Evaluation of Microbiological Safety of Commercially Salt-fermented Fishery Products by Raw Materials

젓갈류의 원료에 따른 세균학적 안전성 평가

Abstract

Eighty-nine different types of commercially salt-fermented fishery products comprising various raw materials were analyzed for total aerobic bacteria, number of coliform bacteria, fecal coliform, and Escherichia coli. The food-poisoning bacterial content of the samples was investigated using next-generation sequencing. The mean mass of total aerobic bacteria in Jeotgal was 6-1.8×10⁹ CFU/g, and that in Aekjeot and Sikhae was 4-2.2×10⁵ CFU/mL and 1.9×10⁵-8.4×10⁸ CFU/g, respectively. Coliform bacteria were detected in 9 (28.1%) of 32 Jeotgal samples; 15 (46.8%) of 32 seasonal Jeotgal samples; and in 5 (55.5%) of 9 Sikhae samples. Fecal coliform and E. coli were not detected in 86 of the 89 samples. Yersinia enterocolitica was detected only in Galchi jeot (salt-fermented hairtail) (1 type) and not in other Jeotgal samples. These results contribute to our knowledge regarding the bacterial stability of salt-fermented fishery products.

서론

전통적인 방법으로 제조되는 젓갈류는 대부분 20% 이상의 식염을 사용하여 수개월간 숙성발효를 거치게 된다. 발효 과정에서 젓갈류는 자가 소화 및 미생물의 작용에 의하여 유리 아미노산이나 저분자 펩타이드와 각종 방향성 성분의 생성에 의해 특유의 감칠맛과 풍미를 형성하게 된다. 젓갈류의 숙성에 관련되는 미생물은 대부분 내염성의 호기성, 혐기성균이 공존하고 숙성 초기에는 Micrococcus균, Brevibacterium균, 젖산 생성균, Bacillus subtilis, Leuconostoc mesenteroides, Pseudomonas 균, Flavobacterium균이 우세하고 중기에는 효모가 우세하다고 알려져 있다(Kim, 2008). 그리고 젓갈류의 사용되는 원료는 어류, 패류, 연체류 등 종류가 다양하고 이들 원료의 채취·포획 시기와 해역이 다르며, 숙성 후 고춧가루, 조미료 등 양념을 첨가하기도 하므로 다양한 종류의 미생물이 존재한다(Koo et al., 2016). 그러나 최근 고식염 젓갈류는 부패 및 변질은 억제되지만 식미를 저하시키고 나트륨의 과다 섭취에 대한 우려가 있어 소비가 기피되고 있다(Kim, 2020). 이러한 저염화 추세의 소비 동향에 의하여 산업계는 저식염 젓갈과 양념젓갈을 제조 및 유통하고 있으며, 낮아진 저장성은 냉동 및 냉장 기술을 이용하고 있다. 일반적으로 젓갈의 염도와 위생지표 미생물의 검출률 간에 반비례적인 상관관계가 있으며, 세균수가 증가할수록 대장균군이나 대장균의 검출량과 검출률이 증가한다(Lee et al., 2008; Ko et al., 2017; Song and Kim, 2017). 특히, 대부분의 젓갈류는 구입 후 가열처리와 조리과정을 거치지 않고 그대로 섭취되기 때문에 소비자에게 위해를 끼칠 우려가 높다(KCA, 2018). 따라서 소비자에게 위생적이고 안전한 젓갈을 공급하기 위해 미생물 및 식중독 균에 대한 관리의 필요성이 대두되면서 젓갈류의 미생물학적 안전성과 관련된 연구가 지속적으로 이루어지고 있다(Ha and Kim, 2005; Ha et al., 2007; Lee et al., 2008; Choi et al., 2018). 따라서 본 연구에서는 시중 유통되고 있는 젓갈류를 젓갈, 양념젓갈, 액젓, 식해로 구분하여 원료에 따른 위생지표세균 및 병원성미생물 함량 조사를 통해 세균학적 위생안전성을 평가하였다.

재료 및 방법

재료

젓갈류는 동해안, 남해안, 서해안 지역을 중심으로 생산 및 유통되고 있는 89종의 시료를 구입하였다. 이들 시료를 원료에 따라 젓갈은 멸치, 갈치 등 어류로 제조된 시료 19종과 성게, 해삼, 새우, 곤쟁이로 제조된 시료 13종을 사용하였다. 양념젓갈은 대구 아가미, 전어 등 어류로 제조된 시료 7종, 보말, 전복, 굴, 바지락 등 패류로 제조된 시료 9종, 오징어, 낙지 등 두족류로 제조된 시료 8종, 해삼, 멍게, 토하 등으로 제조된 시료 8종을 사용하였다. 또한 액젓은 멸치 액젓 10종, 까나리 액젓 5종, 갈치 액젓 1종을 사용하였으며, 식해는 어류 및 두족류로 제조된 시료 5종과 4종을 사용하였다(Table 1).

Table 1. The profile of samples in commercial salt-fermented fishery products

일반세균수 측정

일반세균수는 Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (APHA, 1984)의 방법에 따라 standard plate count agar (Difco, Detroit, MI, USA)를 사용하여 35±0.5°C에서 24-48시간 배양한 후, colony forming unit (CFU)로 나타내었다.

대장균군, 분변계대장균, 대장균 측정

대장균군 및 분변계 대장균시험은 Recommended Procedures for the Examination of Seawater and Shellfish (APHA, 1970)의 방법에 따라 시험하였다. 대장균군 및 분변 계 대장균은 최 확 수법(most probable number, MPN)으로 시험하였으며, 결과는 100 mL 또는 100 g 당 MPN으로 나타내었다. 대장균 시험은 ISO/TS 16649-3 (ISO, 2005)의 방법에 따라 실시하였다. 젓갈류 시료에 0.1% peptone 희석수를 첨가하여 파쇄한 후 minerals modified glutamate medium (Oxoid Ltd., Basingstoke, Hampshire, UK)에 접종하여 배양하고, 노란색으로 변한 시험관 액을 tryptone bile glucuronoide agar (Oxoid, UK)에 획선배양하여 청색 집락(blue colony) 또는 청녹색 집락(blue-green colony) 생성 유무를 확인하는 최확수법으로 대장균 균수를 확인하였다.

식중독세균 측정

시중에 유통중인 젓갈의 안전성을 파악하기 위해서 식중독세균인 Bacillus cereus, Campylobacter coli, Campylobacter je- juni, Clostridium perfringens, Enterohemorrhagic Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Salmonella spp., Vibrio para- haemolyticus, Yersinia enterocolitica의 존재 유무를 NGS을이용하여 세균유전체분석을 실시하였다.

세균유전체분석은 MiSeq™ System (Illumina, San Diego, CA, USA)을 사용하였다. 제조사의 프로토콜(Li et al., 2012) 에 따라 PowerSoil® DNA Isolation Kit (Cat. No. 12888; MO BIO, Carlsbad, CA, USA) 를 사용하여 DNA를 추출하였다. 각 시퀀싱 된 시료는 Illumina 16S Metagenomic Sequencing Library 프로토콜에 따라 준비되었으며, DNA 양과 품질은 각각 PicoGreen 및 Nanodrop Kit (Thermo Scientific, Willington, CT, USA)를 사용하여 측정하였다. 최종 분석은 PicoGreen 데이터를 사용하여 정규화 및 풀링하였으며 LabChip GX HT DNA 고감도 Kit (PerkinElmer, Waltham, MA, USA)를 사용하여 라이브러리의 크기를 확인했다. 그런 다음 MiSeq™ 시스템을 사용하여 DNA 시퀀싱을 실시하고, 원본 라이브러리의 양방향 시퀀싱으로 생성된 paired end 시퀀스를 병합하여 단일 긴 판독 값을 얻었다. 정확한 OTU (operational taxonomic unit) 분석을 위해 시퀀스 오류가 포함된 데이터를 제거하고 97%의 클러스터 컷오프 값을 사용하여 생성하였다.

OTU 분석 및 분류 정보 획득을 위해 QIIME (v1.8.0)를 사용 ribosomal database project (RDP; Release 11, Update 4: 2015 년 5월 26일) 데이터베이스를 참조하여 각 OTU의 주요 시퀀스를 매핑하고 분류 정보를 UCLUST (v.1.2.22)를 사용하여 분석하였다.

결과 및 고찰

일반세균수

어류, 패류, 기타 수산물을 원료로 제조된 젓갈과 양념 젓갈의 일반세균수 함량을 분석한 결과를 Table 2에 나타내었다. 멸치, 갈치, 갈치 내장 등 어류 또는 어류 부산물을 원료로 식염만을 첨가하여 발효시켜 제조한 젓갈에서의 일반세균수 범위는 6-7.6×10⁵ CFU/g이었고, 기타 수산물을 원료로 제조한 젓갈 중 해삼내장과 성게젓갈의 일반세균수 범위는 6.2×10⁸-1.8×10⁹ CFU/g으로 다른 젓갈과 비교하여 세균함량이 높았다. 새우젓의 일반세균수는 4.8×10²-4.7×10⁵ CFU/g이며, Ha et al. (2007)은 새우젓의 일반세균 오염수준이 2.7 log CFU/g이며, 즉석으로 소분 판매되는 새우젓이 3.6 log CFU/g으로 보고하였으나 본 연구에서는 일반세균수가 높은 제품도 확인되었다. 어류를 원료로 제조된 양념젓갈 중 대구아가미젓갈의 일반세균수가 2.7×10⁸ CFU/g이었고, 바지락, 전복, 보말, 굴을 원료로 만든 양념젓갈에서의 일반세균수 범위는 1.4×10³-1.0×10⁹ CFU/g이었으며, 전복 내장으로 만든 양념젓갈에서만 일반세균수가 1.0×10⁹ CFU/g이었다.

Table 2. The results of microbiological quality evaluation of commercial salt-fermented fishery products, Jeotgal and seasonal Jeotgal

갑오징어, 꼴뚜기, 낙지, 오징어를 원료로 제조된 양념 젓갈에서의 일반세균수는 일반세균의 범위는 2.7×10³-1.1×10⁶ CFU/ g으로 나타났으며, 해삼내장, 멍게, 토하 등 기타 수산물을 원료로 제조된 양념젓갈에서의 일반세균수는 일반세균의 범위는 1.4×10²-1.4×10⁷ CFU/g으로 검출되었다. 멸치, 까나리, 갈치를 원료로 제조된 액젓의 일반세균수 범위는 4-2.2×10⁵ CFU/mL 검출되었다. 도루묵, 가자미, 횟대, 옥돔 등 어류를 원료로 제조된 식해의 일반세균수의 범위는 6.0×10⁵-8.4×10⁸ CFU/g이 검출되었으며, 오징어 식해는 10⁵ CFU/g이 검출되었다(Table 3).

Table 3. The results of microbiological quality evaluation of commercial salt-fermented fishery products, Aekjeot and Sikhae

젓갈류의 일반세균수는 원료 수산물과 소금을 이용하여 발효시킨 젓갈과 액젓에 비하여 고춧가루 등의 양념이 혼합된 양념 젓갈과 식해에서 함량이 매우 높았다. 젓갈의 원료에 따른 일반세균수의 차이는 내장을 이용한 갈치속젓과 성게가 다른 젓갈에 비하여 상당히 높았으며, 양념젓갈은 원료에 따른 일반세균수의 차이는 원료에 따라 상당한 차이가 있었으며, 식해는 오징어에 비하여 어류를 이용하여 제조된 시료에서 일반세균수가 높게 검출되었다. 따라서 수산물의 부산물과 내장을 원료로 사용하거나 근육이 연한 패류, 두족류를 원료로 사용하여 제조한 젓갈과 양념젓갈 및 식해는 제조공정 및 유통과정에서 철저한 위생관리가 필요하다.

대장균군, 분변계대장균, 대장균

총 89개 젓갈류 시료 중 대장균군이 검출된 시료는 총 29개이며, 전체의 32.5%가 검출되었다. 특히 젓갈은 총 32개 시료 중 9개(28.1%), 양념젓갈은 총 32개 시료 중 15개(46.8%), 액젓은 검출되지 않았으며, 식해는 9개 시료 중 5개(55.5%) 시료가 검출되었다(Table 2, Table 3).

어류 또는 어류 부산물을 원료로 사용한 젓갈의 대장균군은 <1.8-230 MPN/100 g, 기타 수산물을 원료로 제조한 젓갈의 대장균군의 범위는 <18-490 MPN/100 g이었다(Table 2).

어류를 원료로 제조된 양념젓갈 중 대구아가미젓갈과 전어 젓갈의 각각 대장균군은 2, 400 MPN/100 g 및 1, 300 MPN/100 g이었으며, 갑오징어, 꼴뚜기, 낙지, 오징어를 원료로 제조된 양념 젓갈의 대장균군은 <18-22, 000 MPN/100 g이 검출되었다. 기타 수산물을 원료로 제조된 양념젓갈에서의 대장균군은 <18-2, 400 MPN/100 g이 검출되었다. 어류를 원료로 제조된 식해의 대장균군은 <18-230 MPN/100 g이었으며, 오징어 식해는 검출되지 않았다. 분변계대장균과 대장균은 대부분 젓갈 시료에 불검출이었으며, 검출된 오징어, 해삼내장, 가지 미식 해에서 20-40 MPN/100 g이 검출되어 함량이 매우 낮았다(Table 3).

시중 유통 젓갈 51건에 대한 대장균 검출 유무를 조사한 결과, 시료 중 17건에서 대장균군이 검출되었으며, 평균 검출량은 0.8±1.2 log CFU/g으로 보고되었다(Choi et al., 2018). 특히 꼴뚜기젓, 오징어젓, 청어알젓이 각각 평균 2.7, 2.1, 2.1 log CFU/ g으로 가장 높은 오염도를 나타내었다. 본 연구에서 젓갈류는 <18-22, 000 MPN/100 g이었으며, 대구아가미젓갈, 멍게젓, 전어젓에서 높은 대장균군이 검출되었다. Lee et al. (2008)의 연구 결과에서도 젓갈의 대장균군은 평균 1.4 log CFU/g과 양념 젓갈에서는 평균 2.3 log CFU/g이 확인되었으며, 대장균은 양념 젓갈에서만 970 CFU/g 검출된 결과와 달리, 본 실험에서는 대장균은 검출되지 않았다.

식중독세균

시중 유통 중인 젓갈류의 식중독균의 유무를 확인하기 위해 차세대염기서열(next-generation sequencing, NGS) 분석 결과, 갈치젓(1종)에서만 Yersinia enterocolitica가 검출되었다 (Table 4). 이를 제외한 다른 젓갈류에서는 B. cereus, C. per- fringens, Salmonella 속, V. parahaemolyticus, L. monocyto- genes, 장출혈성대장균(Enterohemorrhagic E. coli), C. jejuni, C. coli, Y. enterocolitica는 검출되지 않았다. 젓갈에서 Bacillus 속, Micrococcus 속이 빈번히 검출되었고 가리비젓, 가자미식해, 꼴뚜기젓, 멸치젓 등 17종의 젓갈에서 70종의 Bacillus 속 균주와 5종의 Pseudomonas 속 균주가 분리 보고와는 차이가 있었다(Kim et al., 2009; Choi et al., 2018).

Table 4. The results of food-poisoning bacterial quality evaluation of commercial salt-fermented fishery products

ND, not detected.

Choi et al. (2018)은 PCR을 이용한 젓갈류의 식중독균을 실험하였을 때, Salmonella 속, V. parahaemolyticus, Listeria monocytogenes, 장출혈성대장균(Enterohemorrhagic E. coli), Y. enterocolitica은 검출되지 않았으며, 양념젓갈 20건, 젓갈 2 건에서 B. cereus가 검출되다는 보고가 있었고, 본 연구에서는 갈치젓 1종만 제외하고 대부분의 젓갈류에서 식중독균은 검출되지 않았지만, 일부 제품은 대장균까지 확인된 것으로 볼 때 젓갈류의 지속적 식품안전성 확보를 위해서는 젓갈 제조 공정별로 체계적인 위생안전관리 구축 및 고춧가루 등 부재료에 대한 엄격한 품질관리가 필요하다.