Inhibitory Effect of RANKL-Induced Osteoclast Differentiation and ROS Generation by Sphaerotylus antarcticus Extract

극지해면동물 Sphaerotylus antarcticus 추출물의 RANKL 유도 파골세포 분화 및 ROS 생성 억제 효과

Abstract

In order to maintain bone homeostasis, it is necessary to balance bone resorption and remodeling through the differentiation of osteoclasts that absorb old bone and osteoblasts that form new bone. However, bone resorption due to excessive osteoclast differentiation is a major cause of osteoporosis and controlling excessive osteoclast differentiation has been known as a treatment strategy for osteoporosis. Therefore, in this study, the effect of an ethanol extract of Sphaerotylus antarcticus Kirkpatrick, 1907 (SAE), polar-derived sponge with unknown biological activity, on the osteoclast differentiation process of RANKL-induced RAW264.7 cells and the generated ROS was evaluated. In the study results, SAE down-regulated the formation and function of RANKL-induced osteoclasts and osteoclast differentiation specific proteins, genes in a concentration-dependent manner. In addition, it was possible to confirm the result of restoring the lost antioxidant enzyme along with down-regulation of ROS generated by RANKL. Therefore, in this study, we propose the possibility of SAE as a potential regulator of osteoporosis due to excessive osteoclast differentiation and report the biological value of the diversity of marine-derived natural products by identifying the first biological activity against SAE that is not yet known.

골 대사과정은 오래된 골을 흡수하는 파골세포와 새로운 골을 형성하는 조골세포의 분화를 통해 이루어지며, 이는 골의 항상성 유지에 매우 중요하다.¹⁾ 하지만 과도하게 분화된 파골세포에 의한 골 흡수는 골다공증 및 류마티스 관절염과 같은 장애를 유발할 수 있다.²⁾ 따라서 과도한 파골세포 분화로 인한 골 흡수 억제는 골다공증 중요한 치료전략으로 알려져 왔다.³⁾ 파골세포의 분화는 골 표면의 조혈 세포 계통인 단핵세포 그리고 대식세포에 의해 진행되며, 그 과정에서 분화에 필요한 receptor activator of nuclear factor κB ligand(RANKL)이 기질세포나 골모세포에서 분비되어 전구세포의 RANK와 결합함으로써 파골세포 분화가 개시된다.⁴⁾ 또한 결합과정 중 형성되는 TNF receptor associated factor 6(TRAF6), c-Fos와 nuclear factor of activated T cell c1(NFATc1) 등의 파골세포 분화 유도 특이적 유전자의 발현이 활성화되어 파골세포 분화를 유도하게 된다.⁵⁾

이러한 과정 중 단핵 또는 대식세포에서 RANKL 자극은 세포 내에 활성산소종(ROS, reactive oxygen species)의 생성을 유도하게 되고 생성된 활성산소종은 파골세포의 분화를 촉진시킴으로써 파골세포 분화에 의한 골 흡수 그리고 세포 이동과 같은 파골세포의 기능을 유도하는 것으로 알려져 왔다.⁶⁾ 따라서 RANKL에 의한 과도한 파골세포의 분화 그리고 기능 억제와 함께 활성산소종의 생성억제는 골다공증의 중요한 치료전략으로 제시되어져 왔다.⁷⁾

Sphaerotylus antarcticus Kirkpatrick, 1907(Polymastiidae) 는 남극에 서식하는 해면동물로 남극 대륙의 수심 25에서 35m 사이에 일반적으로 발견되며, 스피큘 모피로 둘러싸인 돔 모양의 몸체를 가지고 있다.⁸⁾ 이전의 보고된 연구에 따르면, 해양생물의 2차 대사산물은 항균성, 항말라리아성, 항종양 성, 면역억제성, 심혈관계에 활성을 가지고 있는 것으로 알려져 있다.⁹⁾ 일부 남극 대륙에서 발견되는 천연물에 대한 연구는 지리적으로 접근이 제약되어 매우 드물지만, 일부 보고된 문헌에서 극지 유기체가 항균, 항균, 항바이러스 및 항암 활성과 같은 다양한 생물학적 활성을 나타내는 것으로 알려져 있다.¹⁰⁾ 하지만 S. antarcticus 그리고 이와 유사한 종, 속의 해면동물에 대한 성분과 활성 연구는 아직 보고된 바가 없다. 따라서 본 연구에서는 아직 활성이 알려지지 않은 극지 해면동물 S. antarcticus의 에탄올 추출물이 RANKL로 자극된 RAW264.7 세포의 파골세포 분화 과정에 미치는 영향과 항산화 효과에 대한 영향을 평가하였다.

재료 및 방법

실험재료 − 연구에 사용된 S. antarcticus는 2019년 2월 21 일 해양생물 분류 전문가로 구성된 극지연구소(Korea Polar Research Institute, KOPRI) 수중탐사팀이약15m남극 수심 (남극 테라노바만 장보고 기지)에서 육안으로 형태를 확인 후 채집하였다. 동정을 위해 극지연구소의 김상희, 김사흥 박사가 분류학적 형태관찰과핵유전자(18S rDNA), 미토콘드리아 유전자(COX-1)의 염기서열분석을 통해 종을 확인하였으며, 표본(CNU202102)은 충남대학교 약학대학 생약학연구실에 기탁되어 있다.

S. antarcticus의 추출 − S. antarcticus(습윤 중량: 515.8 g)을작은 조각으로 분쇄하여 95% EtOH(2 L×2회)로 실온에서 2일 동안 추출했다. 그 후, 95% EtOH(2 L, 6 시간)로 환류 추출하여 S. antarcticus 에탄올 추출물(SAE) 24.5 g을 얻었다.

기기 및 시약 − RANKL은 PeproTech EC Ltd.(London, UK)사에서 구입하여 사용하였다. Acid Phosphatase Assay Kit, 3-(4, 5-Dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), leukocyte acid phosphatase, 4-6-diamidino- 2-phenylindole (DAPI)는 Sigma-Aldrich(Saint Louis, MO, USA)사의 제품을 사용하였다. Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM), minimum essential medium alpha(α-MEM) 그리고 fetal bovine serum(FBS)은 Welgene Bioscience (Daegu, Korea)사의 제품을 사용하였으며, TRIZOL reagent는 바이오세상(Seoul, Korea)사에서 구입하여 사용하였다. TOPscript^TM RT DryMIX(dT18 plus)와 TB Green^® Pre-mix Ex Taq^TM II(Tli RNaseH Plus)는 Takara(Tokyo, Japan) 사의제품을 구입하여 사용하였다. c-Fos, NFATc1 및 β-actin의 1차 항체와 2차항체는 Cell Signaling Technology Inc.(Danvers, MA, USA)에서 구입하였으며, enhanced chemiluminescence (ECL) 용액은 Advansta Inc.(San Jose, CA, USA)에서 구입했다.

세포생존률 분석 − RAW 264.7(5×10³ cells/well) 세포를 96 well plate에 5% CO₂ 조건의 인큐베이터에서 37℃로 24 시간 배양 후 세포에 5일 동안 지시된 농도의 SAE를 처리하였다. 그런 다음, MTT(5 mg/mL)를 각 well에 첨가한 후세포를 4시간 동안 배양하고 dimethyl sulfoxide(DMSO)로 formazan 결정을 용해시켰다. 세포 생존율은 microplate reader(TECAN infinity pro 2000, Männedorf, Switzerland) 를 이용하여 540 nm 파장으로 분석하였다. 또한 세포의 계수 측정은 Incucyte^® Live Cell analysis systems(Sartorius AG, Göttingen, Germany)을 이용하여 측정하였다.

Tartrate-resistant acid phosphate activity 염색 및 활성 분석 − RAW 264.7(1×10³ cells/well) 세포를 24 well plate에 5% CO₂ 조건의 인큐베이터에서 37℃로 24시간 배양 후 RANKL(50ng/mL)이 포함된 α-MEM으로 교체하고 세포를 다양한 농도의 SAE로 처리하여 5일간 배양하였다. 그 후배지를 제거하고 PBS(phosphate-buffered saline)로 2회 세척하고 세포를 4% 포름알데히드로 15분 동안 고정한 다음 PBS로 세척하였다. Acid Phosphatase Assay kit(Cat. No. CS 0740) 및 acid phosphatase leukocyte(Cat. No. 387A-1 KT)를제조사의 지침에 따라 이용하여 TRAP 염색 및 활성 분석을 실시하였다. 파골세포는 3개 이상의 핵을 갖는 세포를 TRAP 양성 다핵세포로 간주하였으며, 파골세포의 관찰은 광학현미경(CKX53, Olympus, Tokyo, Japan)을 이용하였다.

Actin ring 측정 및 DAPI 염색 − RAW 264.7 세포는 RANKL과 지시된 농도의 SAE로 5일 동안 처리되었으며, 5일 후 세포를 4% 포름알데히드에 15분 동안 고정한 후 0.5% Triton X-100 용액으로 처리하였다. 그 후, Actin ring 형성을 평가하기 위해 Alexa 488 Phalloidin(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 1시간 동안 염색한 다음 DAPI로 세포의 핵을 30분 동안 대조염색 하였다. 그 후 분화된 파골세포에서 Actin ring과 세포의 핵을 형광현미경 (71-F3 2PH, Olympus IX, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다.

골 흡수 분석 − Osteo surface assay well(Corning, NY, USA)에 RAW 264.7 세포(1×10³ cells/well)를 배양 후 세포를 α-MEM(in 5% FBS) 배지로 교체하였다. 그 후 지시된 농도의 SAE를 처리함과 동시에 RANKL(50 ng/mL)을병용 처리하여 10일간 5% CO₂를 포함한 37℃의 조건에서 10일간 배양하였다. 10일 후 5% sodium hypochlorite로 5분간 세포를 용해 후 각 well의 골 흡수 면적을 광학현미경을 통해 촬영하였으며, ImageJ(NIH, NY, USA) 프로그램을 이용하여 골 흡수 면적을 정량화 하였다.

세포 이동 분석 − RAW 264.7 세포를 6-well plate에 1× 10³ cell/well의 밀도로 24시간 배양한 다음 Pipette Tip-200을이용하여 일정한 위치에 수직 scratch를 형성하였다. 그 후 RANKL(50 ng/mL)과 지시된 농도의 SAE를 처리하여 5일간 배양하였다. 세포의 이동량은 Incucyte^® Live Cell 분석시스템(Göttingen, Germany)을 사용하여 처리 후 1일 및 5일째에 세포의 이동량을 측정하였다.

ROS 측정 − 24-well plate에 RAW 264.7(5×10³ cells/well) 세포를 24시간 5% CO₂를 포함한 37℃ 조건에서 배양 후 RANKL(50 ng/mL) 처리와 함께 지시된 농도의 SAE를 처리하였다. 그 후 dichlorodihydrofluorescein diacetate(DCF- DA, Sigma Aldrich, Saint Louis, MO, USA)를 사용하여 ROS의 생성량을 Incucyte^® Live Cell analysis systems으로 검출하였다.

Real-time quantitative PCR − Dcstamp, acp5, atp6d0v2 및 ctsk의 유전자 발현 분석을 위해 6-well plate에 5×10⁵ cells/well의 농도로 CO₂를 포함한 37℃ 조건에서 24시간 배양 후 지시된 농도의 SAE 처리와 함께 RANKL(50 ng/mL)을처리하였다. 그 후 수확된 세포 용해물을 TRIZOL 시약에 용해하여 총 RNA를 추출하고 NanoDrop(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) 및 TOPscript^TM RT DryMIX(dT18 plus)를 사용하여 각각 mRNA의 농도를 분석하고 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 TB Green^® Premix Ex Taq^TM II(Tli RNaseH Plus)를 사용하여 CFX connect real-time PCR detection system (Bio-Rad, CA, USA)으로 분석하였다. Housekeeping gene으로 gapdh 사용되었으며, 각 유전자의 mRNA 수준은 gapdh와 비교하여 정규화 하였다. 사용된 primer sequence는 Table I과 같다. 

Table I. Primer sequences of real-time quantitative PCR analysis

Western blot 분석 − RAW 264.7 세포를 6-well plate에 5×10⁵ cells/well로 24시간 배양 후 RANKL(50 ng/mL) 과함께 지시된 농도의 SAE를 2시간 동안 처리하였다. 그 후 배양액을 제거하고 수확된 세포를 radioimmunoprecipitation(RIPA) 완충액을 사용하여 용해하였다. 그 후 Bradford assay법으로 단백질 농도를 정량화 한 다음, 동일한 양의 단백질을 12% SDS-PAGE gel에 전기영동 하였다. 전기영동 후, 분리된 단백질을 polyvinylidene fluoride(PVDF, Bio-Rad, Hercules, CA, USA) membrane으로 이동시켰다. Membrane은 실온에서 1시간 동안 5% skim milk에서 blocking 후 1차 항체반응을 4℃에서 24시간 실시하였으며, 순차적으로 2차 항체반응을 4℃에서 2시간 실시하였다. 그 후 membrane을 enhanced chemiluminescence(ECL)용액에 반응하고 Image Quant LAS 4000(GE Healthcare, Chicago, IL, USA)을 이용하여 단백질 발현량을 정량하였다.

통계처리 − 통계적 유의성은 Sigma Plot 12.1(SPSS Inc., IL, USA) Student's t-test 사용하여 통계적 유의성을 평가하였으며, 3번의 독립적인 실험에 대한 평균 ± 표준 편차에 대하여 p-value < 0.05를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

결과 및 고찰

본 연구에서는 극지 해면동물 S. antarcticus의 에탄올 추출물(SAE)이 RANKL로 유도된 파골세포 분화 과정에서 파골세포의 형성과 기능에 미치는 영향 그리고 항산화 효과에 대한 영향을 평가하였다. 먼저, RAW264.7 세포에서 SAE의세포독성 연구를 실시하기 위해 MTT 분석과 세포계수 측정을 실시하였으며, SAE는 50 그리고 200 μg/mL 사이의 농도에서 세포의 계수와 독성에 대한 영향은 나타내지 않았다(Fig. 1A, B). 따라서 이후의 실험은 50 그리고 200 μg/ mL 사이의 농도에서 실시하였다.

Fig. 1. Cell viability and confluency assays. Evaluated cytotoxicity of SAE at the indicated concentration after treating for 5 days at the density of 5×10⁵ cells/well in the 6-well plate. Cell confluency measurement by Incucyte^® Live Cell analysis systems (A). Measurement of cell viability and cell confluency (B).

비정상적으로 과도하게 분화된 파골세포는 뼈의 미세구조를 파괴하여 골다공증 등의 질병을 유발하며, 시작은 RANKL과 RANKL의 결합 신호에 의해 조절된다.¹¹⁾ 이전의 보고에 따르면, RANKL은 파골세포 분화를 매개하는 주요 파골세포 생성 사이토카인으로 알려져 있으며, RANKL 신호 전달 및 하류 경로를 억제하여 파골세포의 형성 및 이동, 골 흡수를 억제하는 것은 골다공증에 중요한 치료전략으로 알려져 있다.^{12, 13)} 본 연구의 결과에서 SAE는 이러한 RANKL에 의해 유도된 파골세포의 분화의 중요한 화학적 표지자인 TRAP의 생성과 활성을 효과적으로 하향조절 하였으며(Fig. 2A), 파골세포의 구조적 특징인 F-actin ring의 형성과 함께 거대 다핵세포인 파골세포의 핵의 밀집을 농도-의존적으로 억제하였다(Fig. 2B). 또한 SAE는 RANKL에 의해 분화된 파골세포의 골 흡수 면적 억제 및 세포 이동억제 효과를 나타냈으며(Fig. 3A, B), 이러한 결과는 SAE가 RANKL로 유도된 파골세포 분화 억제 효과뿐만 아니라 파골세포의 기능 또한 억제하는 것을 시사한다.

Fig. 2. Inhibitory effect of SAE on RANKL-induced osteoclast differentiation and formation. RAW 264.7 cells (1×10³ cells/well) were seeded in 24-well plates. After, only RANKL (50 ng/mL) treat or SAE (50-200µg/mL) and RANKL were treated in combination for 5 days. TRAP staining and activity were analyzed (A). To investigate the formation of osteoclast, Alexa 488-Phalloidin (green), and DAPI (blue) was used to stain the actin cytoskeleton and counterstained the nuclei, respectively (B). *p<0.05, versus the only RANKL-treated group.

Fig. 3. Inhibitory effect of SAE on RANKL-induced osteoclast of functions. RAW 264.7 (1×10³ cells/well) were cultured in osteo surface well and treat with RANKL (50 ng/mL) to activate osteoclast formation and incubate for 10 days. Incucyte^® Live Cell analysis systems and ImageJ program were used to observe and quantify the percentage of bone resorption pit area to the total osteo surface well area (A). Red lines indicate the migration borders at the beginning of the assay (B). Cell migration was analyzed on the fifth day after treatment. *p<0.05, versus the only RANKL-treated group.

RANKL과 RANK의 결합을 통한 파골세포 분화 과정에서 MAPK의 인산화와 NF-kB의 핵 전위는 c-Fos 및 NFATc1와같은 파골세포 분화 특이적 단백질의 발현을 유도하며, acid phosphatase 5(ACP5), dendritic cell specific transmembrane protein(DC-STAMP), ATPase H+ transporting V0 subunit D2(ATP6V0d2) 그리고 cathepsin K(CTSK)와 같은 파골세포 분화 특이적 유전자의 수준을 상향 조절하는 것으로 보고되어 왔다.^{14, 15)} 또한, 파골세포 형성 과정에서 RANKL과 RANK의 결합에 의해 활성화된 TRAF6는 NADPH oxidase 1(NOX1) 발현을 통해 세포 내 ROS를 생성하는 것으로 알려져 있으며, ^{16, 17)} 과도한 ROS 생성은 산화 스트레스를 유발하여 신경퇴행성 질환, 노화 등 다양한 질병 유발과 함께 파골세포 형성 과정에서 2차 메신저로서 TRAP, ACP5, DC- STAMP, ATP6v0d2 등의 파골세포 관련 유전자의 발현을 유도한다.^18-20) 따라서 RANKL에 의한 ROS의 생성은 파골세포 분화 유도 특이적 유전자의 발현과 밀접한 관계가 있다. 본 연구의 결과에서 SAE는 RANKL로 유도된 파골세포 분화 유도 특이적 단백질(Fig. 4A)과 유전자(Fig. 4B)를효과적으로 하향 조절하였으며, ROS의 과도한 생성을 억제함과 동시에(Fig. 5A) RANKL에 의해 손실된 superoxide dismutase(SOD)와 catalase(CAT)와 같은 항산화 효소의 회복을 유도하였다(Fig. 5B).

Fig. 4. SAE decreases the expression of osteoclast-specific genes and transcription factors. Total proteins from RAW264.7 stimulated with or without RANKL or with indicated SAE concentration. The protein expression of c-Fos and NFATc1 relative to β- actin, a housekeeping gene, was quantified by densitometry (A). The mRNA level of osteoclast-specific genes, including dcstamp, acp5, atp6v0d2, and ctsk was analyzed by real-time PCR (B). *p<0.05 versus the RANKL-treated group.

Fig. 5. Inhibitory effect of SAE on oxidative stress markers in RANKL-induced osteoclasts. DCF-DA staining was utilized to detect the RANKL-induced ROS generation in RAW264.7 with different indicated concentrations of SAE (A). SOD and CAT activity levels of RAW 264.7 cells pre-treated with SAE and stimulated by RANKL (50 ng/mL). *p<0.05, versus the only RANKL-treated group.

결론

본 연구에서는 아직 생리학적 활성이 알려지지 않은 극지 해면동물 S. antarcticus 에탄올 추출물(SAE)이 RANKL에의해 생성된 파골세포와 ROS 억제효과를 규명하였으며, 이러한 결과는 SAE가 과도한 파골세포 분화와 ROS의 생성으로 인한 골다공증 조절제로서의 잠재적 가능성을 제안한다.