한국수산과학회지 (Korean Journal of Fisheries and Aquatic Sciences)

  • 제54권5호
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  • Pages.691-697
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  • 2021
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  • 0374-8111(pISSN)
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  • 2287-8815(eISSN)
한국수산과학회 (The Korean Society of Fisheries and Aquatic Science)
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흰다리새우(Penaeus vannamei)에서 급성간췌장괴사병(Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease)과 새우미포자충(Enterocytozoon hepatopenaei)의 PCR 동시 진단법 개발

Development of a Simultaneous PCR Assay for Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease (AHPND) and Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) in Penaeus vannamei

  • 전혜진 (경북대학교 수의학과) ;
  • 이초롱 (경북대학교 수의학과) ;
  • 김범근 (경북대학교 수의학과) ;
  • 김수미 (국립수산물품질관리원 수산방역과) ;
  • 장광일 (국립수산물품질관리원 수산방역과) ;
  • 이강윤 (군산대학교 해양과학대학) ;
  • 권혜민 (한국생명공학연구원 감염병연구센터) ;
  • 한지은 (경북대학교 수의학과)
  • Jeon, Hye Jin (College of Veterinary Medicine, Kyungpook National University) ;
  • Lee, Chorong (College of Veterinary Medicine, Kyungpook National University) ;
  • Kim, Bum Keun (College of Veterinary Medicine, Kyungpook National University) ;
  • Kim, Sumi (Aquatic Disease Control Division, National Fishery Products Quality Management Service (NFQS)) ;
  • Jang, Gwang Il (Aquatic Disease Control Division, National Fishery Products Quality Management Service (NFQS)) ;
  • Rhee, Gahngyoon (Kunsan National University Department of Ocean Science and Engineering) ;
  • Kwon, Hyemin (Infectious Disease Research Center, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology) ;
  • Han, Jee Eun (College of Veterinary Medicine, Kyungpook National University)
  • 투고 : 2021.08.03
  • 심사 : 2021.09.23
  • 발행 : 2021.10.31
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초록

Vibrio parahaemolyticus associated with acute hepatopancreatic necrosis disease (VpAHPND) and Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) are the two most important pathogens in shrimp aquaculture and they have caused enormous losses to the shrimp industry worldwide. In ponds, the major target organ for the two pathogens is the hepatopancreas, and infection with EHP is a known potential risk factor for VpAHPND infection. This study aimed to develop a PCR (polymerase chain reaction)-based diagnostic method for simultaneously detecting VpAHPND and EHP. The newly developed PCR diagnostic method could be used to test various samples, such as seawater, shrimp, and feces. The diagnostic method exhibited high sensitivity and specificity for both pathogens. This will help reduce the potential economic losses that may have been caused by the two major shrimp pathogens, VpAHPND and EHP, and will allow for the efforts and time spent combatting them to be dedicated elsewhere.

키워드

서론

급성간췌장괴사병(acute hepatopancreatic necrosis disease, AHPND)은 흰다리새우, 홍다리얼룩새우 양식에서 100% 폐사를 일으켜 경제적 손실을 발생시키는 매우 심각한 질병이다. AHPND에 감염된 새우는 체색이 옅어지고, 위장관이 비어 있으며, 간췌장이 흰색으로 변하거나 비정상적으로 크기가 줄어드는 등의 증상이 관찰된다(Tran et al., 2013; Han et al., 2015a; Lee et al., 2015).

일반적으로 AHPND의 원인 병원체는 특정 독소유전자(pirA, pirB)를 포함하고 있으며, 병원성 플라스미드(pVPA3-1)을 가진 Vibrio parahaemolyticus(VpAHPND)로 알려져 있다(Han et al., 2015a). 중국(2009년)에서 첫 보고 이후 베트남(2011년), 말레이시아(2011년), 태국(2012년), 멕시코(2013년), 필리핀(2014년), 미국(2017년) 등 여러 국가로 급속히 확산되었고(Lightner et al., 2012; Tran et al., 2013; Joshi et al., 2014; Nunan et al., 2014; Leobert et al., 2015; Dhar et al., 2019), 최근에는 국내 새우 양식장에서도 보고된 바가 있다(Han et al., 2020a). 세계동물보건기구(OIE)는 2016년부터 AHPND를 관리 대상 질병으로 지정하여 관리하고 있으며, 국내에서도 법정전염병 및 제1종 살처분 대상 질병으로 추가되었다(Aquatic Life Disease Control Act, 2021).

미포자충류는 갑각류 또는 어류를 포함하는 다양한 숙주의 세포 내에서 포자를 형성하여 기생할 수 있는 단세포 진핵생물인 세포내 기생충이다(Texier et al., 2010). 양식새우 에서 도미 포자충인 Enterocytozoon hepatopenaei(EHP)가 보고되었으며, 이는 새우의 간췌장을 감염시켜 소화, 흡수 기능에 영향을 끼치기 때문에 사료 섭이 저조, 성장지연을 유발한다(Tang et al., 2015).

EHP 감염새우는 면역력 감소로 인해 2차 질병감염에 취약하게 되며(Newman, 2015), 현재까지 VpAHPND를 포함한 다양한 새우 병원균이 EHP와 복합감염으로 보고된 바 있다(Aranguren et al., 2017; Tang et al., 2017; Thamizhvanan et al., 2019; Han et al., 2020b; Jithendran et al., 2021). 2004년 태국에서 성장지연을 보이는 홍다리얼룩새우에서 이름이 알려지지 않은 미포자충으로 처음 보고되었고(Chayaburakul et al., 2004), 2009년 태국의 양식장에서 특성화 및 명명된 이후(Tourtip et al., 2009), 베트남(2010년), 중국(2014년), 인도(2016년), 인도네시아(2016년) 등 여러 아시아국가로 급속하게 확산되고 있다(Ha et al., 2010; Sritunyalucksana et al., 2014; Rajendran et al., 2016; Tang et al., 2016). 최근에는 남미에서도 EHP 감염이 보고되었다(Tang et al., 2017). EHP에 감염된 새우는 특이적인 임상 증상이 관찰되지 않고 조직병리학적 또는 PCR(polymerase chain reaction) 분석을 통해서만 진단이 가능하기 때문에 양식장에서의 관리가 매우 어려워 경제적으로 심각한 문제를 발생시킨다.

VpAHPND는 세균이 내뿜는 독소가 간췌장을 괴사 시키는 반면, EHP는 새우 간췌장 세포내에 감염하여 소화를 방해하는 등 두 질병의 감염기작은 다르나 표적장기가 간췌장으로 동일하여 복합감염에 대한 문제가 대두되고 있다(Han et al., 2020b). 실제로 인도 새우양식장에서 EHP와 Vibrio의 복함감염 발병율이 6% 이상으로 집계되었으며, 베트남과 태국의 새우 양식장에서도 VpAHPND와 EHP의 복합감염 발생 빈도가 높은 것으로 보고되고 있다(FAO, 2015; Babu et al., 2021). 또한, 실험실 내에서 진행된 연구에서 EHP에 감염된 새우는 VpAHPND 감염에 대한 감수성이 증가하는 것으로 보고되고 있다(Aranguren et al., 2017). 국내에서도 수입된 베트남 흰다리새우에서 VpAHPND와 EHP가 동시에 검출된 바 있다(Han et al., 2020b).

본 연구에서는 VpAHPND와 EHP를 동시에 진단할 수 있는 duplex PCR법을 개발하였다. 개발된 동시진단법은 새우뿐만 아니라 해수, 분변 등의 다양한 종류의 샘플에서 적용가능성을 알아보기 위해 수행되었다.

재료 및 방법

샘플 수집 방법

VpAHPND와 EHP를 동시에 진단할 수 있는 duplex PCR법을 개발을 위하여, 기존 보고된 PCR 방법으로 진단된 샘플을 사용하였다(Han et al., 2015a; Tang et al., 2015). AHPND 감염샘플은 양식장 수집 새우(N=4), 양식장 물(N=3), 인공감염 새우(N=8), AHPND Vibrio parahaemolyticus(N=4), AHPND V. campbellii(N=1)를, EHP 감염 샘플은 베트남 수입 새우(N=12) (Han et al., 2020b), 양식장 수집 새우(N=6), 양식장 물(N=1), 새우 분변(N=1)을 사용하였다. AHPND 인공감염을 위해 22 L의 수조에 1.0-1.5 g의 새우를 105 CFU(colony forming unit)/mL의 농도로 감염시킨 후, 폐사 새우의 간췌장 샘플을 수집하였다. AHPND V. parahaemolyticus와 AHPND V. campbellii는 TSB+ (tryptic soy broth+2% NaCl)에서 18시간 이상 진탕 배양(28°C, 200 rpm) 후 세균배양액(1 μL)을 PCR 분석을 위한 template로 사용하였다. 동시감염 샘플은 VpAHPND와 EHP에 대하여 각각 양성인 DNA 샘플을 혼합하여 사용하였다.

수집된 샘플은 DNeasy Blood & Tissue kit(Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 새우의 간췌장(30 mg), 분변(30 mg), 해수(300 μL)에서 각각 DNA를 추출 후 PCR 분석에 사용하였으며, 진단 분석에 사용한 샘플 항목은 Table 1에 나타내었다.

Table 1. Sample list and PCR detection of the duplex PCR assay

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1The species of shrimp in the samples are Penaeus vannamei. 2Vibrio parahaemolyticus causing acute hepatopancreatic necrosis disease. 3Enterocytozoon hepatopenaei. 4Bacteria species is V. campbellii, 2016, unpublished. 5Bacteria species is V. parahaemolyticus, 2015, unpublished. 6Bacteria species is V. parahaemolyticus, 2019, unpublished. 7Bacteria species is V. parahaemolyticus, 2013 (Tran et al., 2013). 8Bacteria species is V. parahaemolyticus, 2019 (Han et al., 2020). 9EHP positive shrimp sample (19-004H1) and VpAHPND positive shrimp sample (20-078D3) mixed DNA. 10EHP positive shrimp sample (21-044A2) and VpAHPND positive shrimp sample (20-090A1) mixed DNA.

VpAHPND와 EHP 동시진단 primer 제작

VpAHPND 진단 primer는 독소유전자(pirA, pirB)를 포함하는 병원성 플라스미드(pVPA3-1) (Genbank accession no. KM067908)의 염기서열을 바탕으로 1-step PCR primer인 AHPND-729F/R과 2-step PCR primer인 AHPND-377F/R을 새롭게 제작하였다.

EHP 진단 primer는 기존에 제작된 1-step PCR primer를 사용하였고(Jaroenlak et al., 2016), 2-step PCR primer는 spore wall protein(Genbank accession no. KX258197)의 염기서열을 바탕으로 EHP-203F/R을 새롭게 제작하였다.

실험에 사용한 primer는 Table 2에 나타내었다. 제작된 primer는 Primer 3(Version 0.4, primer design software)를 사용하여 설계하였으며, oligonucleotide는 Macrogen에 의뢰하여 사용 전까지 -20℃에 보관하였다.

Table 2. The new duplex PCR primer sequences and PCR condition used in this study

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EHP, Enterocytozoom hepatopenaei; VpAHPND, Vibrio parahaemolyticus associated with AHPND.

Duplex PCR을 통한 VpAHPND와 EHP 동시진단

본 연구에서 개발된 동시진단 primer와 VpAHPND, EHP 감염 샘플과의 반응 여부는 duplex PCR 분석으로 확인하였다. 1-step PCR amplification을 위하여, 수집된 양성샘플의 DNA, AHPND-729F/R primer, EHP-SWP1F/1R primer를 각각 1 μL씩 PCR premix(K-2016; Bioneer, Daejeon, Korea)에 혼합하였다. PCR 혼합물은 95℃에서 5분간 pre-denaturation 시킨 후, 95℃에서 30초 denaturation, 58℃에서 45초 annealing, 68℃에서 45초 extension 반응을 30 cycles 수행한 후 68℃에서 5분간 final-extension 시켰다.

2-step PCR amplification을 위하여 1-step PCR product, AHPND-377F/R primer, EHP-203F/R primer를 각각 1 μL씩 PCR premix(K-2016; Bioneer)에 혼합하였다. PCR 혼합물은 95℃에서 5분간 pre-denaturation 시킨 후, 95℃에서 30초 denaturation, 64℃에서 30초 annealing, 68℃에서 20초 extension 반응을 20 cycles 수행한 후 68℃에서 5분간 final-extension 시켰다.

PCR 분석 후, ethidium bromide를 함유한 1.5% gel에서 PCR 산물을 loading하고 gel doc(DAIHAN Scientific Co. Ltd., Seoul, Korea)을 이용해 결과를 확인하였다.

VpAHPND와 EHP 동시진단 primer의 특이도 및 민감도 확인

VpAHPND와 EHP 동시진단 primer가 표적 질병 외 다른 병원체에서는 반응을 일으키지 않는다는 것을 확인하기 위해 특이도(specificity)평가를 실시하였다. 실험에는 AHPND를 유발하지 않는 V. parahaemolyticus(N=4), V. harveyi(N=6), V. campbellii(N=3)와 흰반점바이러스(white spot syndrome virus, WSSV)에 감염된 새우(N=7), 전염성피하 및 조혈괴사증(infec- tious hypodermal and hematopoietic necrosis virus, IHHNV)에 감염된 새우(N=2), 무병새우(Penaeus vannamei) (N=1) 샘플을 사용하였다. 실험에 사용된 무병새우는 제주도 서귀포시에 위치한 종묘장에서 구입 후, 흰다리새우의 대표질병 병원체(VpAHPND, EHP, IHHNV, WSSV)를 PCR 분석한 결과 음성으로 검출된 샘플을 사용하였다. 수집된 샘플의 DNA 추출, 세균배양은 ‘VpAHPND와 EHP 감염 샘플 수집 방법’과 동일한 방법으로 진행되었다.

VpAHPND와 EHP 동시진단 primer의 민감도(sensitivity)는 VpAHPND와 EHP에 각각 감염된 새우의 DNA(19-004H1, 20-078D3)를 10배씩 계단 희석(10-0~10-6)하여 사용하였다. 신규 VpAHPND 진단 primer(729F/R, 377F/R), EHP(EHP-1F/1R, EHP-203F/R)와 기존 진단에 사용하는 VpAHPND 진단 primer(VpPirA-284F/R, VpPirB-392F/R), EHP(EHP-1F/1R, EHP-2F/2R)의 감도를 비교하였다(Han et al., 2015a; Jaroenlak et al., 2016).

결과

PCR분석 결과

양식장 수집 새우(N=4), 양식장 물(N=3), 인공감염 새우(N=8), AHPND V. parahaemolyticus(N=4), AHPND V. campbellii(N=1)의 총 20개 VpAHPND 샘플 중, 양성률은 1-step PCR와 2-step PCR에서 각각 75%(N=15), 100%(N=20)였다. 베트남 수입 새우(N=12), 양식장 수집 새우(N=6), 양식 장물(N=1), 새우 분변(N=1)의 총 20개의 EHP 샘플 중, 양성률은 1-step PCR와 2-step PCR에서 각각 95%(N=19), 100%(N=20)였다. 제작된 VpAHPND, EHP 동시감염 샘플(N=2)의 1-step PCR와 2-step PCR에서 각각 50%(N=1), 100%(N=2)였으며, 분석에 사용된 primer간 교차반응은 일어나지 않았다. PCR 분석 결과는 Table 1에 나타내었다.

특이도, 민감도 테스트

특이도 검사를 위해 사용된 AHPND를 유발하지 않는 V. parahaemolyticus(N=4), V. harveyi (N=6), V. campbellii (N=3)와 흰반점바이러스(WSSV)에 감염된 새우(N=7), 전염성 피하 및 조혈 괴사증(IHHNV)에 감염된 새우(N=2), 무병새우(P. vannamei) (N=1) 샘플 모두에서 교차반응은 일어나지 않았다. 특이도 분석 결과는 Table 3에 나타내었다.

Table 3. PCR result of the specificity test

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1White spot syndrome virus. 2Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus. 3non-AHPND vibrio parahaemolyticus. 4non-AHPND vibrio harveyi, 5non-AHPND vibrio campbellii. 6Specific pathogen free Penaeus vannamei.

민감도 테스트에서는 기존 VpAHPND 진단 primer(Han et al., 2015a), EHP(Jaroenlak et al., 2016)와 신규 개발된 primer의 감도를 비교하였다. 신규 VpAHPND 진단 primer의 검출 한계는 양성 DNA의 10-3배 희석 샘플까지 검출되었고, 기존 VpAHPND primer보다 10배 민감하였다. 신규 EHP primer의 검출 한계는 양성 DNA의 10-4배 희석 샘플까지 검출되었고, 기존 EHP primer와 동일한 감도로 검출되었다. PCR 분석 결과는 Fig. 1에 나타내었다.

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Fig. 1. Result of sensitivity test. DNAs of 19-004H1 positive for Enterocytozoon hepatopenaei (EHP), and 20-078D3 positive for Vibrio parahaemolyticus causing acute hepatopancreatic necrosis disease (VpAHPND) were used. EHP PCR assay using (A), previous EHP primer (148bp); (B), new EHP primer (203bp); VpAHPND PCR assay using (C), Previous VpAHPND duplex primer, targeting pirA (284bp) and pirB (392bp); (D), New VpAHPND primer (377bp); Lane M, 1kb-plus DNA ladder; Lane 1, negative control; Lane 2, original DNA; Lane 3, 10-1 dilution; Lane 4, 10-2 dilution; Lane 5, 10-3 dilution; Lane 5, 10-4 dilution; Lane 6, 10-5 dilution; Lane7, 10-6 dilution.

고찰

이번 연구에서는 표적장기가 동일한 두 가지 병원체 VpAHPND 와 EHP의 동시진단을 위한 새로운 nested duplex PCR 방법을 개발했다. 실질적으로 양식장에서 두 질병에 의한 경제적, 노동적 손실을 최소화하기 위해서는 빠르고 정확한 스크리닝을 통해 이 두 병원체(VpAHPND, EHP)를 초기단계에서 진압하여 질병 전파를 최소화하는 것이 필요하다. 현재까지 VpAHPND 진단을 위해 pirA 및 pirB 독소 유전자를 표적으로 하는 PCR, real-time PCR 등의 여러 분자생물학적 진단법이 개발되었고(Han et al., 2015a, Han et al., 2015b), EHP 또한 PCR, real-time PCR, In situ hybridization, LAMP 등 여러 분자생물학적 진단법이 개발되었다(Sritunyalucksana et al., 2014; Tang et al., 2015; Jaroenlak et al., 2016; Makesh et al., 2018). 이 두 질병을 야기하는 병원체(VpAHPND, EHP)는 필드에서 복합감염이 빈번하게 보고되고 있지만(Han et al., 2020b), 이를 동시에 진단할 수 있는 PCR법은 아직 개발되지 않았다.

이번 연구에서 개발된 nested duplex PCR법은 새우 양식장에서 주요한 두 가지 질병인 AHPND와 EHP의 복합감염과 단일감염을 모두 진단할 수 있고, 기존의 진단 primer보다 높은 감도를 나타내기 때문에 초기감염 단계에서 질병을 진단할 수 있다는 장점이 있다. 또한 VpAHPND와 EHP에만 특이적으로 반응하기 때문에 위양성 검출에 의한 결과의 오류를 줄일 수 있다. 그리고 양식장 새우 샘플뿐만 아니라 실험실내 인공감염 샘플에서도 검출이 용이하며, 분리된 세균이나 환경 시료(물과 분변) 에서도 적용 가능하다. 따라서, 신속하고 정확한 질병 진단을 통해 양식장 내에서 보다 효율적인 질병관리가 가능할 것으로 판단된다. 추가적으로, 개발된 PCR법의 활용과 객관적인 데이터 확보를 위해, 보다 다양한 샘플 수집 및 분석, 그리고 Pir 독소의 정량화 등의 후속 연구가 필요하다고 생각한다.

사사

이 논문은 국립수산물품질관리원의 수산생물 방역기술개발 및 프로그램 운영 과제(R2021071)와 정부(과학기술정보통신부, 교육부)의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 기초연구 사업입니다(No. NRF-2018R1C1B5086350, NRF-2019R1C1C1006212, NRF-2021R1I1A1A01040303).

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