Effect of Coptidis Rhizoma and Evodiae Fructus Mixture on Esophageal Mucosa in Chronic Reflux Esophagitis

만성 역류성 식도염에서 황련과 오수유 혼합물이 식도 점막에 미치는 효과

Abstract

Gastroesophageal reflux disease (GERD) is a disease that stomach contents continually refluxing, and is currently on the rise worldwide. The purpose of this study is to find natural materials that can reduce side effects and effectively treat chronic acid reflux esophagitis (CARE), one of GERD. First, the antioxidant activity was confirmed by varying the mixing ratio of Coptidis Rhizoma and Evodiae Fructus, which are effective against chronic reflux esophagitis. After, animal experiments were conducted using a 1:1 (CE) and 1:2 (CEE) combination ratio of Coptidis Rhizoma and Evodiae Fructus, which had the best antioxidant efficacy. Gross lesion of esophageal mucosa after CE or CEE treatment showed a superior enhancement compared with that of CARE control rats. Additionally, its inhibited MAPK phosphorylation and led NF-κB inactivation through the suppression of IκBα phosporylation by regulating Nrf2/Keap-1, and NF-κB inactivation induced reduced protein expressions including inflammatory mediators and cytokines. Moreover, its improved esophageal barrier function through upregulating protein expressions of tight junction protein, whereas downregulating protein expressions of MMPs. Taken together, a mixture of Coptidis Rhizoma and Evodiae Fructus can attenuate the esophageal mucosal ulcer by inhibiting MAPK and NF-κB pathway, and upregulating proteins associated with tight junction.

위식도 역류질환(Gastroesophageal reflux disease; GERD) 은 위장관 질환 중 하나로 식도에 형태조직학적 변화를 초래하거나 식도 내로 위산이 역류해서 임상증상이 나타나는 경우를 말하며, 식도협착, 바렛식도, 식도암 등의 합병증을 발생시킨다.¹⁾ 위식도 역류질환 중 위의 내용물이 역류하여 식도 내로 식도에 궤양이나 염증 등의 병변이 발생한 경우를 역류성 식도염(Reflux esophagitis; RE)이라고 하며, 그 원인으로는 위산분비의 항진, 위의 연동저하 등이 있으며, 이 중 하부식도 괄약근의 기능저하가 가장 큰 원인으로 꼽히고 있다.²⁾ 역류성 식도염은 주로 서구에서 발생하는 질환이었으나, 우리나라에서 2015년 기준 2010년과 비교하여 35%가량 증가하였으며, 서구에 비해서 유병률이 적은 편이지만 한 번 진단되면 완치가 힘들어 평생 진료를 받아야 하는 질환으로 치료와 관리에 관심이 깊어지고 있다.³⁾

역류성 식도염 치료를 위한 가장 기본적인 방법으로는 칼슘 채널 길항제 및 수면제의 복용을 금하고, 과식 및 기름진 음식을 금하는 등의 생활습관 조절 등이 있으며, 그 외에 현재 역류성 식도염 치료를 위해 사용되어지고 있는 약물로는 위산 분비를 억제하는 H2 수용체 길항제(H2RA) 및 양성자펌프 억제제(Proton pump inhibitor; PPIs) 등이 있으나, 장기간 복용시 장관 내 감염 위험도 증가, 폐렴 등의 부작용이 나타나며, 약물을 중단할 경우 재발율이 50~80%에 이른다.^{4, 5)} 따라서 장기간 복용하더라도 부작용이 적으면서 역류성 식도염을 효과적으로 치료할 수 있는 새로운 소재의 치료제 개발이 필요한 실정이다.

황련(Coptidis Rhizoma, 黃蓮)은 미나리아재비과 (Ranunculaceae)에 속하는 여러해살이 식물인 황련의 뿌리줄기를 건조한 것이다. 황련은 청열해독(淸熱解毒), 청열조습(淸熱燥濕) 및 사화해독(瀉火解毒) 효능이 있어 현대약리학에서 항생제 및 소염제 작용을 한다. 또한, 많은 연구들을 통해 항균, 항산화, 항아토피 등의 효과가 밝혀졌으며, 선행연구에서 만성 역류성 식도염 치료에 효과가 있다는 것을 확인하였다.^6-9)

오수유(Evodiae Fructus, 吳茱萸)는 운향과(Rutaceae)에 속하는 오수유 열매를 말하며, 한방에서는 설사, 복통 및 소화불량에 사용되어 왔다.¹⁰⁾ 오수유의 약리작용으로는 항균 효과, 신경세포 보호효과, 항염증효과 등이 알려져 있다.^11-13)최근 연구를 통해 급성 역류성 식도염에세 식도 점막을 보호해주는 효과가 있다고 알려졌으며, 선행연구를 통해 만성역류성 식도염에도 효과가 있음을 확인하였다.^{4, 14)}

본 실험에서는 역류성 식도염에 효과가 있는 황련과 오수 유를 배합하여 만성 역류성 식도염 동물 모델에서 황련과 오수유의 배합비에 따른 역류성 식도염에 대한 효과에 대하여 연구하였으며, 식도 점막 손상 정도, 염증 및 식도 기능과 관련된 단백질의 발현을 확인하여 유의한 결과를 얻었기에 이를 보고하는 바이다.

재료 및 방법

시료

본 실험에서 사용한 황련과 오수유는 옹기한약국 (대구, 한국)에서 구입한 것 대구한의대학교 한의과대학 노성수교수가 생약규격집에 맞추어 관능검사 후, 약전규격에 적합한 것만을 정산하여 사용하였다. 황련과 오수유 100 g 을 각각 분쇄한 후, 증류수 1L을 가하여 열탕추출기에서 2시간 추출하였다. 얻어진 추출물은 감압농축기로 농축 후, 동결건조기를 이용해 완전히 건조시켜 파우더를 얻어(수율; 황련 14%, 오수유 15.66%) -80°C에서 보관하였으며, 황련-오수유(1:1) 혼합물을 CE, 황련-오수유(1:2) 혼합물을 CEE, 황련-오수유(2:1) 혼합물을 CCE로 표기하였다.

시약

본 실험에 사용된 2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), 7 mM 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6- sulphonic acid)(ABTS), potassium phosphate monobasic, potassium phosphate dibasic은 Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. Nitrocellulose membranes는 Amersham GE Healthcare(Chicago, IL, USA)에서 구입하였고, NADPH oxidase 4(NOX4), p47^phox, nuclear factor erythroid 2-related factor 2(Nrf2), kelch like ECH associated protein 1(Keap-1), phospho-p38 MAPK(pp38), phospho-extracellular signal-regulated kinase(p-ERK), phospho-c-Jun N-terminal Kinase(p-JNK), phosphorylation of nuclear factor-kappa B p65(NF-_KBp65), inhibitor of nuclear factor kappa B alpha(I_KBα), phosphorylation inhibitor of nuclear factor kappa B alpha(p-I_KBα), inducible nitric oxide synthase(iNOS), cyclooxygenase-2(COX-2), tumor necrosis factor-alpha(TNF-α), interleukin-6(IL-6), matrix metalloproteinase-2(MMP-2), matrix metalloproteinase8(MMP-8), zonula occludens-1(ZO-1) occludin, claudin-1, claudin-4, ꞵ-actin, histone은 Santa Cruz Biotechnology (Dallas, CA, USA)로부터 구입하여 사용하였고, c-Fos와 cJun는 Cell Signaling Technology, Inc.(Beverly, MA, USA) 에서 구입하여 사용하였으며, 2차항체는 GeneTex, Inc. (Irvine, LA, USA)에서 구입하여 사용하였다. Protease inhibitor mixture, ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA)는 Wako Pure Chemical Industries, Ltd.(Osaka. Japan)에서 구입하였다. 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate(DCFH-DA)와 dihydrorhodamine 123(DHR123)는 Molecular Probes(Eugene, OR, USA)에서 구입하였고, ECL western blotting detection reagents는 GE Healthcare로부터 구입하여 사용하였다. 단백질 정량을 위한 BCA protein assay kit는 Thermo Scientific (Waltham, MA, USA)에서 구입하였다.

DPPH 및 ABTS Radical 소거 활성 측정

시료의 항산화 효능을 측정하기 위해 DPPH free radical 소거법을 사용하여 radical 소거 활성을 측정하였다.¹⁵⁾ 60 mM DPPH 용액 100 µL와 농도별로 희석한 시료 용액 100 µL를 혼합하여 30분간 암소상태로 반응시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 L-ascorbic acid를 사용하였고, radical을 50% 감소시키는 시료의 농도를 IC₅₀ 값으로 나타내었다.

ABTS radical 소거 활성은 Re 등의 방법¹⁶⁾에 따라 측정 하였다. 7 mM ABTS 용액과 2.4 mM potassium persulfate 를 혼합하여 실온의 암소상태에서 약 16시간 이상 방치하여 ABTS+를 형성시킨 후, 흡광도(30°C, 415 nm) 값이 0.70±0.02가 되도록 ethanol로 희석하였다. 희석한 ABTS 용액 95 µL와 농도별로 희석한 시료 용액 5 µL를 혼합하여 15분간 반응시킨 후 30°C, 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 L-ascorbic acid를 사용하였고, radical을 50% 감소시키는 시료의 농도를 IC₅₀ 값으로 나타내었다.

DPPH and ABTS radical scavenging activity(%) = {1 - OD_sample/OD_blank} × 100

실험동물

5주령 SD 흰쥐 수컷을 대한바이오(음성, 한국)에서 구입하여 1주일간 사육실 환경에 적응시킨 후 실험을 진행하였다. 동물 사육실 조건은 conventional system으로, 온도 22±2o C, 습도 50±5%, 명암주기(light : dark cycle) 는 12시간 주기로 조절하였다. 또한, 사료(조단백질 18% 이상, 조지방 5.0% 이상, 조섬유 5.0% 이하, 조회분 8.0% 이하, 칼슘 1.0% 이상, 인 0.85% 이상, 칼륨 0.55% 이상, 나트륨 0.25% 이상, 마그네슘 0.15% 이상, NIH-41, Zeigler Bros, Inc., USA)와 물은 충분히 공급하였다. 본 실험은 동물실험의 윤리적, 과학적 타당성 검토 및 효율적인 관리를 위하여 대구한의대학교 동물실험윤리 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee: IACUC)의 승인(승인번호: 2020-053)을 받아 진행하였다.

만성 역류성 식도염 유발 및 동물 처치

수술 전, 18시간 절식 후 Zoletil(Virbac, France)을 복강주사하여 마취한 뒤 수술을 진행하였다. 제모기로 복부털을 제거하여 복간 정중부를 2 cm 정도 개복하여 위저부(Fundus)를 블랙 실크 (2-0)실로 묶고, 날문부(pylorus)에는 latex ring(18-Fr Nelaton catheter, 2 mm in thickness)을 끼워 나일론(5-0)실로 묶은후 복막과 피부를 봉합하였다.¹⁷⁾ 감염을 줄이기 위해 3일간 항생제(Gentamicin sulfate)와 항염증제(Dexamethasone)를 희석하여 피하주사 하였으며, 수술 24시간 후 물을 공급해 주었고, 수술 48시간 후부터 사료를 공급해 주었다. 1주일간 회복기를 거친 후, 아무런 처치를 하지 않은 정상군(Nor), 만성 역류성 식도염 유발 후 증류수를 투여한 대조군(Veh), 만성 역류성 식도염 유발 후 황련-오수유(1:1) 혼합물 200 mg/kg를 투여한 군(CE), 만성 역류성 식도염 유발 후 황련-오수유(1:2) 혼합물 200 mg/kg를 투여한 군(CEE) 총 4그룹으로 무작위 분류하였으며, 모든 그룹은 매일 일정한 시간에 몸무게 및 사료 섭취량을 측정하였고, 14일간 1일 1회씩 경구투여 하였다.

식도 조직 Western Blotting

식도 조직에 100 mM Tris-HCl(pH 7.4), 5 mM Tris-HCl(pH 7.5), 2 mM MgCl₂, 15 mM CaCl₂, 1.5 M sucrose, 0.1 M DTT, protease inhibitor cocktail을 첨가한 buffer A를 넣고 조직 분쇄기(tissue grinder)(Biospec Product, Bartlesville, OK, USA)로 분쇄한후 10% NP-40 용액을 첨가하였다. 아이스 위에서 30분간 정치시킨 후 12,000 rpm으로 2분간 원심분리 하여 세포질을 포함하고 있는 상층액을 분리하였다. 그 후, 10% NP-40가 더해진 buffer A에 두 번 헹구고 100 µL의 buffer C(50 mM HEPES, 50 mM KCl, 0.3 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.1 mM PMSF, 10% glycerol)를 첨가해 재부유시킨 후 10분마다 vortex를 3번 하였다. 4°C에서 12,000 rpm으로 10분간 원심 분리 한 후 핵을 포함하고 있는 상층액을 얻어 -80°C에서 각각 냉동 보관하였다. 식도 조직 세포질에서의 NOX4, p47phox, Keap-1, p-p38, p-ERK, p-JNK, I_KBα, p-I_KBα, iNOS, COX-2, TNF-α, IL-6, MMP-2, MMP-8, ZO-1, occludin, claudin-1, claudin-4, ꞵ-actin 단백질과 핵에서의 Nrf2, c-Fos, c-Jun, NF-_KBp65, histone 단백질 발현을 측정하기 위하여 10-12 µg의 단백질을 10-12% SDS polyacrylamide gel을 이용하여 전기연동 후, acrylamide gel을 nitrocellulose membrane으로 이동시켰다. 준비된 membrane에 각각의 1차 antibody를 처리하여 4o C에서 overnight 시킨 다음 PBS-T로 6분마다 5회 세척하고, 각각 처리된 1차 항체에 사용되는 2차 항체(PBS-T로 1:3000로 희석해서 사용)를 사용하여 상온에서 1시간 반응시킨 후, PBS-T로 6분마다 5회 세척하였다. Membrane을 enhanced chemiluminescence(ECL) 용액에 노출시킨 후, Sensi-Q2000 Chemidoc(Lugen Sci Co., Ltd., Seoul, Korea)에 감광시켜 단백질 발현을 확인한 후, 해당 band를 ATTO Densitograph Software(ATTO Corporation, Tokyo, Japan) 프로그램을 사용하여 정량하였다(represented as 1).

통계분석

In vitro의 수치는 mean±SEM으로, in vivo의 수치는 mean±SD로 표시하였으며, SPSS(Version 25.0, IBM, Armonk, NY, USA)를 사용하여 one-way analysis of variance(ANOVA) test를 실시한 후 least-significant differences(LSD) test로 사후검증을 실시하여 각 군의 평균 차이에 대한 통계적 유의성을 *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001에서 검증하였다.

결과

DPPH 및 ABTS Radical 소거 활성 측정

황련-오수유 혼합물 항산화 활성을 평가하기 위해 DPPH 및 ABTS radical 소거 활성을 측정하였으며, 측정 결과는 IC₅₀ 값으로 나타냈다.

DPPH radical 소거 활성 측정 결과, CE 22.62±1.01 µg/ mL, CEE 27.90±0.32 µg/mL, CCE 36.70±0.98 µg/mL으로 CE의 DPPH radical 소거 활성이 가장 뛰어났으며(Fig. 1), ABTS radical 소거 활성 측정 결과, CE 35.65±0.28 µg/mL, CEE 36.01±0.31 µg/mL, CCE 38.64±0.73 µg/mL으로 CE의 ABTS radical 소거 활성이 가장 뛰어났다(Fig. 2).

Fig. 1. DPPH radical scavenging activity of mixture of Coptidis Rhizoma and Evodiae Fructus by mixing ratio. DPPH radical scavenging of L-ascorbic acid; (A), DPPH radical scavenging of CE; (B), DPPH radical scavenging of CEE; (C), DPPH radical scavenging of CCE; (D). All values are expressed mean±SEM of three replications.

Fig. 2. ABTS radical scavenging activity of mixture of Coptidis Rhizoma and Evodiae Fructus by mixing ratio. ABTS radical scavenging of L-ascorbic acid; (A), ABTS radical scavenging of CE; (B), ABTS radical scavenging of CEE; (C), ABTS radical scavenging of CCE; (D). All values are expressed mean±SEM of three replications.

식도 점막 손상 확인

식도 점막의 손상 정도를 육안으로 관찰하였을 때, 아무런 처치를 하지 않은 Nor군의 식도 점막에서는 손상 및 궤양이 발견되지 않았으나, Con군에서는 중간 또는 하부식도에서 궤양이 발견되었고, Nor군과 비교하여 식도의 길이가 줄어들고 두께가 두꺼워졌다. 반면, CE군과 CEE군에서는 식도의 손상 및 궤양이 현저하게 감소하였다(Fig. 3).

Fig. 3. Representative image in each group of esophageal mucosal ulcer after surgical induction of CARE. Unopened esophagus that induced CARE; (A), the opened esophageal ulcer; (B). Normal rats; Nor, chronic acid reflux esophagitis rats; Veh, mixture of Coptidis Rhizoma and Evodiae Fructus in 1:1 ratio 200 mg/kg-treated chronic acid reflux esophagitis rats; CE, mixture of Coptidis Rhizoma and Evodiae Fructus in 1:2 ratio 200 mg/kg-treated chronic acid reflux esophagitis rats; CEE.

식도 조직 내 NADPH Oxidase 발현량 분석

식도 조직에서 NADPH oxidase인 NOX4와 p47^phox의 발현을 확인한 결과, Nor군에 대비 Veh군에서 유의하게 증가하였으며, Veh군 대비 CE군에서 NOX4 26%, p47^phox 16% 유의적으로 감소하였고, CEE군에서 NOX4 26%, p47^phox 24% 유의적으로 감소하였다. 특히, CE 대비 CEE군에서 p47^phox의 발현이 11% 더 감소하였다(Fig. 4).

Fig. 4. Expression of NADPH oxidase in esophagus. Normal rats; Nor, chronic acid reflux esophagitis rats; Veh, mixture of Coptidis Rhizoma and Evodiae Fructus in 1:1 ratio 200 mg/kg-treated chronic acid reflux esophagitis rats; CE, mixture of Coptidis Rhizoma and Evodiae Fructus in 1:2 ratio 200 mg/kg-treated chronic acid reflux esophagitis rats; CEE. All data are expressed means±SD (n=8). Significance: ^##p < 0.01 vs. Nor rats and **p < 0.01, ***p < 0.001 vs. Veh rats.

식도 조직 내 Nrf2 및 Keap-1 발현량 분석

식도 조직에서 Nrf2 및 Keap-1의 발현을 확인하였다. Nrf2의 발현은 Nor군 대비 Veh군에서 34% 감소하였으며, Veh군 대비 CE 군과 CEE군에서 38% 유의하게 증가하였다. 또한, Keap-1의 발현은 Nor군 대비 Veh군에서 15% 증가하였으며, Veh군대비 CE군에서 15% , CEE군에서 17% 유의하게 증가하였다(Fig. 5).

Fig. 5. Expression of Nrf2 and Keap-1 in esophagus. Normal rats; Nor, chronic acid reflux esophagitis rats; Veh, mixture of Coptidis Rhizoma and Evodiae Fructus in 1:1 ratio 200 mg/kg-treated chronic acid reflux esophagitis rats; CE, mixture of Coptidis Rhizoma and Evodiae Fructus in 1:2 ratio 200 mg/kg-treated chronic acid reflux esophagitis rats; CEE. All data are expressed means±SD (n=8). Significance: ^##p < 0.01, ^###p < 0.001 vs. Nor rats and **p < 0.01, ***p < 0.001 vs. Veh rats.

식도 조직 내 MAPKs 단백질 발현량 분석

식도 조직에서 MAPKs 단백질인 c-Fos, c-Jun, p-p38, p-ERK 및 pJNK의 발현을 확인하였다. c-Fos와 c-Jun의 발현은 Nor군 대비 Veh군에서 각각 24%, 19% 증가한 반면, Veh군 대비 CEE군에서 발현이 약 20% 유의하게 감소하였으며, 특히 cJun의 발현은 CE군에 비하여 CEE군에서 크게 감소하였다. 또한, p-p38의 발현은 Nor군 대비 Veh군에서 27% 증가한 반면, CE군에서는 Nor군 같은 수준으로 발현이 감소하였으며, p-ERK의 발현은 Nor군 대비 Veh군에서 27% 증가한 반면, Veh군 대비 CEE군에서 29% 유의적으로 감소하였으며, Nor 군보다 10% 감소된 발현을 나타냈다. p-JNK의 발현은 Nor 군 대비 Veh군에서 15% 증가하였으며, Veh군 대비 CE군에서 11%, CEE군에서 13% 감소하였다(Fig. 6).

Fig. 6. Expression of MAPKs proteins in esophagus. Normal rats; Nor, chronic acid reflux esophagitis rats; Veh, mixture of Coptidis Rhizoma and Evodiae Fructus in 1:1 ratio 200 mg/kg-treated chronic acid reflux esophagitis rats; CE, mixture of Coptidis Rhizoma and Evodiae Fructus in 1:2 ratio 200 mg/kg-treated chronic acid reflux esophagitis rats; CEE. All data are expressed means±SD (n=8). Significance: ^# p < 0.05, ^##p < 0.01, ^###p < 0.001 vs. Nor rats and *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 vs. Veh rats.

식도 조직 내 Inflammatory Protein 발현량 분석

식도 조직에서 inflammatory 단백질인 NF--_KBp65와 p-I_KBα의 발현을 확인하였다. Nor군 대비 Veh군에서 NF-_KBp65 21%, p-I_KBα 31% 크게 증가하였고, Veh군 대비 CE군에서 NFBp65의 발현은 18% 감소하여 Nor군과 같은 발현량를 나타냈으며, CEE군에서는 21% 유의하게 감소하였다. 또한, p-I_KBα의 발현은 CEE군에서 18% 감소하여 Nor군과 비슷한 발현량을 나타냈다(Fig. 7).

Fig. 7. Expression of inflammatory proteins in esophagus. Normal rats; Nor, chronic acid reflux esophagitis rats; Veh, mixture of Coptidis Rhizoma and Evodiae Fructus in 1:1 ratio 200 mg/kg-treated chronic acid reflux esophagitis rats; CE, mixture of Coptidis Rhizoma and Evodiae Fructus in 1:2 ratio 200 mg/kg-treated chronic acid reflux esophagitis rats; CEE. All data are expressed means±SD (n=8). Significance: ^##p < 0.01, ^###p < 0.001 vs. Nor rats and *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 vs. Veh rats.

식도 조직 내 Proinflammatory Enzymes 및 Cytokines 분석

식도 조직에서 proinflammatory enzymes인 iNOS, COX-2와 cytokine TNF-α, IL-6의 발현을 확인하였다. Nor 군 대비 Veh군에서 iNOS와 COX-2의 발현이 25% 증가하였으며, Veh군 대비 CEE군에서 iNOS 21%, COX-2 13% 유의하게 감소하였다. 또한, Nor군 대비 Veh군에서 TNF-ɑ22%, IL-6 18% 크게 증가하였으며, Veh군 대비 CEE군에서 각각 20% 이상 유의하게 감소하였다(Fig. 8).

Fig. 8. Expression of proinflammatory enzymes and cytokines in esophagus. Normal rats; Nor, chronic acid reflux esophagitis rats; Veh, mixture of Coptidis Rhizoma and Evodiae Fructus in 1:1 ratio 200 mg/kg-treated chronic acid reflux esophagitis rats; CE, mixture of Coptidis Rhizoma and Evodiae Fructus in 1:2 ratio 200 mg/kg-treated chronic acid reflux esophagitis rats; CEE. All data are expressed means±SD (n=8). Significance: ^##p < 0.01, ^###p < 0.001 vs. Nor rats and *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 vs. Veh rats.

식도 조직 내 MMP-2 및 MMP-8 발현량 분석

식도 조직에서 MMP-2와 MMP-8의 발현을 확인하였다. MMP-2와 MMP-8의 발현은 Nor군 대비 Veh군에서 20% 이상 크게 증가한 반면, Veh군 대비 CE군에서 MMP-2 11%, MMP8 19% 유의하게 감소하였으며, CEE군에서는 MMP-2와 MMP-8 모두 약 20% 유의하게 감소하였다(Fig. 9).

Fig. 9. Expression of MMP-2 and MMP-8 in esophagus. Normal rats; Nor, chronic acid reflux esophagitis rats; Veh, mixture of Coptidis Rhizoma and Evodiae Fructus in 1:1 ratio 200 mg/kg-treated chronic acid reflux esophagitis rats; CE, mixture of Coptidis Rhizoma and Evodiae Fructus in 1:2 ratio 200 mg/kg-treated chronic acid reflux esophagitis rats; CEE. All data are expressed means±SD (n=8). Significance: ^##p < 0.01 vs. Nor rats and *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 vs. Veh rats.

식도 조직 내 Tight Junction Protein 발현량 분석

식도 조직에서 tight junction 단백질인 ZO-1, occludin, claudin-1 및 claudin-4의 발현을 확인하였다. Nor군 대비 Veh군에서 ZO-1, occludin, claudin-1 및 claudin-4 모두 약 20% 크게 증가하였다. 반면에, Veh군 대비 CEE군에서 ZO1, occludin 및 claudin-4의 발현이 약 20% 유의하게 감소하였다. claudin-1의 발현은 CE군에서 17%, CEE군에서 13%감소하였으며, CEE군 보다 CE군에서 더 크게 증가한 것을 확인하였다(Fig. 10).

Fig. 10. Expression of tight junction proteins in esophagus. Normal rats; Nor, chronic acid reflux esophagitis rats; Veh, mixture of Coptidis Rhizoma and Evodiae Fructus in 1:1 ratio 200 mg/kg-treated chronic acid reflux esophagitis rats; CE, mixture of Coptidis Rhizoma and Evodiae Fructus in 1:2 ratio 200 mg/kg-treated chronic acid reflux esophagitis rats; CEE. All data are expressed means±SD (n=8). Significance: ^##p < 0.01 vs. Nor rats and *p < 0.05, **p < 0.01 vs. Veh rats.

고찰

위식도 역류질환(Gastroesophageal reflux disease; GERD) 은 위산이 식도 내로 역류하여 궤양이나 미란 등의 형태로 조직학적 병변뿐만 아니라, 가슴쓰림, 흉통, 목이물감, 만성 기침 등의 증상을 포괄한다.²⁾ GERD는 인구의 고령화 및 식습관 변화로 인해 증가하는 추세이며, 적절한 관리를 못할 경우 만성질환으로 이어지고 있다. 현재 H₂ 수용제 차단제 및 PPIs 등에 의한 위산분비 억제가 가장 핵심적인 GERD 치료방법으로 사용되고 있으나, 이러한 치료는 적절한 우지치료 기간이 어느 정도인지 불명확하며, 약 복용 중단하게 될 경우 1년 이내 50~80%가 재발하는 것으로 알려져 있어 재발을 방지하기 위한 장기간 치료가 필요한 실정이다.^{18, 19)} 이러한 문제를 해결하기 위하여 부작용이 없는 새로운 치료제 개발을 위한 많은 연구가 이루어지고 있으며, 본 실험에서는 역류성 식도염 치료를 위한 새로운 소재를 개발하기 위하여 역류성 식도염에 효과가 있다고 알려진 황련과 오수유를 배합하여 배합비에 따른 역류성 식도염에 대한 효능을 평가하였다.

먼저, CE(황련-오수유 1:1), CEE(황련-오수유 1:2), CCE (황련-오수유 2:1) 3가지 배합비의 항산화 효능을 알아보았다. 모든 생물체들은 생명유지를 위해 필요한 에너지를 생성하는 과정에서 활성산소종(Reactive oxygen species; ROS) 를 발생시킨다. 정상세포 내에서 활성산소종은 항산화인자와 균형을 이루며 존재하며, 항산화인자의 결핍은 세포구성 성분들을 파괴시켜 조직 손상을 초래하여 만성 염증, 악성 종양 등에 이르는 다양한 질병을 발생시킨다.²⁰⁾ 본 실험에서 DPPH 및 ABTS radical 소거 활성을 확인한 결과, CE 와 CEE에서 뛰어난 항산화 효과를 나타냈으며, CE와 CEE 두가지 배합비를 사용하여 동물실험을 실시하였다(Fig. 1-2).

수술을 통해 만성 역류성 식도염 유발 후 CE 및 CEE를 14일간 경구투여 하였으며, 15일째 부검을 통하여 혈액 및 식도조직을 채취하였다. 식도조직의 손상정도를 육안적으로 관찰한 결과, 정상군에서는 식도 점막에서 궤양 및 미란 등을 관찰할 수 없었으나 대조군에서는 식도 중간부위와 하부식도의 궤양을 확인하였으며, 정상군과 비교하여 식도 조직이 붓고 두꺼워진 것을 확인하였다. 반면, CE군과 CEE 군에서는 대조군에 비하여 식도조직의 손상이 현저하게 감소한 것을 확인하였다(Fig. 3).

NADPH oxidase는 중성구에서 호흡폭발로 발생하는 활성산소종을 발생시킨다. NADPH oxidase에 의해 발생된 활성산소종은 체내의 산화적 스트레스를 유도하여 단백질의 손상 및 DNA를 손상시키는 원인이며, 더 나아가 세포사멸을 유도한다고 알려져 있다.^{21, 22)} 체내에 생성된 산화적 스트레스는 염증질환, 비만 및 암 등 다양한 질환의 발병과 진행에 관여하는 위험요소로 인식되고 있으며, 산화적 스트레스를 조절하는 대표적인 시스템으로는 Nrf2/Keap-1 신호전달체계가 있다. Nrf2는 정상적인 상태일 경우 세포질에서 Keap-1과 복합체를 형성하고 있으며 산화적 스트레스 등의 자극에 의해 Keap-1이 분해되고 Nrf2가 핵 안으로 들어가 세포독성 및 ROS조절을 통해 세포를 보호한다.²³⁾ 본 실험에서 NADPH oxidase인 NOX4와 p47^phox의 발현을 확인한 결과, 황련-오수유 혼합물을 투여한 CE군과 CEE군에서 NOX4와 p47^phox의 발현이 유의하게 감소하는 것을 확인하였으며. 특히 CEE군에서 p47^phox의 발현이 크게 감소한 것을 확인하였다(Fig. 4). 또한, CE와 CEE의 투여는 Nrf2/ Keap-1의 발현을 조절한 것을 확인하였다(Fig. 5).

Mitogen-activated protein kinase(MAPK)는 세포 외 신호 전달, 세포의 분열 및 증식을 등을 조절하는 중요한 역할을 가진다. MAPK는 p38, ERK, JNK 등의 단백질을 말하며, LPS 또는 성장인자에 의해 활성화 되어 NF-_KB의 활성화를 유도하게 되면서 iNOS, COX-2와 같은 여러 전염증성 단백질 및 염증성 사이토카인의 발현을 유도한다.^{24, 25)} 본 실험에서 MAPKs와 NF-_KB 관련 단백질의 발현을 확인한 결과. CEE군에서 c-Fos, c-Jun, p-p38, p-ERK 및 p-JNK를 포함한 MAPKs 단백질의 발현을 유희하게 감소시켰으며, CE군과 CEE군에서 NF-_KBp65와 p-I_KBα의 발현 또한 유의하게 감소하였다(Fig. 6, 7). 뿐만 아니라 CEE 투여는 전염증성 단백질과 염증성 사이토카인의 발현을 유의하게 감소시켰으며, CE 투여군에서도 염증성 사이토카인의 발현의 유의하게 감소하였다(Fig. 8). 이는 만성 역류성 식도염 동물모델에서 황련-오수유 혼합물은 MAPKs 및 NF-_KB 경로를 통하여 식도 점막의 손상을 감소시키는 것으로 판단된다.

많은 연구들을 통해 GERD환자의 상피세포에서 NF-_KB 가 활성화된다는 것이 밝혀졌으며, NF-_KB는 tight junction (TJ) 단백질과 matrix metalloproteinases(MMPs)의 발현을 조절하는 것으로 알려졌다. MMPs는 단백분해효소로써 염증성 조직을 파괴하는 핵심적인 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 신체의 결합조직의 항상성을 조절한다고 알려져 있지만 조절기능이 붕괴된다면 세포외 기질의 분해 및 재구성을 발생시키는 것으로 알려져 있다.^{26, 27)} 또한, TJ 단백질은 세포 공간을 연결하는 주요 단백질로 ZO-1, occludin, claudins 등이 있으며, GERD에 의해 식도 점막이 손상되면 결합조직에서의 TJ의 감소를 유도한다.^27-29) 본 실험 결과, CE군과 CEE군에서 MMPs 단백질 및 TJ 단백질의 발현을 유의하게 조절하였으며, 특히 CEE군에서 더욱 뛰어난 효과를 나타내었다. 이는 황련-오수유 혼합물이 상피세포 결합 조직의 손상을 보호하였음을 나타내며, 오수유의 배합비가 높을 때 그 효과가 더 뛰어나게 나타났다.

결론

본 연구는 배합비를 달리한 황련-오수유 혼합물이 만성역류성 식도염에서 미치는 식도 점막 보호 효과에 대해 평가하였다. 황련-오수유의 배합비를 달리하여 항산화 효능을 확인하였으며, 그 중 효과가 뛰어났던 1:1과 1:2 배합비를 이용하여 동물실험을 실시하였다. 만성 역류성 식도염 모델에서 CE보다 CEE에서 더 뛰어난 식도 점막 보호 효과가 있음을 확인하였다. 이러한 식도 점막 보호 효과는 MAPKs 및 NF-_KB 경로를 억제하여 iNOS, COX-2, TNF-α 및 IL6와 같은 염증 인자들의 발현을 억제함으로써 염증을 완화한다는 것을 확인하였으며, 뿐만 아니라 MMPs와 tight junction 단백질의 발현을 조절함으로써 식도의 결합조직 내 손상을 억제하였다. 이상의 결과는 황련-오수유 혼합물은 역류성 식도염 치료를 위한 새로운 건강기능식품으로의 개발이 가능할 것으로 사료된다.