Antimicrobial Substance of Lactobacillus johnsonii PF01

락토바실러스 존소니 PF01 균주 유래 항균 활성

Abstract

Culture concentrate of probiotic Lactobacillus johnsonii PF01 inhibited the growth of Staphylococcus aureus, which was confirmed by agar well diffusion method. Protease treatment of PF01 culture concentrate indicated that the antimicrobial substance of PF01 was a bacteriocin. Investigation of PF01 genome revealed the existence of a gene similar to that of helveticin, which showed 34.9% and 41.0% identity with those of L. helveticus 481 and L. crispatus K313, respectively, thereby suggesting that the bacteriocin produced by strain PF01 is a helveticin homolog.

장관 흡착능 등을 비롯한 프로바이오틱 활성이 우수한 Lactobacillus johnsonii PF01의 배양상등액을 황산암모늄으로 70% 농축한 후에 항균능을 조사한 결과, 황색포도상구균을 억제하는 활성을 나타내었다. PF01 균주가 분비하는 항균물질은 단백질분해효소 proteinase K에 의해 항균활성이 소실되지 않는 특성을 나타냄으로써, 항균물질이 박테리오신일 가능성을 시사하였다. L. johnsonii PF01 유전체에서 박테리오신을 코딩하는 유전자를 검색한 결과, helveticin과 상동성이 높은 유전자가 존재함을 확인하였다.

서론

유제품을 비롯한 각종 식품의 보존성을 높이기 위해 살균조건 조절, 냉장 또는 냉동 보관, 식품첨가물 사용 등의 다양한 방법이 활용되고 있으며, 유산균 유래의 항균물질을 이용하여 유제품의 보존성을 향상시키는 연구도 활발히 이루어지고 있다[1,2]. 유산균 유래의 항균물질에는 박테리오신, 젖산, 초산, diacetyl, 과산화수소 등 다양한 물질이 보고되었다[3]. 그 중에서도 박테리오신은 항생물질과는 달리 자신의 유전자로부터 직접 생합성되는 단백질로서, 그동안 다양한 종류의 박테리오신이 유산균으로부터 발견되었다[2,4]. 특히, 박테리오신은 사람이나 동물이 섭취하게 될 경우에 소화기관에서 가수분해됨으로써 잔류성이 없기 때문에 식품보존제로서 매우 유망한 소재이기도 하다[5]. 전세계적으로 가장 많이 연구된 박테리오신 중의 하나는 nisin으로서, 미국 식품의약국에서 GRAS 식품첨가물로 인정한 바 있으며, 여러 국가에서 실제로 식품에 사용하고 있다[6]. 또한, 박테리오신은 식품산업뿐만 아니라, 충치 예방, 항생물질 내성균 억제, 염증 억제, 피부질환 치료 등 다양한 분야에서의 응용에 관한 연구가 세계 각국에서 활발히 이루어지고 있다[3, 7, 8].

Lactobacillus johnsonii PF01은 장관 흡착능 및 내산성, 내담즙성이 우수한 특성을 가진 균주로서[9], 그 유전체에 관한 정보가 보고된 바 있다[10]. 본 연구에서는 L. johnsonii PF01 균주가 박테리오신 특성을 가진 항균물질을 분비하며, PF01 균주의 유전체에 박테리오신 유전자가 존재함을 보고하고자 한다.

재료 및 방법

1. 시약

유산균의 배양을 위해 Lactobacilli MRS broth(BD, USA)와 Bacto™ Agar(BD, USA)를 사용하였다.

2. 사용균주 및 배양조건

항균물질 생산균주로 사용된 L. johnsonii PF01(NCBI Accession No.: PRJNA67469)을 37℃에서 3회 계대배양한 후에 본 실험에 사용하였다. 이후 활성이 유지된 균주를 MRS 액체배지에0.1%(v/v) 접종하고 24시간 동안 배양하였으며, 8,000 g에서 10분 동안 원심분리하여 균체를 제거하였다. 상등액을 회수한 후에 농축하여 항균실험에 사용하였다. 항균실험을 위한 지시균으로는 Staphylococcus aureus KFRI 00188 균주를 사용하였다.

3. 항균물질의 농축

L. johnsonii PF01 배양액 1리터에 100 mesh 수준으로 분쇄한 황산암모늄(DAEJUNG, Korea)을 70%까지 서서히 첨가하여 단백질을 침전시켰다. 용액을 4℃에서 12시간 동안 저장한 후에, 8,000 g에서 30분간 원심분리하여 침전물을 회수하였으며, 50 mM Tris-Cl buffer(pH 7.0)에 용해 시켰다. 용해된 시료를 dialysis membrane(Pre-wetted RC tubing [MWCO: 1 kD], Spectra/Por®, USA)에 투입한 후에 4℃에서 12시간 동안 투석하여 염을 제거하였으며, 항균실험에 사용하였다.

4. 항균실험

L. johnsonii PF01 배양농축액의 항균실험은 agar well diffusion assay 방법[7]을 사용하였다. PF01 균주이 배양농축액을 0.45 μm pore size의 필터(BioFACT, Korea)를 사용하여 멸균한 후에 실험에 사용하였다. 먼저, 지시균인 Staphylococcus aureus KFRI 00188 배양액 0.1%(v/v)를 softagar medium(0.75% agar)과 접종한 후에 MRS 고체배지 표면에 분주하였다. 1시간 후에 멸균된 glass cylinder를 사용하여 MRS 고체배지에 구멍을 뚫었으며, PF01 균주의 배양농축액 200 μL를 주입하였다. 이를 30℃에서 2–3일간 배양한 후에 well 주위의 투명환 생성 여부를 확인하였다.

5. 항균물질 유전자의 아미노산 서열 비교분석

PF01 유전체로부터 항균물질 유전자를 탐색하고, 아미노산 서열을 분석하기 위해 Bioedit 프로그램[11]과 Ezbiocloud[12]를 사용하였다. National Center for Biotechnology Information(NCBI) 데이터베이스를 활용한 유사성 분석을 위해서는 Basic Local Alignment Search Tool(Blastx/Blastn) 프로그램을 사용하였다.

결과 및 고찰

1. L. johnsonii PF01 유래의 항균물질

Fig. 1은 L. johnsonii PF01 균주의 전자현미경 사진으로서, 전형적인 락토바실러스 속의 형태를 띠고 있었다. L. johnsonii PF01 배양상등액을 황산암모늄으로 농축한 후에 agar well diffusion 방법으로 항균력을 관찰한 결과는 Fig. 2에서 보는 바와 같다. PF01 균주의 배양상등액 농축액은 지시균인 Staphylococcus aureus KFRI00188의 생장을 억제하는 활성을 나타내었다. PF01 균주가 분비하는 항균물질은 단백질분해효소(proteinase K)에 의해 항균활성이 소실되지 않는 특성을 나타냄으로써, 항균물질이 박테리오신일 가능성을 시사하였다(data not shown). 향후에는 PF01 균주가 분비하는 항균물질이 KK01 이외의 다른 그람양성 및 음성균의 생장억제 여부에 대해서도 조사 할 필요가 있을 것으로 사료되었다.

Fig. 1. Scanning electron microscope observation (magnification×10 k) of Lactobacillus johnsonii PF01.

Fig. 2. Inhibition of Staphylococcus aureus KFRI00188 by Lactobacillus johnsonii PF01 via agar well diffusion method. Culture supernatant of L. johnsonii PF01 was concentrated using ammonium sulfate. 0.2M HCl was used as positive control (PC).

2. L. johnsonii PF01 유전체로부터 항균물질 유전자의 분석

Lee 등[10]이 보고한 L. johnsonii PF01 유전체에서 항균물질 유전자를 검색한 결과, 37.02 kb 크기의 helveticin J와 상동성이 매우 높은 유전자가 검색되었다. Helveticin J homologue를 아미노산으로 번역한 후에 상동성 검색을 실시한 결과는 Fig. 3에서 보는 바와 같다. L. johnsonii PF01 유래의 helveticin J homologue는 각각 L. heveticus 481 유래의 helveticin과 34.9%, L. crispatus K313 유래의 helveticin과 41.0%의 상동성을 나타내었다. 뿐만 아니라, L. heveticus 481 및 L. crispatus K313 유래의 helveticin과의 상동성이 34.1%로서, PF01 균주의 유전체에 존재하는 유전자가 helveticin 유전자일 가능성이 높을 것으로 추측되었다.

Helveticin J 박테리오신은 L. helveticus에서 발견되었으며[13], class III에 해당하는 항균단백질로 알려져 있다[14]. Joerger 등[15]은 L. helveticus 481 균주로부터 helveticus J 유전자를 클로닝한 바 있다. Sun 등[16]은 Lactobacillus crispatus로부터 helveticin M을 분리하였으며, S. aureus, S. saprophyticus, Enterobacter cloacae 등에 대해 항균능을 나타내었다. Stoyancheva [17]는 다수의 L. crispatus 로부터 helveticin 유전자의 존재를 보고한 바 있다.

현재까지, 박테리오신 생산균주의 탐색, 유산균 유래의 박테리오신 정제 및 특성 조사 등 많은 기초연구가 진행된 바 있다. 본 연구에 사용된 L. johnsonii PF01 균주의 유전체 분석을 통하여 PF01 균주가 분비하는 항균물질은 helveticin과 매우 유사한 박테리오신일 것으로 추측되었다. 향후에는 L. johnsonii PF01의 유전체부터 helveticin homologue 유전자의 클로닝 및 발현실험을 통하여 항균물질의 특성을 추가적으로 규명할 필요가 있을 것으로 사료되었다.

Fig. 3. Alignment of the helveticin homologue from Lactobacillus johnsonii PF01 with helevitins from GenBank database. Helveticin contained three highly conserved motifs G-H-T-Q-T-W, T-Q-I-A-R and L-P-R-L-S [16], marked with an asterisk (*). The helveticin sequences are as the followings; Helv J from Lactobacillus helveticus 481 (AAA63274.1), Helv M from Lactobacillus crispatus K313 (ASV46239.1) and Helv PF01 from Lactobacillus johnsonii PF01 (EGP13559.1).

요약

장관 흡착능 등을 비롯한 프로바이오틱 활성이 우수한 Lactobacillus johnsonii PF01의 배양상 등액을 황산암모늄으로 70% 농축한 후에 항균능을 조사한 결과, 황색포도상구균을 억제하는 활성을 나타내었다. PF01 균주가 분비하는 항균물질은 단백질분해효소 proteinase K에 의해 항균활성이 소실되지 않는 특성을 나타냄으로써, 항균물질이 박테리오신일 가능성을 시사하였다. L. johnsonii PF01 유전체에서 박테리오신을 코딩하는 유전자를 검색한 결과, helveticin과 상동성이 높은 유전자가 존재함을 확인하였다.

Conflict of Interest

The authors declare no potential conflict of interest.

감사의 글

본 논문은 농촌진흥청 차세대바이오그린21사업(세부과제번호: PJ 01322303)의 지원에 의해 이루 어진 것임.