Comparison of Scattered Light of ex vivo Mouse Neutrophils by Different Wavelength Laser Irradiation

2개의 레이저 파장에 따른 마우스 호중구의 산란광 비교 연구

Abstract

Complete blood cell count(CBC) is a technique that counts leukocytes for each type of blood cell being analyzed. The principle is that laser is incident to ex vivo flowing leukocytes in a microcapillary tube and scattered light occurs by laser and leukocytes. By collecting the scattered light, we can count the types of cells because different cells generate different light-scattering patterns. However, the technique has an intrinsic limitation, scattering pattern is shown in a wide range region in the resulting, which makes it difficult to accurate analyze and use fluorescent dyes. To overcome this limitation, a new design of CBC with a dual laser, which irradiates with orthogonal angles for collecting quad-scattering information was proposed. Before development, the scattering difference depending on wavelength must be investigated to only catch up to the scattered signal by angles. Some studies, which focused on simple particles, have been conducted to theoretically and experimentally investigate different scatterings by wavelength. In this study, we propose an optical system for measuring scattered light and investigate a complex particle. As a result, the green laser made strong scattering signals in both the forward and side direction: 10% and 30%, respectively.

1. 서론

CBC(Complete Bllod cell Count)는 기초 및 임상 의학 분야에서 질병의 검사 및 진단을 위해 활용되는 기본적인 장치이다. 적혈구, 백혈구, 혈소판 및 비정상 세포를 정량화하여 환자의 건강 상태 및 질병의 감염 여부를 확인한다. CBC의 원리는 마이크로 채널 내부에 흐르는 혈액 세포에 1개의 레이저를 조사하여 세포에서 발생하는 산란광 및 형광 신호의 측정을 통해 정량화하는 것이다. 세부적으로 혈액 세포에서 발생한 산란광 신호를 전방 및 측면의 두개의 방향에서 측정한다. 전방 산란 신호는 레이저의 입사 방향과 동일한 방향에서 측정된 산란광이며 측면 산란은 입사 방향과 수직한 방향에서 측정된 산란광이다. 산란광을 두 방향에서 측정하는 이유는 전방 산란 신호는 세포의 전체 크기에 따라 강도가 결정되며 측면 산란은 세포의 내부 구조 등의 요인에 의해 결정된다. 따라서 전방 산란 신호를 이용하여 세포의 크기에 대한 정보를 얻을 수 있으며, 측면 산란 신호는 세포 구조에 대한 정보를 얻을 수 있다. 두 신호의 조합을 통해 세포 종류를 유추할 수 있으며, 세포의 정량화가 가능하다.

CBC에서 정량적으로 측정된 두개의 산란 신호들은 광량을 기준으로 X-Y 평면상에 plotting 하여 scatter plot의 형태로 검사 결과를 도출한다. 일반적으로 scatter plot의 X축은 전방 산란, Y축은 측면 산란의 광량으로 구성된다. CBC는 정량화된 정상인의 혈액 세포량과 환자에서 측정된 데이터를 비교하여 건강 상태 및 질환의 감염 여부를 예측하게 된다. 빈혈, 감염, 백혈병을 포함한 다양한 종류의 질병과 장애를 관찰하기 위해 사용되고 있다. 정확한 진단을 위해서 가장 주요한 이슈는 CBC에서 가능한 가장 정확한 데이터 세트를 얻는 것이다[1-4].

그러나 현재의 단일 레이저를 기반으로 하는 CBC 시스템은 한계 사항이 존재한다. 마이크로채널에서 세포의 회전과 고유한 구조적 variation에 의해 산란광 신호가 범위를 갖는 값들로 나타나게 되며 scatter plot상에서도 특정 영역을 가지게 된다. 이러한 분포 형태로 인하여 종류가 다른 세포의 데이터가 서로 중첩되는 결과가 나타나며 세포를 식별하는데 어려움을 주게 된다. 즉, 현재의 CBC 모델은 세포 분류의 정확도 증가를 위해 scatter plot상에서 분포된 신호를 영역의 범위감소가 요구되고 있다.

이를 극복하기 위해 2개의 레이저를 적용한 새로운 CBC 모델이 제안되고 있다[5,6]. 2개의 레이저 기반의 CBC는 다음과 같이 구성된다. (1) 세포의 두 지점에서 발생하는 산란광 측정을 위해 두 번째 레이저는 첫 번째 레이저와 서로 수직한방향으로 입사하도록 위치한다. (2) 각 레이저는 서로 다른 중심 파장을 갖는다.

2개의 레이저 기반의 CBC는 4개의 전방 및 측면 산란 광 신호의 측정이 가능하다. 측정 된 산란광 신호 중 같은 방향에서 측정된 값들을 서로 평균화하여 세포에서 발생하는 산란광 신호의 범위를 좁힐 수 있다. 2개의 레이저를 사용하는 CBC에서 발생하는 산란광은 레이저가 입사되는 위치와 중심 파장에 의해 차이가 나타나게 된다. 따라서, 세포에 입사되는 레이저의 위치에 의한 산란광을 측정하여 세포를 분석하기 위해서는 파장에 따른 세포의 산란광 신호를 보정해야하며, 이를 위한 연구가 필수적으로 선행되어야 한다.

최근 파장에 따른 입자의 산란광 차이를 분석에 대한 연구가 진행되고 있다[7-11]. 대표적으로 scanning flow cytometry를 이용해서 혈액 세포의 LSP(Light Scaaning Pattern)를 측정하였으나 하나의 레이저가 적용되어 파장에 따른 입자 간의 산란광 차이에 대한 정보는 제시하지 못하였다 [7-10].

Orlova 연구진은 2개의 다른 파장을 가진 레이저가 적용된 flow cytometry 시스템을 활용하여 neutrophil의 LSP 측정을 진행했다. 한 개의 레이저로 빛의 산란을 유발했고, 다른 하나로 특정 혈액 세포를 특정하기 위한 형광 유도를 진행하였다. 즉, 산란광을 위해 1개의 레이저를 활용하였으며 파장에 따른 산란광 차이를 제시하지 않았다[10].

Yaterbova 연구진은 적혈구 및 혈소판과 같은 단순한 생물학적 입자의 파장에 따른 각도 별 광산란을 측정했다. 2개의 레이저는 서로 수직한 방향으로 세포에 입사되어 각도에 따른 LSP 측정을 진행하였다. 파장에 따른 산란광 차이를 제시를 하였지만 해당 차이는 서로 다른 세포 위치에서 발생한 산란광에 대한 정보가 함께 포함되어 있다. 해당 연구에서 활용된세포는 적혈구와 같이 대칭성을 갖는 구조로 회전에 의한 산란광 차이가 미미하기 때문에 측정이 가능하였다[11]. 실제 CBC는 백혈구를 검사 대상으로 하며 백혈구는 적혈구 등에 비해 매우 복잡한 구조를 가지고 있어 해당 연구에서 제시한 파장별 산란광 차이 데이터를 CBC 시스템에 적용하기에는 무리가 있다.

본 연구에서는 두 개의 레이저가 파장을 제외하고 동일한 입사 조건을 가지도록 광학 시스템을 구성하였다. 광학 시스템 구현에서 주요한 요소는 다음과 같다. (1) 두 개의 레이저가 동일한 입사 방향을 가지고 세포에 동시에 입사되어 scatter가 발생해야 한다. CBC 모세관에서 세포가 회전하며 흘러가기 때문에 동일한 입사 방향에서 동시에 입사되어야 회전에 의한 영향을 감소시킬 수 있다. (2) 샘플에 입사하는 두 레이저의 광량(Intensity), 레이저 빔의 에너지 분포(beam energy distribution), 레이저 빔의 형상(beam profile)과 센서의 파장별 민감도(spectral sensitivity of detector)가 동일해야 한다. 광학 시스템 구성간 레이저 조건들이 유사하도록 설계하였으며 센서의 파장별 민감도와 같은 일치가 어려운 조건들에 대해서는 파장에 따른 보정값을 실험적으로 도출하여 적용하였다. 개발된 시스템은 산란광 시뮬레이션 오픈 소스 코드인 Amsterdam discrete-dipole approximation (ADDA)를 사용하여 시뮬레이션 값을 도출하고 광학 시스템을 이용한 산란광을 실험적으로 측정한 후 두 값의 교차 비교를 통하여 시스템의 유의미성을 검증하였다. 해당 과정에서 직경이 1 µm 와 5 µm인 두 개의 마이크로 비드를 모델링하여 시뮬레이션 값을 도출하고 광학 시스템에서 산란광을 측정하였다. 또한, CBC의 검사 대상이 되는 백혈구 그룹에서 가장 큰 집단이면서 복잡한 구조를 가진 호중구를 실험 대상으로 선정하여 산란신호를 측정한 후 두 파장에 의한 산란광의 차이를 도출하였다.

2. 실험 방법

2.1 산란광 계측을 위한 광학 시스템 구현

2.1.1 시스템의 전체 구성

두 개의 파장을 가진 산란광 계측 시스템은 상용화된 CBC 시스템을 토대로 유사하게 설계되었다(Fig. 1). 본 시스템은 레이저 입사 영역(Fig. 1a), 측면 산란 측정 영역(Fig. 1b), 전방 산란 측정 영역(Fig. 1c)의 세 부분으로 구성되었다. 레이저 입사 영역은 샘플 스테이지에 적절한 레이저빔을 전달하기 위한 세 가지 주요 광학 구성요소인 빔 익스팬더(Beam Expander), 비구면 실린더 렌즈(Aspherical Cylindrical Lens) 및 조리개 (Pinhole Aperture)로 구성된다. 빔 익스팬더는 레이저 빔을 확대 시켜 샘플단에서 tight focusing 구현을 위해 적용되었다. 비구면 원통형 렌즈 (AC254-030-A, AC254-200-A, Thorlabs, USA)는 백혈구의 중복 측정을 막기 위한 타원형 빔구현을 위해 사용되었으며 설계된 빔은 x축과 y축이 각각 300 µm 이상 30 µm에 가까운 선 모양이다. 조리개를 설치하여 공간 필터링을 통해 빔 프로파일을 가우시안 형상으로 구현하였다. 전방 및 측면 산란 측정 영역의 경우 산란 광 수집을 최대화하기 위해 높은 개구수(NA)를 가진 집광 렌즈가 사용했다. 또한, 전방 산란에 비해 낮은 강도를 가진 측면 산란광 측정을 위해 더 큰 개구수를 가지는 집광 렌즈를 측면 산란광 측정을 위해 적용하였다. 수집된 빛은 Bandpass 필터를 통해 파장이 분리되어 Photomultiplier tube (PMT)에서 측정 된다.

Fig. 1 Schematic of scatter counting system

시스템 구현하기 위한 주요 이슈는 여러 레이저 변수(ex. 레이저 출력, 빔 모양, 초점에서의 에너지분포, PMT 파장별 민감도)가 파장을 제외하고 동일한 값으로 제어되거나 고정되어야 한다는 것이다. 시스템 적용된 두 개의 레이저는 532 nm, 635 nm의 중심 파장을 가지며 동일한 출력을 가지더라도 렌즈, 미러, Dichroic mirror(D/M) 와 같은 모든 광학 부품이 파장에 따른 손실율이 다르기 때문에 빔의 초점(샘플 위치)에서 파워가 달라진다. 파워미터(1918-C, Newports, USA)를 이용하여 각 지점에서 파워를 측정하여 각 레이저의 출력 파워를 초점에서 동일한 파워를 가지도록 독립적으로 제어하였다. 몇몇 레이저 변수와 미세한 차이는 실험적으로 측정하여 보정치를 도입하여 조정하였으며, 자세한 내용은 다음 절에서 설명한다.

2.1.2 동일한 레이저 빔 프로파일 구현

빔 프로파일러(Spiricon, SP91099, OPHIR, Israel) 를 사용하여 초점 위치에서의 두 레이저의 빔 프로파일을 측정했다. Fig. 2의 a, c, e는 빔 형태를, b, d, f는 에너지 분포에 대한 x축 단면 그래프를 나타냈다. Fig. 2의 a, b와 c, d는 각각 532 nm 과 635 nm 파장의 레이저를 나타낸다. 또한 e, f는 두 레이저를 동시에 측정한 결과를 나타냈다. 두 개의 레이저는 x축을 따라 정확한 일치를 보여준다. 제안된 광학 시스템에서 빔 형태는 공간적으로 서로 일치했고, 에너지 분포는 질적으로 동일한 경향을 보였다. 532 nm 파장의 레이저는 635 nm 레이저보다 일부 위치에서 더 높은 에너지를 가지는데, 정확한 분석을 위해 픽셀 값을 정량적으로 계산하여 에너지 분포 차이를 보상하는 방법을 제안했다.(자세한 내용은 2.1.3절 참조)

Fig. 2 Beam profile image: (a) two-dimensional (2D) image of 532-nm laser, (b) x-axis one-dimensional (1D) image of 532-nm laser, (c) 2D image of 635-nm laser, (d) x-axis 1D image of 635-nm laser, (e) 2D image of both lasers, and (f) x-axis 1D image of both laser

2.1.3 레이저 빔의 에너지 분포 보정

실린더 렌즈에 의해 타원형으로 집속된 빔의 에너지 특성을 정량적으로 분석하였다. 분석 과정은 (1) 빔 프로파일 이미지에서 픽셀 선택, (2) 픽셀값 추출, (3) 픽셀값을 레이저의 출력값으로 변 환, (4) 변환된 레이저의 전력 값 평균화로 총 4 단계로 수행되었다. 이 방법의 원리는 이미지가 밝기 또는 감지된 빛 신호에 따라 다른 특정 값을 가진 픽셀로 구성된다는 것이다. 따라서 픽셀값을 추출하고 변환하여 특정 영역의 레이저 출력이 계산이 가능하다. Fig. 3은 7×7 픽셀을 갖는 이미지의 예를 도시하며, 흰색 영역의 0 픽셀 값은 이미지의 어두운 영역을 의미한다. 노란색 영역은 높은 픽셀 값과 밝은 이미지를 가지고 있다. 전체 영상에서 분석할 영역을 선택한 후 해당 영역의 모든 값을 픽셀 단위로 수집했다. 수집된 픽셀 단위 값은 빔 프로파일러 S/W를 사용하여 다시 출력 값으로 변환되어 분석되었다(Fig. 3a). 분석은 532 nm 및 635 nm 레이저로 동시에 측정된 빔프로파일 이미지로 수행되었으며, 빔 프로파일러에서 가장 높은 밝기 값을 갖는 하나의 열을 선택하여 각 픽셀에 대한 값을 추출했다. 약 1,000개의 픽셀값을 추출하여 파장으로 분리하고 출력값으로 변환하여 그래프화 하였다(Fig. 3d). 635 nm 레이저가 532 nm 레이저보다 약 10% 더 높은 출력을 보였으며 해당 결과는 보정 값으로 적용하였다.

Fig. 3 Concept method and results of beam distribution compensation: (a) concept image, (b) example of beam profile image, (c) enlarged profile image, and (d) result of beam energy distribution

2.1.4 PMT의 분광 감도 보정

분광 감도(Spectral sensitivity)는 광센서에 같은 강도의 빛이 입력되더라도 파장에 따라 출력 전압값이 다르게 나타나는 것을 의미한다. 즉, 동일한 에너지를 갖는 빛이 시료에 입사되어 동일한 크기의 산란광을 생성하더라도 파장에 따라 검출된 전압값이 다를 수 있고, 반대로 서로 다른 크기의 산란광이 입력되더라도 동일한 전압값이 출력될 수 있다는 것을 뜻한다.

시스템에 적용된 센서의 분광 감도 비율을 측정하기 위해 입력 빛에 대한 출력 전압의 절대값을 파장별로 측정하였다. Fig. 4의 a, b는 각각 635 nm 및 532 nm 레이저의 PMT 신호 측정 방법을 보여주는 개략도다. 제2.1.2 에서 기술한 광학 시스템을 활용하여 레이저 빔을 PMT에 직접 입사시켜 전압값을 측정했다.

635 nm 감도가 532 nm 감도보다 약 15% 낮음을 확인했다(Fig. 4c). 해당 값은 추후 산란광 측정 실험에서 획득한 산란광 데이터에 보정값으로 적용하였다. 실제로 PMT (R9110, Hamamatsu, Japan) 효율은 약 10%이며, 이는 파장에 따른 손실과 광학계에서 발생하는 실험 오차로 판단된다.

Fig. 4 Experimental method for measuring PMT spectral sensitivity for (a) 635 nm and (b) 532 nm. (c) Results of PMT spectral sensitivity

2.2 마이크로 비드 및 호중구 산란광 측정

5 µm, 1 µm 직경을 갖는 폴리머 마이크로 비드와 마우스의 호중구의 산란광을 측정하였으며 측정시 활용된 광학 시스템을 Fig. 5에 나타내었다. 실험 전 각 시료의 입자 수를 광학 현미경과 혈구 측정법(Hemocytometer)을 통해 계수하였다.

Fig. 5 Image of optical system development for counting forward scattering intensity and example of optical ray

계수된 시료는 100 EA/ul 수준의 입자 수로 조절하기 위해서 DI water와 DPBS (Gibco DPBS, 14190-144, Life Technologies, USA)를 사용하여 희석을 진행하였다. 희석 시료는 syringe pump(Pico Plus, 70-2213, Harvard Apparatus, USA)를 이용하여 300 µm직경을 갖는 모세관에 주입하였다. 샘플에서 생성된 산란 신호는 오실로스코프(TDS3024B, Tektronix, USA)를 사용하여 측정하고 내장 S/W 를 사용하여 PC에 *.cvs 형식으로 저장했다. CCD 기반 현미경을 설치하여 시료 주입사에 발생하는 기포에 의한 신호 펄스 특성을 확인하여 결과 데이터에서 제외했다. 일반적으로 기포는 비드 및 혈액 샘플보다 더 강한 산란 신호 펄스를 생성한다.

2.3. 광학 시스템 검증을 위한 시뮬레이션

2.3.1 시뮬레이션 S/W : ADDA 및 Mieplot

DDA(discrete-dipole approximation)는 기하학적 구조를 갖는 입자와 전자파 사이의 산란 및 흡수 현상을 해석하는 대표적인 계산 방법이며 Panneypacker 연구진에 의해 도입되었다[12]. 해석하고자 하는 기하학적 입자는 DDA 방법에서 쌍극자라고 하는 여러 개의 작은 부분으로 나뉜다. 전자기파와 입자 사이의 상호 작용은 전기장의 적분을 통하여 근사화된다[13].

ADDA는 1990년대 암스테르담 대학에서 Hoekstra 연구진에 의해 개발되었다[13-15]. 2006 년 Yurkin 연구진이 코드를 기록하고 개선한 후 공개되었다. ADDA는 항공우주 광학에서 성간 간의 해석에서부터 생체 세포 시뮬레이션과 같은 생물 의학 광학에 이르기까지 다양한 응용 분야에 사용된다.

MiePlot은 일부 입자의 산란 패턴을 시뮬레이션하기 위한 오픈 소스 S/W다[16]. GUI 기반으로 구성되며 데이터를 그래픽으로 보여주기 때문에 ADDA보다 활용성이 높은 장점이 있다. 그러나 Mie 산란을 해석하는 데 중점을 두고 있으며, 적용 범위가 ADDA보다 좁다.

본 연구에서는 C 언어 기반의 ADDA와 GUI 기반 MiePlot이라는 두 개의 오픈 소스 시뮬레이터를 사용하여 간단한 단일 입자의 산란 패턴을 시뮬레이션했다. 입자는 Mathlab 기반으로 모델링되었다[18]. 시뮬레이션 결과는 ADDA와 동일한 지배 방정식을 가진 MiePolt 으로 재검증을 하였다.

2.3.2 시뮬레이션 모델링

ADDA를 사용하여 폴리머 마이크로비드의 산란패턴을 시뮬레이션했다. 시뮬레이션 결과는 제안된 산란광 측정시스템 검증에 사용되었으며, Fig. 6은 3차원 보기에서 산란 시뮬레이션 모델링을 보여준다.

먼저, 직경이 1 µm 및 5 µm이고 굴절률이1.58인 두 개의 단순한 폴리머 마이크로 비드 입자를 모델링했다. 그 후 프로그램 내의 레이저 파장을 산란광 계측 시스템과 동일한 중심 파장인 532 nm와 635 nm로 설정하였다. 산란 각도를 전방 및 측면 방향으로 각각 36.82~ 143.18˚ 및-34.7~34.7˚로 집광렌즈의 개구수를 고려하여 설정하였다. 전방 산란광용 집광 렌즈의 개구수는 0.57로 산란각은 34.7˚이며, 측면 방향은 개구수는 0.79로 53.18˚의 산란각을 가졌다. 이러한 결과는 실제 광학 시스템을 사용하기 전에 ADDA와 동일한 지배 방정식을 갖는 다른 MiePolt S/W를 사용하여 검증하였으며 두 시뮬레이션 S/W에서 유사한 산란 패턴을 확인했다.

Fig. 6 Schematic of simulation modeling concept

2.4 혈액 샘플

백혈구는 생후 6주된 BALB/cAnNCRL 생쥐에서 추출되었다. 백혈구 적출을 위해 마취제인 avertin을 쥐의 복강에 과다 투여해 안락사를 진행하였다. 백혈구가 풍부하게 존재하는 골수를 적출하기 위해 대퇴골 뼈를 추출후 파쇄를 진행하였다. 파쇄물에 잔존하는 잔여물의 제거를 위해 20 µm 필터를 사용하여 여과하였다. Magnetic bead isolation kit(MACs, 130-097-658, 독일 Milteni Biotec, 130-097-658)을 사용하여 여과액으로부터 백혈구를 분리 및 추출하였다.

모든 절차는 경북대학교 기관 동물보호 및 이용위원회(2020-150)가 승인한 동물보호규약에 따라 진행되었다.

3. 결과

산란광 측정은 2단계로 수행되었다.

(1) 시스템 검증: 직경 5 µm 및 1 µm 폴리머마이크로 비드를 ADDA, MiePlot S/W를이용하여 산란 시뮬레이션을 수행했다. 또 한, 실험적으로 입자에 의한 산란 신호를 측정했다. 시뮬레이션 결과와 실험값의 비교를 통하여 시스템의 검증을 진행했다.

(2) 호중구 산란광 측정: 마우스 호중구의 산란 신호 측정한 후, 파장별 신호 차이를 비교하였다. 호중구의 모델링을 통한 시뮬레이션이 가능은 하지만 세포 모양의 변이가 크기 때문에 정확한 시뮬레이션 데이터를 얻기 어려울 것으로 판단되어 시뮬레이션을 수행하지 않았다.

실험은 폴리머 마이크로 비드를 사용한 산란광의 실험적 측정값과 시뮬레이션을 통한 이론값의 비교하여 시스템 검증을 진행하였고, 검증된 시스템을 통해 혈구(호중구)의 실험적 측정을 진행하였다.

3.1 5 µm 마이크로 비드의 전방 산란광

Fig. 7은 5 µm 직경의 마이크로 비드에 의한 전방 산란 시뮬레이션(ADDA) 결과와 산란 신호측정 결과를 보여준다. 산란 신호는 약 300개 샘플을 측정하여 획득하였으며, 데이터를 사분위수상자 그래프로 표현한 후, 양 극단값을 제외한 평균값을 결과 데이터로 사용하였다.

두 파장 사이의 신호 강도를 표현하기 위해 다음과 같이 산란비(S.R, scatter ratio)의 형태로 정의하였다.

S.R = 635 nm의 산란 강도(전압)/532 nm의 산란 강도(전압)

시뮬레이션 결과값에서 도출된 S.R은 1.3537(Fig. 7a)이었고 실험을 통한 측정값은 1.3539(Fig. 7b)와 유사하였다. 여기서 두 파장의 차이가 크지 않은 이유는 5 µm 직경의 비드의 경우 입자의 직경이 입사빔(635, 532 nm)의 직경보다 약 10배 더 컸기 때문이다. 따라서 전방 산란광은 geometric 산란 이론에 의해 지배되었다. 산란 현상이 파장 이하의 입자 크기 및 밀도에 의존하는 특성을 갖는 Rayleigh 산란과 달리 파장 의존성이 낮다. 또 한, 대부분의 빛은 입사 방향과 같은 방향인 전방 산란 형태로 산란되기 때문에 측면 산란에 대한 유의한 측정값이 도출되지 않았다.

Fig. 7 (a) Results of ADDA simulation and (b) experiment of forward scattering difference for 5-µm microbead

3.2 1 µm 마이크로 비드의 전방 산란광

Fig. 8은 1 µm 직경의 마이크로비드에 의한 전방 산란 시뮬레이션(ADDA) 결과와 산란 신호 측정 결과를 보여준다. 샘플 및 데이터 처리 방법은 3.1절의 방법과 동일하게 진행 되었다.

시뮬레이션 결과값에서 도출된 S.R은 2.07(Fig. 8a)이었고, 실험을 통한 측정값은 1.83(Fig. 8b)이다.

Fig. 8 (a) Results of ADDA simulation and (b) experiment of side scattering difference for 1-µm microbead

3.3 1 µm 마이크로 비드의 측면 산란광

Fig. 9는 1 µm 직경의 마이크로 비드에 의한 측면 산란 시뮬레이션(ADDA) 결과와 산란 신호 측정 결과를 보여준다. 샘플 및 데이터 처리 방법은 3.1절의 방법과 동일하게 진행되었다.

시뮬레이션 결과값에서 도출된 S.R은 1.814 (Fig. 9a)였으며 실험을 통한 측정값은1.76(Fig. 9b)으로 유사하게 나타났다. 1.76(Fig. 9b)으로 유사하게 나타났다.

Fig. 9 (a) Results of ADDA simulation and (b) experiment of forward scattering difference for 1-µm microbead

3.4 호중구의 산란광 측정

2개의 레이저 파장에 의한 호중구의 산란광 측정 결과는 Fig. 10에 나타내었다.

실험 결과 전방 산란 신호와 측면 산란 신호는 각각 1.139(Fig. 10a)와 1.76(Fig. 10b)이었다.

Fig. 10 Experiment results of (a) forward and (b) side scattering difference by neutrophil

5 µm 및 1 µm 마이크로 비드에서 파장에 따른 전방 산란 신호의 차이가 크지 않았다. 호중구의 직경이 입사빔(635, 532 nm)의 파장보다 약 20배 크기 때문에 Mie 산란 이론에 의해 전방 산란 패턴이 지배되기 때문이다. Mie 산란 이론에 따르면 파장 의존성이 낮은 특징이 있다. 측면 산란광의 경우 호중구의 내부 구조 및 회전에 의해 다양한 패턴으로 나타나게 되며 Mie 산란과 Rayleigh 산란이 동시에 유발된다. 이로 인해 호중구는 1 µm 직경의 마이크로 비드에 의한 산란에 비해 낮은 파장 의존성을 가져 더 작은 차이를 보이는 것으로 추정된다. 즉, 1 µm 직경의 마이크로 비드는 파장 의존성이 높은 Rayleigh 산란이 지배적인 현상이며 이로 인해 호중구의 측면 산란광보다 파장에 의한 차이가 크게 나타난다.

4. 고찰

CBC는 질병의 진단 및 검사에 사용되는 대표적인 기술 중 하나이다. CBC는 마이크로 채널로 흐르는 혈액 세포에 레이저 빔을 집속시켜 세포에서 발생하는 산란광과 형광을 측정 및 분석하여 세포를 분류하는 기술이다. 짧은 시간에 다양한 질병을 진단할 수 있는 장점이 있으나, 산란광 측정 결과값이 세포의 구조, 크기, 마이크로 채널 내에서의 회전 등의 다양한 원인으로 인해 분포 군집이 겹쳐 나타나게 된다. 이는 세포 분류의 정확성을 떨어뜨리는 요인이 되고 있다. 문제점을 극복하기 위해 파장과 입사각이 다른 두 개의 레이저를 사용하는 새로운 CBC 모델에 대한 연구가 제안되고 있다[5].

하지만 산란광 신호는 입사되는 레이저 파장과 입사 위치에 따라 변화하기 때문에 새로운 CBC 모델의 개발을 위해서는 파장에 따른 산란광 차이를 검증해야할 필요가 있다.

본 연구에서는 파장에 따른 세포의 산란광 차이를 검증하기 위해 산란광 측정 시스템을 설계및 구현하여 호중구의 산란광 차이를 실험적으로 제시하였다. 시스템 설계 시, 파장을 제외한 산란패턴에 영향을 미치는 변수는 동일하게 고정했다. 빔의 에너지 분포 및 PMT 스펙트럼 감도와 같은 고정되지 않은 변수는 실험적 측정을 통해 보정값을 도출하여 적용하였다.

호중구의 산란광 측정 과정은 2단계로 구성 되었다. (1) 마이크로 비드의 산란광 측정 실험 및 시뮬레이션을 비교하여 구축된 시스템 검증 (2) 검증된 시스템을 통한 호중구의 산란광 측정 실험 이다. 532 nm 레이저에 의한 산란광 신호가 635 nm 레이저에 비해 각각 10%(전방) 및 30%(측면) 의 강하게 나타남을 확인하였다.

호중구의 전방 산란광 신호 차이가 1, 5 µm 마이크로 비드에 비해 작은 이유는 입자의 크기에서 기인한다. 입자에 의한 산란의 경우 입자 크기에 따라 reyleigh 산란, Mie 산란, geometric 산란으로 분류할 수 있다[18]. 호중구의 경우 입사레이저 파장에 비해 20배 이상 큰 입자 크기를 가지며 해당 입자는 산란 현상 중 geometric scattering이 지배적으로 일어나게 되며 모든 파장대역의 빛의 유사한 크기로 산란된다. 즉 파장에 대한 의존성이 다른 산란에 비해 낮게 나타난다. 1 µm 직경의 비드, 5 µm 직경의 비드, 호중구 (10 µm)의 순으로 파장차가 작아지는 결과를 통해 추정이 가능하다.

세포 내 측면 산란은 수백 나노미터 내지 수 마이크론의 크기를 갖는 작은 세포 내 구조들에 의해 발생한다. 호중구에서 발생하는 측면 산란신호는 1개의 입자가 아닌 여러 개의 입자로부터 발생한 복합적인 결과이며, 해당 입자들의 크기는 수백 나노에서 수 마이크론의 크기를 갖게 된다. 이들 중 크기가 작은 입자들은 높은 파장 의존성을 가지나, 크기가 큰 입자들은 의존성이 감소하게 된다. 또한, 입사 파장과 유사한 입자 크기에서 발생하는 Mie 산란의 경우 긴 파장을 더욱 강하게 산란시키는 경향이 있다[19].

이 연구의 결과는 두 개의 레이저를 가진 CBC 에 적용이 가능할 것으로 예상된다. 2개의 레이저기반의 CBC는 하나의 세포에 대한 정보를 4개의산란 신호(2개의 전방 및 측면 산란 신호)로 수집이 가능하며 해당 값의 조합을 통해 세포 측정 시발생하는 산란광 신호의 중첩 영역의 감소가 가능 하다. 특히 본 연구에서 다루어진 호중구의 경우 5종 백혈구 중 내부 구조가 가장 복잡한 형태를 가지고 있어 가장 큰 산란광 신호 범위을 갖는 세포군으로 두 개의 레이저를 가진 CBC에 의해 중첩 영역 감소가 가장 크게 나타날 것으로 예상된다. 또한, 특정 질환 감염시 나타나는 비정상 세포들은 호중구의 산란광 신호 영역에 중첩 되어 나타나는 경우가 많아 현재는 형광 측정을 통해 검출이 진행한다. 본 연구 결과는 2개의 레이저기반의 CBC는 형광 처리 없이 특정 질환의 진단에 활용이 가능하다[5,6].

CBC에서 활용되는 형광 채널은 산란광 측정을 통해 분류가 어려운 호산구(Eosinophil), 호염구 (Basophil) 등 수가 극히 적은 정상 세포의 분류 또는 특정 질병 세포 검출을 위해 활용되고 있다. 하지만 형광 처리의 경우 시약과 세포 간의 특이적 결합 가능 여부로 인해 염색이 불가능한 세포 및 시약이 존재한다. 따라서 다음 연구로 세포 내부의 고유 형관단을 타겟으로 하는 label-free 형광 채널을 포함한 CBC를 개발을 계획하고 있다. 세포에 존재하는 대표적인 고유 형관단은 AAA(Aromatic Amino Acid)인 Tryptophan이 존재하며 UV 영역에서 자가 형광 특성을 가진다. 해당 물질은 세포 별로 함유량이 다르기 때문에 excitation light에 의해 발생하는 형광 신호에서도 차이를 나타내게 된다. 따라서, 2개의 레이저 기반의 CBC 시스템과 label-free 형광 채널을 결합 하여 정상 세포의 분류 정확도를 향상하고, 염색 처리를 진행 하지 않고 비정상 감염 세포를 분류할 수 있을 것이다.

5. 결론

본 연구에서 우리는 두 개의 레이저가 파장을 제외하고 동일한 입사 조건을 가진 시스템을 구축하여 호중구의 산란 신호를 확인했다. 본 연구의 세부적인 과정은 3가지 단계로 구성되어 진행하였 다. 첫번째, 532 nm와 635 nm 파장을 가진 레이저가 동시에 동일한 입사 방향을 가지고 하나의 세포로 입사하는 광학 시스템을 디자인하고 구현하였다. 광학계 구현에 있어 주요한 key point는 파장에 의한 영향을 정확히 측정하기 위해 파장을 제외한 변수들이 모두 동일해야 한다는 것이다. 샘플단에서의 두 레이저의 광량(Intensity), 레이저빔의 에너지 분포(beam energy distribution), 레이저 빔의 형상(beam profile)과 센서의 파장별 민감도(spectral sensitivity of detector)이 동일하게 전달될 수 있도록 설계 및 구현을 진행하였다. 레이저 조건의 미세한 차이와 센서의 파장별 민감도는 측정을 통한 보정값을 도출하여 추가적으로 보정을 진행하였다.

두번째, 구현된 시스템은 scatter simulation S/W(MiePlot, ADDA)를 활용하여 시스템의 유효성 검증을 진행하였다. 구현된 시스템을 통해 1 µm, 5 µm 직경의 마이크로 비드의 산란 신호를 측정하였고, 시뮬레이션도 진행하였다. 시뮬레이션 결과 값과 시스템을 통한 측정값을 교차 비교하였으며 최대 10% 미만의 오차가 발생하였다. S/W 시뮬레이션으로부터 계산된 산란광의 산란 각도조건은 전방 및 측면 산란 신호를 집광하는 집광렌즈의 개구수 값에서 도출하였다.

세번째, 마우스의 골수로부터 호중구를 isolation 후 syringe pump를 이용하여 세포를 마이크로 채널 내부로 유입시켜 산란신호를 측정했다. 532 nm과 635 nm의 파장을 가진 레이저를 이용해 전방 및 측면 산란 신호를 측정하였다. 결과적으로 532 nm 레이저는 강한 전방 및 측면 방향의 강한 산란 신호를 발생시켰다(각각 10% 및 30%). 두 파장에 의한 산란 신호의 비율을 보정 값으로 정의하였으며 전방산란은 1.139, 측면 산란은 1.347이다. 본 연구 결과는 2개의 레이저를 기반의 CBC 시스템의 보정 값으로 활용할 예정이다.