The Mechanism of Whole Plant Extract of Viola verecunda on the Proliferation of Dermal Papilla Cells

콩제비꽃 전초 추출물의 모유두세포 증식 기전

Abstract

Proliferation and maintain of dermal papilla during progression of hair-cycle are crucial to the duration of anagen and regulated by diverse signaling pathway such as PI3K/Akt/Wnt/β-catenin pathway. In this study, we investigated the effects and mechanisms of Viola verecunda on dermal papilla cells. Treatment of dermal papilla cells with whole plant extract of V. verecunda resulted in cell proliferation, which was accompanied by up-regulation of cyclin D1, phospho (ser780)-pRB and cdc2 p34, and down-regulation of p27kip1. V. verecunda extract also promoted the levels of phospho (ser473)-Akt and phospho (ser780)-pRB in a time-dependent manner. Inhibition of PI3K/Akt by Wortmannin suppressed progression of cell-cycle, thereby attenuated the increases in proliferation of dermal papilla cells by V. verecunda extract. We further investigated Wnt/β-catenin pathway with respect to the effects of V. verecunda extract on the proliferation of dermal papilla cells. Treatment with V. verecunda extract results in up-regulation of Wnt/β-catenin proteins such as phospho (ser9)-GSKβ, phospho (ser552)-β-catenin and phospho (ser675)-β-catenin. In addition, Wortmannin abrogated V. verecunda extract mediated up-regulation of cdc2 p34 and down-regulation of p27kip1. These finding reveal that the proliferative effect of V. verecunda mediated by alteration of cell-cycle via activating PI3K/Akt/Wnt pathway in dermal papilla cells.

탈모는 모낭의 축소화 및 성장기 모낭의 감소로 인하여 머리 부위 및 신체의 모발이 가늘어지며 감소하는 증상을 말한다.^{1, 2)} 탈모는 모유두세포의 증식억제 또는 기능저하,³⁾ 두피로의 혈류량 저하 및 남성호르몬의 작용에 의한 모발 주기의 비정상화,⁴⁾ 항암제,^{5, 6)} 정신적 스트레스 및 환경오염 등^{6, 7)}의 요인들에 의에 조절됨이 알려져 있다. 그럼에도 모발의 성장을 촉진할 수 있는 기전은 정확히 알려져 있지 않다.^{1, 8)} Finasteride(Propecia^®)는 전립선 비대증 치료제로, minoxidil(Rogain^®)은 고혈압 치료제로 개발되었으나, 두 약물이 모발성장을 촉진함이 보고되어 미국식품의약국(Food and Drug Administration, FDA) 승인을 받아 탈모치료에 사용되고 있다.^{8, 9)} Finasteride는 testosterone(T)이 dihydrotes-tosterone(DHT)로의 전환에 작용하는 type Ⅱ 5α-reductase의 활성을 억제한다. 다시 말해, T에서 DHT로의 전환을 저해하여 안드로겐성 탈모를 개선함이 알려져 있다.⁸⁾ Minoxidil은 모유두세포의 apoptosis 저해,⁹⁾ ATP-sensitive potassium channel(K_ATP 채널) 개방효과^10-12) 및 Wnt/β-catenin 경로의 활성화 등¹³⁾의 다양한 작용을 통해 육모 효과를 나타내는 것으로 여겨지고 있다.

모유두세포는 중배엽 유래의 세포로 모발내의 stem cells 및 hair germ cells과 상호작용함이 알려져 있다.^{14, 15)} 특히, 모발내의 다른 세포들과 달리 모발주기 내내 유지되는 세포로 모발의 성장에서 중요한 역할을 함이 보고되어 있다.^{13, 14)} 세포증식은 G0/G1, S 및 G2/M 기로 구분되는 세포주기의 진행 및 cyclin D1, Cdc2 p34, pRB 및 p27^kip1과 같은 세포주기 조절 단백질의 변화와 밀접하게 관련됨이 알려져 있다.¹⁶⁾ 한편 Wnt/β-catenin 신호전달의 target 유전자인 cyclin D1은 G0/G1기에서 S기로 진행될 때 증가됨이 보고되었다.¹⁷⁾ 탈모치료제인 minoxidil은 Wnt/β-catenin 신호전달을 활성화하여 모발주기의 퇴행기로 진행을 지연시키며,¹³⁾ Akt 신호전달을 활성화하여 모유두세포의 apoptosis 저해 및 증식 증가 효과를 나타냄이 알려져 있다.⁹⁾

콩제비꽃은 제비꽃과에 속하며 산과 들의 습한 곳에 자라는 여러해살이풀로, 우리나라 함경남도 함흥, 경기도 북한산, 강원도 태기산, 전라남도 덕유산, 제주도 등에 나며, 일본에도분포한다. 생약명으로 소독약(消毒藥)이라고도 하며,¹⁸⁾ 예로부터 콩제비꽃의 줄기와 잎을 종기나 상처가 났을 때 쓰였으며 어린잎은 식용으로 사용하였다. 하지만 콩제비꽃의 효능에 대한 연구는 antiplasmodial 활성에 대한 보고 외에는 과학적 근거가 부족한 실정이며, ¹⁹⁾ 특히 육모 효능에 대한 연구는 전무한 상태이다.

본 연구에서는 모발의 성장에서 중요한 역할을 하는 모유두세포에서 콩제비꽃의 효능 및 작용기전을 조사하여 이를 탈모방지제 및 치료제로 이용할 수 있는 근거를 제시하고자 하였다.

재료 및 방법

콩제비꽃 추출물의 제조-실험재료인 콩제비꽃(Viola verecunda)은 경북 상주 부근에서 채취 후 국립낙동강생물자원관 황용 박사가 동정하였고, 증거 표본(NNIBRVP 69077)은 국립낙동강생물자원관에 보관되어 있다. 콩제비꽃 추출물을 다음과 같이 제조하여 사용하였다. 콩제비꽃 전초를 음건 후 세절하여분쇄하였다. 콩제비꽃 전초 건조분말(100g)에 10배 중량의 70% ethanol로 실온에서 24시간 동안 3회 추출 후 여과한 여액을 rotary vacuum evaporator (EYELA, Japan)로 농축 후 동결건조하여 얻은 추출물(10.9 g)을 실험 때까지 –20℃에 보관하여 사용하였다. 콩제비꽃 추출물은 dimethyl sulfoxide(DMSO, Sigma-Aldrich, MO, USA)로 녹여 실험에 사용하였으며, DMSO의 최종 농도는 0.2%를 초과하지 않도록 하였다.

모유두세포 증식 효능-흰쥐 수염에서분리된 모유두세포를 불멸화한 세포(Rat vibrissa immortalized dermal papilla cell)를 100units/mL penicillin-100μg/mL streptomycin(Gibco Inc, NY, USA)과 10% heat-inactivated fetal bovine serum(FBS; Gibco Inc, NY, USA)이 함유된 DMEM(Hyclone Inc, UT, USA) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 항온기에서 배양하였으며, 3일에 한 번씩 계대배양 하였다. 모유두세포의 증식은 water-soluble tetrazolium(WST) assay kit(Daeil Lab Service, Seoul, Korea)를 이용하여 측정하였다. 모유두세포(1.0×10⁴cells/mL)를 1% FBS를 포함한 DMEM 배지에 혼탁하여 96 well plate에 넣고 24시간 배양 후 콩제비꽃 추출물(0.1, 1, 10 및 100μg/mL)을 처리하였다. Wortmannin 처리 실험에서는, 10nM의 Wortmannin(Invitrogen, CA, USA)을 2시간 전처리 후 콩제비꽃 추출물(0.1μg/mL)을 처리하였다. 양성 대조군으로 minoxidil(Sigma, MO, USA)을 10μM의 농도로 처리하였다. 48시간 동안 배양한 후 10μL의 WST dye를 넣고 Vermamax microplate reader(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 각군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군의 흡광도 값과 비교하여 증식 정도를 조사하였다.

Cell Cycle Analysis-모유두세포(5.0×10⁵cells/60mm dish)를 1% FBS를 포함하는 DMEM 배지로 24시간 동안 배양 후, Wortmannin(10nM)을 2시간 전처리 후 콩제비꽃 추출물(0.1μg/mL)을 24시간 동안 처리하여 배양하였다. 세포를 PBS로 2회 세척한 후 70% Ethanol에서 고정되었다. 세포는 RNase A(50μg/mL)로 반응 후 PI(10μg/mL)로 37℃에서 30분 동안 염색되었다. 세포는 Cell Quest Software를 이용하여 FACSCalibur(Becton-Dickinson, CA, USA)로분석되었다.

Western Blot Analysis-모유두세포(5.0×10⁵cells/60mm dish)를 1% FBS를 포함하는 DMEM 배지로 24시간 동안 배양 후, 콩제비꽃 추출물(0.1μg/mL) 및 minoxidil(10μM) 을 24시간 동안 처리하여 배양하거나, 콩제비꽃 추출물(0.1 μg/mL)을 0, 0.5, 1 및 2시간 처리하여 배양하였다. 다른 경우, Wortmannin(10 nM)을 2시간 전처리 후 콩제비꽃 추출물(0.1μg/mL)을 24시간 동안 처리하여 배양하였다. 세포를 PBS로 2회 세척한 후 100 μL의 lysis buffer [50 mM Tris-HCl(pH 7.5), 150mM NaCl, 2mM EDTA, 1mM EGTA, 1mM NaVO₃, 10mM NaF, 1mM DTT, 1mM PMSF, 25μg/mL aprotinin, 25μg/mL leupeptin and 1% NP-40]를 첨가한 다음, 4℃에서 1시간 동안 lysis 시켰다. Cell lysate는 15,000 rpm에서 15분 동안 원심분리하여 상층액을 얻었고 실험에 사용전까지 -20℃에 보관하였다. 단백질 농도는 bovine serum albumin를 표준물질로 사용하여 Bradford method에 의하여 정량하였다.²⁹⁾ 10-20 μg의 lysate를 8-12% Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)로 변성분리한 다음 poly vinylidene fluoride membranes(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)으로 200mA에서 2시간 동안 transfer하였다. 그리고 membrane의 blocking은 5% nonfat dried milk가 함유된 Tween-20-TBS(T-TBS)(50mM Tris, pH 7.6, 150mM NaCl, 0.1% Tween-20) 용액에서 2시간 동안 실시하였다. Membrane은 여러 단백질의 발현을 조사하기 위해 cyclin D1(1:1000), phospho-pRB(1:1000), cdc2 p34(1:2000), p27^kip1(1:1000), phospho(ser473)-Akt(1:1000), Akt(1:1000), phospho(ser9)-GSK3β(1:1000), GSK3β(1:1000), phospho(ser552)-β-catenin (1:1000), phospho(ser675)-β-catenin(1:1000), β-catenin(1: 1000), β-actin(1:5000) 및 α-Tubulin(1:500)에 대한 primary antibody로 4℃에서 overnight 결합시켰다. Secondary antibody는 Horse Radish Peroxidase가 결합된 anti-rabbit IgG, anti-mouse IgG를 1:5000으로 희석하여 1시간 동안 상온에서 반응을 진행하였다. 그 다음 T-TBS로 membrane을 3회 세척한 후, ECL 기질(Intron, Seoul, Korea)로 1분 동안 반응시킨 다음 X-ray film(AGFA, Mortsel, Belgium)에 감광하였다.

Immunofluorescent Staining-모유두세포(1.0×10⁴ cells/ well)를 1% FBS를 포함하는 DMEM 배지로 혼탁하여 8-well chamber slides(Nalgene Nunc International, NY, USA) 에서 24시간 동안 배양 후, Wortmannin(10nM)을 2시간 전처리 후 콩제비꽃 추출물(0.1μg/mL)을 1시간 동안 처리하여 배양하였다. 면역형광염색을 위해, 세포는 차가운 PBS로 3회 세척 후, 4% paraformaldehyde로 15분 동안 고정하였다. PBS로 3회 세척 후, 0.1% Triton^TMX-100으로 10분 반응하였다. 세포는 1% BSA및 22.52 mg/mL의 glycine를 포함한 blocking solution(0.1% Tween20-PBS)으로 1시간 동안 blocking 후, phospho(ser552)-β-catenin 또는 phospho(ser675)-β-catenin에 대한 primary antibody로 4℃ 에서 overnight 실시하였다. Alexa Fluor^® 488 또는 Alexa Fluor^® 594가 결합된 secondary antibody로 1시간 반응 후, DAPI를 포함한 Vectastain(Vector Laboratories, CA, USA)으로 봉입하였다. 형광 이미지는 FluoView^® FV1200 Confocal Microscope(Olympus, Tokyo, Japan)를 사용하여 촬영하였다.

통계분석-모든 측정결과는 평균 ± 표준편차로 나타내었으며, 통계학적 유의성 검정은 unpaired student's t-test로 검정하였으며, p-value가 0.05이하일 경우 유의성을 인정하였다. 통계처리는 Sigma Stat software(Jandel Scientific Software, USA)를 사용하였다.

결과 및 고찰

본 연구에서는 콩제비꽃 추출물이 육모 효능이 있는지 조사하고자 모발의 성장에서 중요한 역할을 하는 모유두세포에서 콩제비꽃의 효능 및 작용기전을 조사하였다.

모유두세포는 중배엽 유래의 세포로써, 모낭의 기저에 위치하며 모낭내의 matrix cells, germ cells 및 stem cells과 상호작용하여 모발의 형성 및 모발주기의 조절 등에 중요한 역할을 함이 알려져 있다.^{15, 20, 21)} 콩제비꽃 추출물을 0.1 및 1 μg/mL 농도로 처리하였을 때, 대조군(100%)에 비하여 각각 13.8±4.2%(P<0.01) 및 7.5±13.4% 정도 모유두세포의 증식이 증가하였다(Fig. 1A). 하지만, 10 μg/mL 이상의 농도에서는 모유두세포의 증식이 감소되어, 이는 고농도의 콩제비꽃 추출물이 세포독성을 나타내는 것으로 사료된다(Fig. 1A). 콩제비꽃 추출물의 모유두세포 증식 효과는 양성대조물질로 사용한 minoxidil(10 μM)의 10.0±3.8%(P<0.01) 보다 다소 높았다(Fig. 1A). 이러한 결과를 통해 콩제비꽃 추출물이 모유두세포 증식을 통해 모발성장 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다. 콩제비꽃 추출물이 모유두세포의 증식증가를 유도하는 기전을 밝히기 위해 cell cycle 관련 단백질들의 발현을 조사하였다. Minoxidil은 모유두세포에서 cyclin D1 및 cdc2 p34와 같은 cell cycle 관련 단백질들의 발현을 조절하여 모유두세포의 증식을 증가함이 알려져 있다.^{17, 22, 23)} 실제, 포유류 세포는 세포증식에 필요한 cell cycle의 진행을 위해 cyclins/CDKs의 활성화, cyclin D1 및 pRB의 인산화 증가 등을 필요로 함이 보고되어 있다.^{17, 22, 23)} 콩제비꽃 추출물에 의한 모유두세포 증식 증가 효과가 cell cycle 관련 단백질들의 변화를 동반하는지 확인하기위해, cyclin D1, phospho(ser780)-pRB, cdc2 p34 및 p27^kip1의 발현을 조사하였다. Fig. 1B에서 보는 바와 같이, 콩제비꽃 추출물을 모유두세포에 0.1 μg/mL 농도로 24시간 처리하였을 때, cyclin D1, phospho(ser780)-pRB 및 cdc2 p34의 발현이 증가하며 p27^kip1의 발현은 감소됨을 확인할 수 있었다. Minoxidil의 처리 역시 콩제비꽃 추출물과 비슷한 결과를 보임을 확인하였다(Fig. 1B). 한편, 콩제비꽃의 모유두세포 증식 작용기전을 규명하고자 모유두세포에 콩제비꽃 추출물을시간별로 처리하여 확인한 결과, 콩제비꽃 추출물은 0.5 및 1시간에서 세포증식 조절에서 중요한 역할을 하는 Akt의 인산화를 증가시킬 뿐만 아니라 0.5시간 이후부터 세포주기의 조절자인 pRB의 인산화를 증가시킴을 확인하였다(Fig. 2A). 콩제비꽃의 모유두세포 증식 증가 효과가 PI3K/ Akt 신호전달의 활성화에 의해 조절되는지 확인하기위해, 모유두세포는 PI3K/Akt inhibitor인 wortmannin(10 nM)을 2시간 전처리 후, 콩제비꽃 추출물(0.1μg/mL)을 처리하여 48시간 배양하였다. Fig. 2B에서 보는 바와 같이, 콩제비꽃 추출물에 의한 모유두세포 증식 증가는 wortmannin에 의해 저해됨을 확인하였다. 이러한 결과는 콩제비꽃 추출물이 PI3K/Akt 신호전달을 활성화하여 모유두세포의 증식 증가효능을 나타냄을 시사한다. PI3K/Akt 신호전달의 활성화에 의해 세포주기의 변화가 일어나는지 확인하기위해, 모유두세포는 wortmannin(10 nM)을 2시간 전처리 후, 콩제비꽃 추출물(0.1μg/mL)을 처리하여 24시간 배양하여 세포주기를분석하였다. 콩제비꽃 추출물은 대조군에 비하여 G1 기의 세포 수 감소 및 G2/M 기의 세포수 증가를 유의하게 변화시킴을 확인하였다(Fig. 2C). 콩제비꽃 추출물에 의한 G2/M 기의 세포수 증가는 wortmannin(10 nM) 전처리에 의해 유의하게 저해됨을 확인하였다(Fig. 2C). 한편 Wnt/β-catenin 신호전달 경로는 세포증식 및 모발성장 조절 등에서 중요한 역할을 함이 알려져 있다.^{13, 24)} Fig. 3A에서 보는 바와 같이, 콩제비꽃 추출물을 모유두세포에 처리하여 GSK3β 및 β-catenin의 인산화에 영향을 미치는지 조사한 결과, 콩제비꽃 추출물은 처리 후 0.5시간에서 phospho(ser9)-GSK3β의 level이 증가되었고, 0.5시간 이후부터 phospho(ser552)-β-catenin 및 phospho(ser675)-β-catenin의 levels이 증가됨을확인하였다. Wnt/β-catenin 신호전달 경로는 Akt 및 PKA 등에 의해 조절됨이 알려져 있다. Akt의 활성화는 β-catenin의 ser552 부위와 GSK3β의 ser9 부위의 인산화를 유도하고, PKA는 β-catenin의 ser552 및 ser675 부위의 인산화를 유도하여 결국 Wnt/β-catenin 신호전달 경로를 활성화하게 된다.^25-27) Kwack 등은 minoxidil이 모유두세포에서 PKA, Akt 및 Wnt/β-catenin 신호전달 경로를 활성화하여 모발 주기의 성장기를 연장함을 보고하였다.¹³⁾ Confocal microscope로 얻어진 이미지에서 보여지듯이, 콩제비꽃 추출물은 세포질 및 핵부위에서phospho(ser552)-β-catenin와 phospho(ser675)-β-catenin의 levels 증가를 유도하며, 이는 wortmannin 전처리에 의해 저해됨을 확인하였다(Fig. 3B, 3C). 특히, Fig. 3D에서 보는 바와 같이, 콩제비꽃 추출물에 의한 cdc2 p34 발현 증가 및 p27kip1 발현 감소와 같은 세포주기 조절 단백질의 변화중 p27^kip1 발현 감소는 wortmannin 전처리에 의해 저해됨을 확인하였다. 그러나 wortmannin 전처리는 콩제비꽃 추출물에 의한 cdc2 p34 발현 증가에 영향을 미치지 않음을 확인하였다(Fig. 3D). 이러한 결과는 콩제비꽃 추출물이 PI3K/Akt 신호전달을 경유한 Wnt/β-catenin 신호전달 경로 활성화에 의한 세포주기 단백질 발현 조절을 통해 모유두세포의 증식 증가 효능을 나타냄을 시사한다.

Fig. 1. Viola verecunda extract increases the proliferation of dermal papilla cells. (A) The viability of the dermal papilla cells was determined by WST assay. The cells were treated with V. verecunda (0.1, 1, 10 and 100μg/mL) extract or minoxidil (10 μM) for 48h. The proliferation of dermal papilla cells was evaluated compared to the vehicle-treated control. Data are presented as mean±SD from three independent experiments. **p<0.01 vs. vehicle-treated control. (B) The cells were stimulated with V. verecunda (0.1μg/mL) extract or minoxidil (10 μM) for 24 h. The protein levels were analyzed by immunoblotting using specific antibodies. NT, not treated; DMSO, dimethyl sulfoxide.

Fig. 2. V. verecunda extract promotes the proliferation of dermal papilla cells via activation of PI3K/Akt pathway. (A) The effects of V. verecunda extract on the levels of phospho(ser473)-Akt and phospho(ser780)-pRB. The cells were stimulated with 0.1 μg/mL of V. verecunda extract for 0-120 min, and the protein levels were analyzed by immunoblotting using specific antibodies. (B) The viability of the dermal papilla cells exposed to V. verecunda extract (0.1 μg/mL) with or without wortmannin (10 nM) for 48 h was determined by WST assay. *p<0.05 vs. vehicle-treated control; ^††p<0.01 vs. wortmannin-treated group. (C) Quantitative comparison of cell cycle distribution induced by V. verecunda extract (0.1 μg/mL) in the presence or absence of wortmannin (10 nM) for 24 h. Data are presented as mean±SD from three independent experiments. *p<0.05, ***p<0.001 vs. vehicle-treated control, ^†††p< 0.001 vs. wortmannin-treated group.

Fig. 3. V. verecunda extract activates the Wnt/β-catenin pathway in dermal papilla cells. (A) The effects of V. verecunda extract on the levels of Wnt/β-catenin proteins. The cells were stimulated with 0.1 μg/mL of V. verecunda extract for 0-120 min, and the protein levels were analyzed by immunoblotting using specific antibodies. (B, C) The effects of V. verecunda extract on the localization of phospho(ser552)-β-catenin and phospho(ser675)-β-catenin. The dermal papilla cells were treated with wortmannin (10 nM) for 2h prior to be stimulated with V. verecunda extract (0.1 μg/mL) for 1 h. The cells were stained with anti-phospho(ser552)-β-cat- enin, anti-phospho(ser675)-β-catenin and anti-α-Tubulin antibodies, and incubated with a corresponding Alexa Fluor® 488- or Alexa Fluor® 594-conjugated secondary antibody. Images were obtained using FV1200 confocal Microscope. The scale bar indicates 100 μm. (D) The effects of V. verecunda extract on the levels of cdc2 p34 and p27^kip1. The cells were treated with wortmannin (10 nM) for 2 h prior to be stimulated with 0.1 μg/mL of V. verecunda extract for 24 h. Immunoblotting was performed with anti-cdc2 p34 and p27^kip1 antibodies.

결론

콩제비꽃 추출물이 PI3K/Akt 및 Wnt/β-catenin 신호전달경로 조절을 통해 모발성장에서 중요한 모유두세포 증식 증가 효능을 나타내며, 콩제비꽃 추출물이 탈모치료 및 탈모 예방에 이용될 수 있다는 근거를 제시하는 것이다.