OCH3), 52.5 (OCH3), 53.9 (OCH3), 62.8 (CH2, C-6'), 71.5 (CH, C-4'), 74.6 (CH, C-2'), 78.0 (CH, C-3'), 78.4 (CH, C-5'), 97.8 (CH, C-1), 100.1 (CH, C-1'), 104.4 (CH, C-7), 111.7 (C, C-4), 119.8 (CH2, C-10), 135.8 (CH, C-8), 153.2 (CH, C-3), 169.1 (C, C-11).

C2C12 세포 배양 및 분화 유도 − 실험에서 사용된 C2C12(mouse myoblast cell line)은 한국생명공학연구원 생물자원센터로부터 분양 받아 10% fetal bovine serum (Welgene, Gyeongsan, South Korea)과 1% penicillin/ streptomycin (PS, Invitrogen Co., NY, USA)이 함유된 Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM, Hyclone, UT, USA) 배지를 사용하여 37°C, 5% CO2 incubator에서 2 일에 한 번씩 계대 배양하였다. 분화 유도를 위하여 C2C12 세포를 12 well plate에는 5.0×104 cells/well로, 48 well plate는 2.0×104 cells/well로 분주하고, 2일 뒤 새로운 배지로 교환한 후, confluent 상태에 도달하면 2% horse serum (Welgene, Gyeongsan, South Korea), 1% PS가 함유된 DMEM 배지(분화배지)를 사용하여 매 2일마다 교체하였다. Myotube hypertrophic growth 효과를 위해 2일간 분화 유도를 진행한 후 분화 배지에 화합물 1-10을 희석하여 2일간 처리 후 결과를 확인하였다.

Cell viability − 화합물의 myoblast에 대한 독성을 확인하기 위하여 96 well plate에 C2C12 myoblast를 1.0×104 cells/ well이 되도록 seeding하여 24시간 배양하였다. 각 농도의 화합물을 처리하고 24시간 후 0.5 μg/mL 농도로 3-(4, 5- dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT, Sigma chemical Co., St. Louse, MO, USA) 시약을 37°C에서 4시간을 반응시켰다. 반응이 끝난 후 배지를 제거하고 DMSO로 formazan을 녹인 후 plate reader 기기를 사용하여 파장 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 화합물의 myotube 상태의 세포에 대한 독성을 확인하기 위하여 48 well plate에 같은 양의 세포들을 seeding 하고 2일간 분열을 진행 후 분화 배지로 교체하고 2일간 분화를 진행한 후 약물을 분화 배지에 희석하여 처리하고 2일 후 MTT 시약을 처리하고 위와 같은 과정을 진행하여 흡광도를 측정하였다.

C2C12 myotube diameter 측정−C2C12 myoblast를 12 well plate에 5.0×104 cells/well로 seeding한 후, 분화 배지에서 배양하며 2일 후 각 농도의 화합물을 처리하여 2일 더 배양한 후 JuLITM Stage Live Cell Imaging System(Nano Entek, Korea)를 사용하여 각 well마다 3개의 position을 정하여 100배율로 사진을 촬영하였다. Myotube diameter는 Imege J 프로그램을 사용하였고 각 position마다 50개 myotube를 측정하여 각 well마다 150개 myotube의 굵기를 측정하고 평균 수치를 구하였다.

통계처리 − 통계적 유의성은 SigmaPlot 12.1(SPSS Inc., IL, USA) Student’s t-test 사용하여 통계적 유의성을 평가하였으며, 3번의 독립적인 실험에 대한 평균 ± 표준편차에 대하여 *p<0.05와 **p<0.01를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

결과 및 고찰

나무수국의 꽃의 n-butanol 가용분획에서 Diaion-HP20 resin을 이용한 크로마토그래피와 prep-HPLC를 진행하여 10 종의 화합물을 분리 정제하였다. 이중 화합물 1-3, 5, 10은 secoiridoid 계열이고, 화합물 4는 iridoid 계열의 물질이었으며, 화합물 7-9는 flavonol 배당체, 화합물 6은 coumarin 계열로 그 구조를 동정하였다(Fig. 1).

Fig. 1. Chemical structures of isolated compounds 1-10 from H. paniculata flowers.

ESI-MS에서 얻은 m/z 405.2 [M+H]+와 403.2 [M-H]-의값과 13C-NMR을 통하여 화합물 1의 분자식을 C17H24O11로추정하였다. 13C-NMR에서 하나의 glucose와 한 개의 methoxy group을 제외하여 탄소 개수가 10개인 것과 C-4 (δC 111.4)과 C-3 (δC 154.3)를 통하여 하나의 이중결합이 존재한다는 것을 확인하였으며, 1H-NMR의 δH 5.66 (1H, d, J=6.0 Hz, H-1)과 13C-NMR의 δC 94.4 (CH, C-1)가 특징적으로 나타나는 것을 통하여 화합물 1이 secoiridoid 계열임을 예측하였다. 13C- NMR에서 δ 168.2과, 174.3에서 2개의 carbonyl 탄소를 확인하였으며 δ 94.4에서 1번 탄소를, δ 100.1에서 anomeric 탄소(C-1')를 확인할 수 있었다. 1H-NMR에서 δH 4.69 (1H, d, J=7.9 Hz, H-1')를 확인하여 당이 β-위치로 결합되어 있는 것을 확인할 수 있었다. HMBC spectrum에서 H-1' (δH 4.72)이 C-1 (δC 92.97)와 correlation을 함을 확인 하였으며, 두개의 methoxy기의 연결부위를 확인하였다. 이상의 결과를 문헌치와 비교하여 화합물 1의 구조를 kingiside로 구조를 동정하였다.15)

화합물 2는 ESI-MS를 통하여 얻은 m/z 407.2 [M+H]+, 405.2 [M-H]-와 13C-NMR을 통하여 분자식이 C17H26O11인화합물로 추정하였다. 13C-NMR에서 하나의 glucose와 하나의 methoxy group을 제외하여 탄소수가 10개인 것과 δC 110.8 과 δC 154.4를 통하여 하나의 이중결합이 존재한다는 것을 확인하였다. 1H-NMR에서 5.83 (1H, d, J=9.3 Hz, H-1), 7.52 (1H, d, J=1.9 Hz, H-3) peak를 확인하여 화합물 2가 secoiridoid 계열임을 확인하였다. 화합물 1과 비교하여 대부분이 비슷하지만, 하나의 carbonyl기가 사라졌으며, δC 97.0에서 하나의 acetal 탄소가 나타났다. HMBC를 통하여 H-1' (δH 4.97)/C-1 (δC 95.9)의 correlation을 확인하였고, methoxy group의 위치를 결정하였다. 위의 결과를 문헌치와비교하여 화합물 2의 구조를 morroniside로 동정하였다.16)

ESI-MS(m/z)에서 m/z 359.2 [M+H]+, 357.2 [M-H]- peak와 13C-NMR을 통하여 화합물 3의 분자식을 C16H22O9로 추정하였다. 13C-NMR spectrum에서 glucose에 해당하는 peak와, δC 104.9/151.5과 δC 120.3/132.4에서 2개의 이중결합을 확인 하였으며, δC 164.7에서 하나의 carbonyl 탄소를 확인하였다. 1H-NMR spectrum에서 δH 5.43 (1H, d, J=1.7 Hz, H-1)과 7.48 (1H, d, J=2.5 Hz, H-3을 통하여 secoiridoid 계열의 성분임을 확인하였다. HMBC spectrum에서 H-1' (δH 4.50)이 C-1 (δC 95.63)와 correlation을 함을 통하여 glucose 의 결합 위치를 결정하였고, H-7 (δH 4.28, 4.36)과 H-3 (δH 7.48)이 C-11 (δC 164.7)과 correlation을 함을 확인한 후, 문헌치와 비교하여 화합물 3의 구조를 sweroside로 동정하였다.17)

화합물 4는 ESI-MS에서 m/z 781.5 [2M+H]+와 389.4 [M-H]- 나타내었으며, 13C-NMR spectrum을 분석하여 C17H26O10인 화합물로 추정하였다. 13C-NMR spectrum에서 하나의 glucose 탄소 peak와 한 개의 methoxy group을 제외하고, 탄소 개수가 10개인 것과 C-4 (δC 114.0)과 C-3 (δC 152.1)를 통하여 한 개의 이중결합이 존재한다는 것을 확인하였다. 1H-NMR에서 δH 4.65 (1H, d, J=7.9 Hz, H-1')의 anomeric 수소를 확인하였으며, 5.27 (1H, d, J=4.5 Hz, H- 1), 7.39 (1H, d, J=1.3 Hz, H-3) peak가 특정적으로 나타나는 것을 통하여 화합물 4는 iridoid 계열의 성분임을 확인하였다. 또한 1H-1H COSY spectrum에서 H-7 (δH 4.07)이 H-8 (δH 1.91)과 correlation 함을 확인하였다. HMBC spectrum 에서 anomeric 수소인 H-1' (δH 4.65)이 C-1 (δC 97.7)과 correlation을 함을 통하여 glucose의 결합 위치를 확인하였고 OCH3 (δH 3.69)가 C-11 (δC 169.5)과 correlation을 함을 통하여 methoxy group의 위치를 결정하였다. 위의 결과를문헌치와 비교하여 화합물 4의 구조를 loganin으로 동정하였다.18)

화합물 5는 화합물 3과 유사하였으나, ESI-MS에서 m/z 389.2 [M+H]+, 387.2 [M-H]-와 13C-NMR spectrum에서 δC 57.0에서 하나의 methoxy peak가 더 있다는 것을 확인하였다. 이는 화합물 3의 7번위치에 OCH3가 치환되어 δC 103.3 (CH, C-7)에서 acetal peak가 나타남을 통하여 확인하였다. 이상의 결과와 문헌치를 통하여 화합물 5의 구조를 vogeloside로 동정하였다.18)

화합물 6은 UV 365 nm에서 청색 형광을 나타냈으며 1H- NMR에서 δH 6.16 (1H, d, J=9.4 Hz, H-3)과 7.86 (1H, d, J=9.4 Hz, H-4)의 coumarin의 특징적인 spectrum을 보였으며, 나머지 3개의 aromatic 수소로 벤젠고리의 1, 3, 4-치환체를 확인하여, 그 구조를 문헌치와 비교하여 umbelliferone으로 동정하였다.19)

화합물 7은 flavonoid 계열의 화합물로 ESI-MS에서 m/z 597.1 [M+H]+, 595.2 [M-H]-의 peak와 13C-NMR spectrum을 통하여 분자식이 C26H28O16인 화합물로 추정하였다. 1H- NMR spectrum에서 δH 6.82 (1H, d, J=8.6 Hz, H-5'), 7.52 (1H, d, J=2.2 Hz, H-6'), 7.76 (1H, dd, J=8.6, 2.2 Hz, H- 2')의 signal에서 벤젠고리 1, 3, 4-치환체를 확인하였고, δH 6.39 (1H, brs, H-6)과 6.18 (1H, brs, H-8) 수소를 통하여 A-ring의 6번과 8번에 위치한 meta-coupling 한다는 것을 확인하여, aglycone 부분을 quercetin으로 확인하였다. 또한 δH 4.55 (1H, d, J=7.2 Hz, H-1'''), 5.70 (1H, d, J=7.7 Hz, H-1'')에서 두 개의 anomeric 수소와, δC 98.3 (CH, C-1'')과 104.7 (CH, C-1''')에서 두 개의 anomeric 탄소를 확인하였다. 13C-NMR 의 당부분에 해당하는 peak를 분석하여 glucose와 xylose로구성되어 있음을 확인하고, HMBC correlation을 확인하여, glucose의 2번에 xylose가 연결되어 있으며, glucose는 C-3에결합되어 있는 것을 확인하였다. 위의 결과를 문헌치와 비교하여 화합물 7의 구조를 quercetin-3-O-sambubioside로 동정하였다.20)

화합물 8은 화합물 7과 aglycone 부분은 유사하였고, ESI- MS에서 m/z 611.1 [M+H]+, 609.22 [M-H]-의 값과 peak와 13C-NMR spectrum을 통하여 glucose와 rhamnose가 결합된것을 확인하였다. HMBC correlation에서 rhamnose가 glucose의 2번에 연결되어 있는 neohesperidoside를 확인하였고, 당은 aglycone의 C-3 위치에 결합되어 있는 것을 확인하였다. 위의 결과를 문헌치와 비교하여 화합물 8의 구조를 quercetin-3-O-neohesperidoside로 동정하였다.21)

화합물 9는 1H-NMR spectrum에서 δH 6.87 (2H, d, J=8.9 Hz, H-3', 5'), 8.12 (1H, d, J=8.9 Hz, H-2', 6')을 통하여 B ring의 1, 4-치환 aromatic ring을 확인하였으며, δH 6.18 (1H, d, J=2.0 Hz, H-6), 6.42 (1H, d, J=2.0, H-8)에서 A ring의 meta coupled 수소를 나타내어 aglycone이 kaempferol로 확인하였다. 당 부분의 두 개의 anomeric 수소는 δH 4.56 (1H, d, J=7.2 Hz, H-1'''), 5.69 (1H, d, J=7.6 Hz, H-1'')에서 나타났으며, 13C-NMR을 통하여 glucose와 xylose로 확인하였다. HMBC를 통하여 xylose가 glucose의 2번에 연결되어 있으며, glucose는 aglycone의 C-3 위치에 결합되어 있는 것을 확인하였다. 이상의 결과를 문헌치와 비교하여 화합물 9의 구조를 kaempferol 3-O-sambubioside로 동정하였다.22)

화합물 10은 ESI-MS에서 m/z 435.6 [M+H]+, 415.0 [M- H2O-H]-를 나타내었고, NMR data를 검토하여 분자식을 C19H30O11로 추정하였다. 13C-NMR spectrum에서 하나의 glucose와 세 개의 methoxy group을 제외하여 탄소개수가 10 개인것과 C-4 (δC 111.7), C-10 (δC 119.8), C-8 (δC 135.8) 과 C-3 (δC 153.2)를 통하여 두 개의 이중결합이 존재한다는 것을 확인하였다. 1H-NMR spectrum에 iridoid 계열의 특징인 δH 5.51 (1H, d, J=5.4 Hz, H-1)과 7.43 (1H, d, J=1.2 Hz, H-3)가 나타났다. δH 4.49 (1H, dd, J= 7.0, 4.5 Hz, H-7)과, δC의 104.4 (CH, C-7)에서 acetal peak를 확인하였다. HMBC spectrum에서 δH 4.67 (1H, d, J=7.9 Hz, H-1')이 δC 97.8 (CH, C-1)과 correlation이 나타나 glucose의 결합 위치를 결정하였고, methyoxy기의 결합 위치 또한 HMBC로 결정하였다. 위의 결과를 문헌치와 비교하여 화합물 10의 구조를 secologanin dimethyl acetal로 동정하였다.18)

Fig. 2. Effects of isolated compounds 1-10 from H. paniculata flowers on myotube formation of C2C12 myoblasts. (A) C2C12 cell morphology of each compound treatment. (B) Cell viability of compounds 1-10 at 10 nM concentration. (C) Quantification of the myotube diameter. These data are expressed as mean ± SD of three independent experiments. *p<0.05, **p<0.01 vs. control.

Umebelliferone (6)의 배당체는 나무수국의 줄기에서 보고 된 바 있으나, 9, 12) 본 연구를 통하여 분리 동정한 화합물 1- 10은 나무수국의 꽃에서 처음으로 분리보고되는 화합물이다. 분리 정제한 화합물 1-10의 근육 비대 효능에 대한 형태학적 변화를 확인하기 위하여 분리한 화합물을 10 nM 처리한 후 myotube의 굵기 변화를 측정한 결과 화합물 4와 9를 처리한 군이 control 군 대비 유의미하게 굵어진 것을 확인하였다(Fig. 2). 화합물 4와 9가 골격근세포의 분화과정에서 근육 비대를 촉진한다는 효능은 처음으로 보고한다.

결론

나무수국의 꽃에서 5종의 secoiridoid, 1종의 iridoid, 3종의 flavonol glycoside, 1종의 coumarin 계열의 화합물을 분리 정제하였다. 분리한 화합물은 분광학적 방법을 이용하여 kingiside(1), morroniside(2), sweroside(3), loganin(4), vogeloside(5), umbelliferone(6), quercetin-3-O-sambubioside(7), rutin(8), kaempferol 3-O-sambubioside(9), secologanin dimethyl acetal(10)로 구조를 동정하였다. Loganin(4)과 kaempferol 3- O-sambubioside(9)가 유의미하게 근육세포의 비대 효능을 가짐을 확인하였다. 향후 효능이 확인된 화합물의 작용 기전 등의 연구가 필요할 것으로 사료된다.

사사

본 연구는 한국연구재단의 중견연구자사업(NRF2020R1A2C1009455)과 대학중점연구소지원사업(NRF2020R1A6A1A03042854)의 연구비 지원을 통하여 수행되었습니다.

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