Swertia pseudochinensis Methanol Extract Inhibits IgE-mediated Allergic Response In vitro and In vivo

자주쓴풀 메탄올추출물의 IgE-매개 알레르기 반응 억제 및 기전

Abstract

Mast cells play a key role in IgE-mediated allergic response. We investigated whether Swertia pseudochinensis Hara extract (SPE) inhibits IgE-mediated allergic response in mast cells and an allergic animal model. Additionally, we explored SPE's mechanism of action in mast cells. Our results showed that SPE inhibited both antigen-stimulated degranulation and the production of TNF-α and IL-4 in bone marrow-derived mast cells (BMMCs) and rat basophilic leukemia (RBL)-2H3 cells. SPE also suppressed allergic response in IgE-mediated passive cutaneous anaphylaxis (PCA) in mice. As for the mechanism of action of SPE in mast cells, it inhibited the activation of Syk kinase, a critical signaling protein in the FcεRI-mediated signaling pathway, and also the activation of LAT, a downstream adaptor protein of Syk. We further observed the reduced activation of mitogen-activated protein (MAP) kinases (P38, ERK1/2, and JNK) and Akt in mast cells. Our results described for the first time that SPE has an anti-allergic effect by suppressing mast cells through the inhibition of Syk kinase. Therefore, SPE may be useful for the treatment of type I allergic diseases.

전세계적으로 알레르기 비염 환자수는 4백만명 그리고 천식 환자수는 3백만명에 이르고 있다. 산업화 및 이에 따르는 대기오염 등으로 환자수가 매년 증가하는 추세이고, 우리나라도 예외가 아니다.¹⁾ 건강보험심사평가원 자료에 따르면 알레르기성 비염으로 병원을 찾은 환자수가 2013년 2, 149, 122명에서 2018년 2, 624, 070명으로 6년사이에 약 48만명이 더 증가했다.²⁾ 알레르기성 비염은 알레르기 질환의 대표적 예일 뿐 천식, 음식물 알레르기 및 아토피성 피부염 등을 포함하여 더 많은 사람이 알레르기 질환으로 고통받고 있다.^{2, 3)} 알레르기는 신체외부에서 침입한 무해한 항원에 대한 과도하고 불필요한 면역반응으로 장기간 지속되는 경우가 많고, 예방과 완치가 어려운 질환으로 지속적인 역학조사와 위험인자 연구가 진행되고 있다.¹⁾

비만세포는 알레르기 질환에 관여하는 주요 염증 세포로 잘 알려져 있다.³⁾ 항원에 의해 활성화된 비만세포는 알레르기 매개 사이토카인을 함유하는 과립들을 세포 외부로 분비하여 알레르기 반응의 주요원인이 된다. 비만세포가 분비하는 대표적인 염증반응 매개 물질로 histamine 및 serotonin 등이 있고, 지속된 알레르기 환경에서 TNF-\(\alpha\)와 IL-4가 추가로 분비되어 알레르기 반응이 계속된다.⁴⁾

비만세포의 고 친화성 IgE 수용체(FcεRI, high-affinity receptor for IgE)와 복합체를 이루고 있는 IgE에 항원이 교 차 결합하면 비만세포가 활성화되어 알레르기 면역반응이 시작된다.⁵⁾ FcεRI 수용체는 \(\alpha\)-subunit, β-subunit 및 2개의  \(\gamma\)-subunit로 구성된다.^{3, 5)} IgE가 결합하는 부위는  \(\alpha\)  subunit이고, 세포내 신호전달에 관여하는 것은 β-subunit와  \(\gamma\)-subunit이다.⁶⁾ β-Subunit과  \(\gamma\) -subunit에는 immune receptor- based activation motif(ITAM)이 존재하며 활성화된 Lyn이 이 부분을 인산화한다. 이어서 인산화된 ITAM에 Syk kinase가 결합하여 Syk은 활성화 상태로 전환되어 linker for activation of T cells(LAT) 그리고 phospholipase C \(\gamma\) 를 포함 한 하위 신호전달 단백질들의 활성화를 유도한다. 이후 증가된 Ca²⁺ influx는 전사 인자를 활성화시키arachidonic acid metabolism을 자극하여 eicosanoid 유도체들을 만들어 분비하게 된다.^{7, 8)} 또한 하위 신호전달 단백질인 mitogen- activated protein kinases(MAPK)에는 Erk1/2(extracellular signal-regulated kinase), JNK(c-Jun N-terminal kinase) 그리고 p38이 있으며 비만세포에서 염증성 cytokine의 분비에 중요한 역할을 담당한다. 대표적으로 이 신호들은 전사 인자 를 자극하여 TNF-\(\alpha\) 및 IL-4 등의 pro-inflammatory cytokine 생산 및 분비를 유도하여 탈과립과 더불어 알레르기 반응을 증가시킨다.⁹⁾

자주쓴풀(Swertia pseudochinensis Hara)은 용담과(Gen- tianaceae) 식물로 이름에서 알 수 있듯이 쓴맛이 강한 풀이다. 한국, 일본 및 중국에서 자생하는 이 식물은 우리나라 곳곳에 많이 서식한다. 예로부터 자주쓴풀을 비롯한 쓴풀은 해독 효능이 있다고 알려져 염증 개선 효과가 있고, 고미 건 위약으로 식욕부진과 소화불량에도 사용되었다.¹⁰⁾ 최근에는 비만 마우스에서 자주쓴풀을 이용한 PPAR-\(\alpha\) 조절에 의한 지방간 치료 효과가 보고되었다.¹¹⁾ 그러나 자주쓴풀의 비만 세포에서 IgE 매개 알레르기 억제 효과나 그 기전에 대한 연구는 아직 보고된 바 없다. 따라서 본 연구에서는 자주쓴 풀의 비만 세포 활성화 억제 효과 및 그 기전을 알아보고 동물모델에서 알레르기 반응 억제 효과를 알아보고자 하였다.

재료 및 방법

실험재료

Dinitrophenol(DNP)-specific monoclonal IgE, DNP-bovine serum albumin(BSA), cetirizine, formamide 및 Arabic gum은 Sigma(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. Minimal Essential Medium(MEM)및 RPMI-1640 배양액은 GIBCO(Rockville, MD, USA)에서 구입하였다. PP2(4-Amino-5-(4-chlorophenyl)-7-(dimethylethyl)pyrazolo [3, 4-d] pyrimidine)는 Calbiochem(La Jolla, CA, USA)에서 구입하였다. Phospho(pY)-Syk, Phospho(pY)-LAT, LAT 및 Phospho-tyrosine(pY) 검출을 위한 각각의 항체들은 Cell Signaling Technology(Danvers, MA, USA)에서 구입하였다. Phospho-Akt, phospho-Erk1/2, phosphor-JNK, phospho-p38 및 actin 검출을 위한 항체는 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였다. 면역침강을 위한 protein A-agarose는 Roche에서 구입하였다. 나머지 시약은 시판되는 특급 시약을 구입하여 사용하였다.

실험동물

마우스는 대한바이오링크에서 생후 4주령 수컷 Balb/c 마우스를 구입하였으며 동물실에서 최소 1주일의 적응기간을 가진 후 실험에 사용하였다. 동물실의 온도는 22±1o C, 습도는 55±10%로 유지하였고 낮과 밤의 주기는 12 시간으로 하였다. 사료와 물은 자유롭게 먹도록 제공하였다. 동물실험은 군당 최소 5마리의 마우스를 사용하였다. 동물실험은 공동연구 기관인 건국대학교 동물실험센터에서 동물실험윤리 규정에 따라 승인 후 수행하였다(승인번호 KU20129).

자주쓴풀의 메탄올 추출물

우리는 20종 이상의 자생식물의 메탄올 추출물들을 한국식물추출물은행(충정북도 청주시)에서 구입하여 알레르기 반응 억제효과를 1 차로 측정하고 가장 효과가 뛰어난 자주쓴풀 메탄올추출물(SPE)을 선정하여 추가적인 실험을 진행하였다. 본 연구에 사용된 시료는 자주쓴풀(Swertia pseudochinensis Hara, Gentianaceae)을 채취하여 건조한 전초를 이용해 메탄올 추출물을 제조되었으며 그 표본 시료는 한국식물추출물은행에 보관되어 있다(Code no. 022-072). 한국 식물추출물은행에서는 식물 및 생약학 분류 분야의 여러 전문가들이 이 식물을 복수로 정확하게 동정 후 추출물 제조에 사용하였다. SPE를 dimethyl sulfoxide(DMSO)에 녹여 실험 조건 별로 희석한 후 세포실험에 사용하였다. 알레르기 질환 동물실험에서는 SPE를 5% Arabic gum 용액에 현탁하여 마우스에 경구 투여하였다.

비만세포의 분리 및 배양

RBL(rat basophilic leukemia)- 2H3는 200mM L-glutamine, 10, 000units/ml penicillin/ streptomycin, 15% fetal bovine serum(FBS)을 포함한 minimum essential medium(MEM) 배양액을 사용하여 CO₂ incubator(5% CO₂, 37°C)에서 배양하였고 2~3일 간격으로 계대 배양하였다. Bone marrow-derived mast cells(BMMCs) 분리 및 배양을 위해 약 5주령의 수컷 Balb/c 마우스로부터 채취한 골수세포를 100μM non-essential amino acid solution, 100μg/ml streptomycin, 10% FBS을 포함한 RPMI 1640에 10 ng/ml murine recombinant IL-3을 첨가한 배양액을 사용하여 4주 이상 배양하였다. FACS로 분석하여 98% 이상 BMMC로 분화된 것을 확인한 후 실험에 사용하였다.

비만세포의 탈과립 측정

우리는 비만세포를 24 well plate (1.8×10⁵ cells/well)에 분주하고, DNP 특이적 IgE 20ng/ml가 포함된 MEM 배지에서 최소 12시간 이상 배양하여 비만세포 표면수용체에 IgE를 부착하여 감작시켰다. 항원 자극에 의한 비만세포의 탈과립 정도를 측정하기 위해 세포 외부로 분비된 β-hexosaminidase를 정량하였다. RBL-2H3 세포는 PIPES완충용액(25mM PIPES, pH 7.2, 159mM NaCl, 5mM KCl, 0.4mM MgCl₂, 1mM CaCl₂, 5.6mM glucose, 0.1% fatty acid-free fraction V bovine serum)을 사용하였고 BMMCs는 Tyrode 완충용액(20mM HEPES pH7.4, 135mM NaCl, 5mM KCl, 5.6mM glucose, 1.8mM CaCl₂, 1mM MgCl₂, 0.05% BSA)을 사용하여 실험하였다. 완충용액으로 2회 세척한 비만세포에 완충용액을 사용하여 희석된 SPE를 30분간 처리하였다. 이어서 각 well에 25 ng/ml 항원(DNP-BSA)을 첨가하여 15분 동안 자극한 후, 얼음 위에서 5분간 두어 자극을 종료시켰다. 탈과립에 의해 비만 세포 밖으로 분비된 β-hexosaminidase가 존재하는 상층액을 E-tube에 떼어내고 plate에 남아있는 세포는 0.1% triton X- 100으로 파쇄시켰다. 상층액과 파쇄된 시료를 96 well plate에 옮기고 각각 1mM p-nitrophenyl-N-acetyl-β-d-glucosaminide 용액을 30μl씩 첨가한 후 37°C에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후 0.1M carbonate 완충용액을 넣어 반응을 종료하고 405nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 탈과립은 비만 세포의 총 β-hexosaminidase 활성대비 분비된 β-hexosaminidase에 대한 비율로 표시한다.

Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)

우리는 항원으로 자극시킨 RBL-2H3 세포(5× 10⁶ cells/well)에 trizol reagent를 처리하여 세포를 파쇄하였다. 피펫으로 cell lysate을 모은 후 chloroform을 200μl 첨가하였다. 그 세포 파쇄액을 15, 000rpm와 4°C에서 10분간 원심분리하여 얻은 상층액을 isopropanol과 1:1 혼합 후, 한 시간 동안 -20°C에서 반응시켰다. 15, 000 rpm에서 10분간 원심분리하고 에탄올로 세척한 후, RNA pellets을 diethyl pyrocarbonate-water 50μl에 녹여서 total RNA를 얻었다. PCR은 92°C(30초), 58°C(30초) 및 72°C(40초)를 총 30회 반복하여 실행하였다. TNF- mRNA에 대한 primer는 forward 5'-CACCACGCTCTTCTGTCTACTGAAC-3' 그리고 reverse 5'-CCGGACT CCGTGATGTCTAAGTACT-3'를 사용하였다. IL-4 mRNA에 대한 primer는 forward 5'-CCGATATGG TGTAATTTCCTATGCTG-3' 및 reverse 5'-TTGTGAGCG TGGACTCATTC-3'을 사용하였고 GAPDH mRNA에 대한 primer는 forward 5'-GTGGAGTCTACTGGCGTCTTC-3' 그리고 reverse 5'-CCAAGGCTGTGGGCAAG GTCA-3'를 사용하여 실험하였다.

Immunoprecipitation 실험

우리는 비만세포를 6 well plate에서 25ng/ml 항원과 7분간 반응시킨 후 얼음 위에서 반응을 정지시켰다. 세포를 PBS(ice cold)로 2회 세척하고, lysis buffer(ice cold, 20mM HEPES, pH 7.5, 150mM NaCl, 1% Nonidet p-40, 10% glycerol, 60mM octyl b- glucoside, 10mM NaF, 1mM Na₃VO₄, 1mM phenyl- methylsulphonyl fluoride, 2.5mM nitrophenylphosphate, 0.7mg/ml pepstatin, protease inhibitor cocktail tablet)를 넣고 30분 동안 얼음 위에서 세포를 파쇄하였다. 15, 000 rpm, 4°C에서 15분간 원심분리를 한 후 상층액을 분리하였다. 상층액에 특이적 항체를 넣고 4°C에서 3시간 이상 반응시켰다. Protein A-agarose 50μl를 첨가하고 4°C에서 3시간 방치한 후, 세척완충액으로 5회 반복하여 세척하여 비특이적인 면역침강을 최소화하였다. Immunoblotting 분석을 위해 2× sample buffer 50μl를 첨가하여 100°C, 5분간 끓인 후 5분간 얼음에 방치하여 반응을 멈추었다. 15, 000rpm에서 1분간 원심분리 후 단백질 시료가 포함된 상층액을 분리하여 Immunoblotting 분석을 실시하였다.

Immunoblotting 분석

비만세포를 6well plate에서 항원(25ng/ml)으로 7분간 자극시킨 후 얼음 위에서 반응을 정지시켰다. 세포를 차가운 PBS로 2회 세척하고, lysis buffer (ice cold, 20mM HEPES, pH 7.5, 150mM NaCl, 1% Nonidet p-40, 10% glycerol, 60mM octyl b-glucoside, 10 mM NaF, 1mM Na₃VO₄, 1mM phenylmethylsulphonyl fluoride, 2.5mM nitrophenyl phosphate, 0.7mg/ml pepstatin, protease inhibitor cocktail tablet)를 처리하여 세포를 파쇄하였다. 이 후 얼음 위에서 30분간 방치하고, 15, 000 rpm, 4°C 에서 15분간 원심분리하여 상층액을 분리하였다. 95℃에서 5분간 2× Laemmli buffer로 단백질을 변성시키고 SDS- PAGE에서 단백질 분자량 별로 분리한 후 PVDF membrane에 transfer하였다. 5% skim milk를 포함한 TBS-T buffer (10mM Tris-HCl, pH 7.5, 150mM NaCl, 0.05% Tween20)로 blocking을 진행한 후 1:1000으로 희석한 1차 항체를 처리하여 4°C에서 하루 밤 동안 방치하였다. Membrane을 TBS-T완충액으로 5분간 3회 세척하고, 1:2000으로 희석한 horseradish peroxidase(HRP)-coupled 2차 항체를 처리하여 1시간 동안 반응시켰다. 이후 membrane을 TBS-T완충액으로 5분간 5회 세척한 후 chemiluminescence 방법으로 단백질을 검출하였다.

Passive Cutaneous Anaphylaxis(PCA) 동물모델

우리는 수동피부감작 알레르기(PCA) 동물 모델을 만들기 위해 Balb/c 마우스의 한쪽 귀에 IgE 0.5μg을 피내주사하고 12시간 동안 방치하여 비만세포가 IgE에 충분히 감작되도록 하였다. 항원으로 자극하기 1시간 전에 SPE 혹은 표준약물(cetirizine, 10mg/kg)을 실험 농도에 맞게 경구투여하였다. 한시간 경과 후 항원인 DNP-BSA 5mg/ml와 Evans blue 1mg/ml가 혼합된 용액 250μl를 꼬리정맥에 주사하였다. 한 시간 후 마우스를 안락사시키고, 항원 자극에의해 파랗게 염색된 귀를 잘라서 formamide에 넣어 12시간 동안 63°C에서 Evans blue 색소를 추출하였다. 마지막 과정으로 그 추출된 Evans blue를 620 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 삼출된 색소를 정량화하였다.

결과

자주쓴풀메탄올추출물(SPE)의 RBL-2H3세포와 BMMC 에서 탈과립 억제 효과 및 가역성

우리는 알레르기 유발 단계에서 중요한 역할을 담당하는 비만세포의 항원 자극에 의한 탈과립은 β-hexosaminidase를 측정 지표로 사용하여 실험하였다. 그 결과 SPE는 비만세포인 RBL-2H3세포와 BMMC에서 농도 의존적으로 탈과립을 억제하는 것을 관찰하였다. 항원만 처리한 RBL-2H3 세포에서는 약 35% 정도 탈과립이 일어난 반면, SPE를 처리한 세포에서는 농도의존적으로 탈과립이 억제되는 것을 관찰하였다(Fig. 1A). 항원으로 자극한 BMMC에서도 SPE 처리에 의한 탈과립의 감소 경향이 비슷하게 나타났다(Fig. 1B). 추가적으로 SPE에 의한 항원 자극에 의한 비만세포의 탈과립 억제 효과가 가역적인지 알아보기 위해 RBL-2H3 cell을 SPE(100μg/ml)로 1시간 동안 처리 후 완충액으로 3회 세척하였다. 세척된 RBL-2H3 cell을 항원으로 자극하여 탈과립을 측정하였다. 결과로 세척한 RBL-2H3 cell의 탈과립은 대조군과 유사하게 회복된 것을 확인하였다(Fig. 1C). 이 결과를 통해 우리는 SPE의 비만세포에 대한 탈과립 억제효과는 가역적임을 알 수 있었다.

Fig. 1. Swertia pseudochinensis extract (SPE) shows a revers- ible inhibitory effect on degranulation in antigen (Ag)-stimu- lated mast cells. RBL-2H3 cells (A) or BMMCs (B) were primed by 25 ng/ml DNP-specific IgE, then stimulated with 25 ng/ml Ag for 15 min. The degranulation was determined by measuring the activity of β-hexosaminidase as described in the section for “Materials and Methods”. (C) Reversibility of the effect of SPE on mast cells. After treating RBL-2H3 cells with SPE for 1hr, the cells were washed five consecutive times using PIPES buffer and then degranulation was mea- sured as described in the section for “Materials and Methods”. The values represent the mean ± S.E.M. from three indepen- dent experiments. *p<0.05 and **p<0.01. PP2 is a typical Src- family kinase inhibitor.

자주쓴풀메탄올추출물(SPE)의 비만세포에서 TNF-\(\alpha\)  및 IL-4 발현 억제 효과

TNF-\(\alpha\) 와 IL-4는 비만세포에서 알레르기 반응을 유발하는 중요 염증성 사이토카인이다. 항원으로 자극된 비만세포에서는 과립내 저장 되어있는 일부 사이토카인 방출과 함께 활성화된 전사인자들이 새로운 사이토 카인 생성 및 분비를 유도한다. 이에 SPE가 pro-inflammatory cytokine인 TNF-와 IL-4 발현을 억제하는지 살펴보았다. IgE로 감작된 비만세포에 항원을 처리하였을 때 TNF- 및 IL-4 발현량을 RT-PCR을 통해 확인하였다. SPE는 RBL- 2H3 세포에서 사이토카인 발현을 농도의존적으로 감소시켰 다(Fig. 2). 이러한 결과를 통해 우리는 SPE가 항원 자극에 의한 비만세포에서의 탈과립 뿐 아니라 사이토카인의 발현도 억제한다는 것을 알 수 있었다.

Fig. 2. SPE suppresses the expression of inflammatory cyto- kines, TNF- and IL-4, in antigen (Ag)-stimulated RBL-2H3 cells. (A) IgE-primed RBL-2H3 cells were stimulated by 25 ng/ml antigen with or without SPE. Total RNA was extracted and analyzed by RT-PCR as described in the section for “Materials and Methods”. (B) The band density was measured using Multi gauge V3.1 software (FUJIFILM, Inc., Japan). The values are shown as the mean ± S.E.M. from three inde- pendent experiments. *p<0.05 and **p<0.01. PP2 is a typical Src-family kinase inhibitor.

자주쓴풀메탄올추출물(SPE)의 비만세포에서 신호전달 억제 효과

알레르기 유발 항원에 노출되어 생성된 IgE는 비만세포의 세포막 수용체인 FcεRI에 부착되어 복합체 상태로 존재한다. 다시 유입된 항원이 IgE에 결합하면 FcεRI를 통한 신호전달경로의 활성화로 비만세포는 다양한 알레르기 유발 매개체를 분비한다. FcεRI 수용체에 항원이 결합 하게 되면 Lyn 및 Fyn 활성화로 이어지고 세포질에 존재하는 Syk은 인산화된 FcεRI 수용체의 ITAM에 결합하여 활성화 된다. 이 활성화된 Syk은 LAT를 인산화 시킨다. 여기에 PLC  \(\gamma\) 가 결합하여 활활성화되고 PLC  \(\gamma\) 은 phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate(PIP₂)를 가수분해하여 이차신호 전달자인 inositol 1, 4, 5-trisphosphate(IP₃)와 diacylglycerol(DAG)을 생산한다. 이러한 과정을 거쳐 사이토카인 및 다양한 단백질 생산과 분비에 관여하는 신호전달 경로인 MAP kinase(ERK, p38, JNK)들도 활성화된다.⁴⁾ 우리는 SPE의 비만 세포 억제기전을 알아보기 위해 항원 자극에 의해 활성화되는 다양한 신호전달단백질에 대한 SPE의 억제 효과를 측정하였다. 우리는 RBL-2H3세포에서 항원 자극에 의해 활성화되는 Syk, LAT 그리고 PLC  \(\gamma\)  등의 인산화가 SPE에 의해서 농도 의존적으로 감소되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 3). 추가로 사이토카인 등의 생성에 관여하는 것으로 알려진 MAP kinase인 ERK, p38 및 JNK의 인산화도 농도의존적으로 억제되는 것을 관찰 하였다(Fig. 3). 더 나아가, 골수세포로부터 분화시킨 비만세포인 BMMC에서도 RBL-2H3와 마찬가지로, 초기 신호전달에 관여하는 Syk, LAT 그리고 PLC의 인산화가 SPE에 의해 억제됨을 확인할 수 있었다(Fig. 3, lower panel). 이 결과로 SPE가 Syk 및 MAPK 활성화를 억제함으로써 비만 세포 탈과립 및 사이토카인 발현을 억제했음을 알 수 있었다.

Fig. 3. SPE impedes the activation of Syk and its downstream signaling molecules in mast cells. The IgE-primed RBL-2H3 cells (upper part) or BMMCs (lower part) were treated with 25 ng/ml antigen (Ag), with or without SPE for 7 min. Immu- noblot analysis was preformed using the whole cell lysates and specific antibodies for each signaling protein. Phosphory- lated forms of Syk, LAT, PLC, Akt, and MAPK (ERK, p38, JNK) were measured in RBL-2H3 cells or BMMCs as described in the section for “Materials and Methods”. Repre- sented images are shown from three independent experiments. PP2 is a typical Src-family kinase inhibitor.

동물모델에서 자주쓴풀메탄올추출물(SPE)의 알레르기 억제 효과

Passive Cutaneous Anaphylaxis(PCA)는 IgE 및 비만 세포 매개 알레르기 반응을 관찰할 수 있는 전형적인 동물모델이다. 우리는 Balb/c 마우스를 이용하여 SPE의 피부병리학적 분석 및 알레르기 억제효과를 알아보고자 하였다. Balb/c 마우스의 귀에 IgE를 국소적으로 피내 주사하여 비만세포를 감작시킨 후 Evans blue 색소와 항원을 동시에 꼬리 정맥 주사하여 알레르기 질환 동물 모델을 만들었다. IgE로 감작 후 항원을 투여하기 1시간 전에 SPE와 표준 약물(cetirizine)을 경구투여 한 후 알레르기 증상 억제 정도를 관찰하였다. 귀 조직을 분리하여 Evan blue를 추출 후 620nm 파장에서 정량한 결과 SPE의 농도가 증가함에 따라 귀 조직으로의 Evans blue의 삼출이 억제되었다(Fig. 4). 추가적으로 귀 조직에 존재하는 비만세포를 조직학적으로 관찰한 결과 SPE는 귀 조직에서 항원 자극에 의한 탈과립이 억제된 것을 알 수 있었다(Fig. 5). 이는 비만세포가 활성화될 때 방출되는 histamine과 serotonin등이 인근 혈관 투과성을 증가시켜 Evans blue가 혈관으로부터 귀 조직으로 삼출되며 SPE 투여 따라 Evans blue 삼출의 감소는 SPE가 귀에 분포하는 비만세포의 탈과립을 억제하였음을 보여주었다. 이러한 결과를 바탕으로 우리는 SPE가 in vivo에서도 IgE 매개 알레르기 반응의 억제 효과가 있음을 관찰할 수 있었다.

Fig. 4. SPE inhibits passive cutaneous anaphylaxis (PCA) in mice. DNP-specific IgE (0.5μg) was intradermally injected into Balb/c mouse ear. After 24 h, 250 μg antigen (Ag) mixed with 4% Evans blue was intravenously injected. To measure the inhibitory effect of SPE on PCA, the mouse was orally administered with SPE (100-1000 mg/kg) 1 h prior to an anti- gen (Ag) injection. The amount of exuded Evans blue was quantitated as described in the section for “Materials and Methods”. (A) The representative images are shown. (B) Val- ues indicate the mean ± S.E.M. from three independent exper- iments, each with 5 mice. *p<0.05 and **p<0.01. Cetirizine (CZ, 10 mg/kg) was used as a typical anti-histamine reference drug.

Fig. 5. SPE suppresses antigen-stimulated degranulation of mast cells in ear. After the PCA experiment in mice, the ear was removed. Histology for ear tissues was performed as described in the section for “Materials and Methods”. (A) Representative images are shown. (B) The ratio of degranu- lated mast cells (black bar) to the total number of mast cells (whole bar) in ears are expressed as the mean ± S.E.M. from three independent experiments. *p<0.01. Cetirizine (CZ, 10mg/ kg) was used as a typical anti-histamine reference drug.

Fig. 6. Schematic illustration of how SPE inhibits mast cell activation. In antigen-stimulated mast cells, SPE inhibits the activation of Syk and Syk-dependent signaling proteins, which leads to the inhibition of degranulation and cytokine secretion.

고찰

알레르기 질환의 유병률은 전세계적으로 증가하고 있다.¹²⁾ 알레르기 질환은 예방과 완치가 어려울 뿐 더러, 삶의 질에 부정적인 영향을 미친다. 알레르기에 의한 수면장애, 알레르기 비염으로 인한 집중력 저하 그리고 아토피성 피부염으로 인한 자신감 결여 등 생활에 있어 불편함이 큰 것으로 조사되고 있다.^2.12) 하지만 현재까지 대부분의 알레르기 질환은 근본적인 치료가 어려워 증상완화에 초점을 두고 있다. 이러한 이유로 보다 근본적인 기전 위주 연구를 통한 새로운 알레르기 질환 치료제 개발이 시급한 실정이다. 따라서 우리나라뿐 아니라 다른 많은 아시아 국가에서는 식물 추출물을 이용한 질병치료 연구가 활발히 진행되고 있다. 본 연구에서는 SPE를 이용하여 비만세포의 알레르기성 매개 물질 생성 및 분비를 억제하는 것을 확인하고 그 기전을 밝혀내어 보고하고자 하였다.

항원에 자극되어 활성화된 비만세포는 다양한 염증 매개 물질의 발현 및 탈과립을 통한 세포 외부로의 방출하며 이는 알레르기 반응의 원인이 된다. 수초에서 수분 이내로 분비되는 histamine, 단백분해효소 및 proteoglycan 등은 preformed 매개 물질이다. 아라키돈산으로 부터 합성된 eicosanoids와 TNF-\(\alpha\) 및 IL-4 등의 pro-inflammatory 사이토카인들은 비만세포의 활성화로 인해 세포 내에서 합성되어 분비된다.^{3, 4)} 본 연구에서 SPE는 항원 자극에 의해 유도되는 RBL-2H3 세포 및 BMMC에서의 탈과립을 농도 의존적으로 억제하였다(Fig. 1). 또한 SPE를 처리한 RBL-2H3세포내에서 주요 염증성 사이토카인인 TNF-\(\alpha\)와 IL-4 발현을 억제하였다(Fig. 2). 이러한 결과는 SPE가 비만세포를 억제하여 알레르기 반응을 억제할 수 있음을 의미하였다.

SPE가 항원 자극에 의한 비만세포의 탈과립 및 염증성 사이토카인의 생산을 억제한다는 것은 매우 흥미로운 결과이다. 따라서 다음으로 우리는 SPE가 어떻게 비만세포를 억제하는지에 대한 기전 연구를 진행하였다. 비만세포의 FcεRI– IgE 복합체에 항원이 교차 결합하면 Src-family kinase인 Lyn과 Fyn이 활성화되고 세포내 신호전달이 시작된다. Fyn은 Gab2와 PI3K활성화를 유도하고 Lyn은 FcεRI의 β-subunit와    \(\gamma\) -subunit에 위치하는 ITAM motifs를 인산화하여 세포질 내 Syk kinase을 인산화된 라이신 아미노산 잔기에 부착하게 하여 Syk의 활성화를 유도한다.¹³⁾ 활성화된 Syk은 LAT, PLC   \(\gamma\)  그리고 PI3K 등 기타 하위 신호전달 단백질들의 활성화로 이어진다. PLC   \(\gamma\) 의 활성화에 따른 세포질내 Ca²⁺ 농도 증가는 탈과립 및 염증 매개 물질 분비를 유도한다.^{14, 15)} 본 연구에서 RBL-2H3 세포와 BMMC로 실험한 결과, SPE는 농도의존적으로 항원 자극에 의한 Syk의 인산화를 억제 하였고, 이에 따라 LAT 인산화도 억제시킴으로써 수용체에 근접해 있는 상위신호전달 과정에 관여함을 알 수 있었다 (Fig. 3). 하지만 현재 연구에서는 Syk의 상위 신호전달단백 질인 Lyn과 Fyn을 억제하는지 Syk의 활성화를 직접적으로 억제하는지에 대한 연구는 앞으로의 과제로 남겨두었다.

비만세포가 항원에 의해 활성화되면 탈과립 이외에 pro- inflammatory 사이토카인 발현으로도 이어진다. 앞에서 언급한 바와 같이 항원에 의한 Syk과 LAT 등 상위 신호전달에 이어 하위 신호전달 단백질인 MAP Kinase가 활성화된다. 세포신호전달경로에서 전형적인 세가지의 MAP Kinase 인 ERK1/2, p38 및 JNK는 전사인자를 조절하여 사이토카인 발현을 유도한다. ERK1/2는 비만세포에서 TNF-\(\alpha\), IL- 5, IL-3 및 IL-13 생성에 필수적인 MAP Kinase이며, p38은 IL-4 생성에 중요한 MAP Kinase이다.^{16, 17)} 우리는 SPE가 항원으로 자극된 RBL-2H3 세포에서 농도의존적으로 TNF-\(\alpha\)와 IL-4 발현을 억제함을 관찰하였다(Fig. 2). 이것은 상위 신호전달자 Syk의 인산화가 억제됨에 따라 하위 신호전달자인 ERK1/2, p38 및 JNK 인산화가 저해된 결과임을 추론할 수 있었다(Fig. 4). 이러한 결과는 SPE는 비만세포에서 탈과립뿐 아니라 염증성 사이토카인의 생산을 억제하여 비 만세포가 유도하는 즉시성 알레르기 반응 뿐 아니라 후기 알레르기 반응도 억제할 수 있음을 시사하였다.

보고에 의하면 같은 속의 쓴풀 추출물은 iridoid glucoside, flavonoid 그리고 xanthone 등을 포함한다.¹⁸⁾ 추가적으로 swertiamarin, sweroside, gentiopicroside, mangiferin, isoorientin 그리고 isovitexin 성분들이 최근의 연구에 의해 보고되었다.¹⁹⁾ 이 보고에 의하면 swertiamarin은 진정효과로서 잘 알려져 있는데 자주쓴풀에 가장 많이 함유된 주요 성분이었다.²⁰⁾ 또한 이 식물에 포함되어 있는 mangiferin은 세균 증식억제 작용, 항암작용 및 면역조절작용이 있는 것으로 알려져 있고, ^{21, 22)} Isoorientin은 염증 억제 효과를 가지는 것으로 보고되고 있다.²³⁾ 특히 자주쓴풀이 함유하고 있는 다양한 flavonoide들은 알레르기 억제효과가 많이 보고 되었다.²⁴⁾ 이러한 보고를 고려할 때 이 연구에서 SPE의 알레르기 억제 효과를 나타내는 SPE가 함유하는 flavonoid들이 그 효과를 나타낼 수 있음을 추측하게 했다. 하지만 우리는 SPE의 알레르기 반응 억제를 위해 정확한 유효성분을 밝히기 위해 추가적인 성분 분리 실험을 진행하고 있다.

비만세포에서의 SPE의 효과에 근거하여 우리는 동물모델 에서의 알레르기 반응 효과를 실험하고자 IgE 매개성 즉시성 알레르기 동물모델인 PCA 알레르기 동물모델을 제작하여 사용하였다. 이 모델은 가장 일반적으로 사용되는 제1형 알레르기 동물모델로 잘 알려져 있다. 우리의 예상대로 SPE는 동물모델에서도 농도의존적으로 알레르기 반응을 효과적으로 억제하였다(Fig. 4). 추가적인 조직학적 분석 실험에서 우리는 SPE가 귀 조직내 비만세포의 탈과립을 억제하는 결과를 얻었다(Fig. 5). 이러한 결과는 SPE가 in vitro 뿐 아니라 in vivo에서도 비만세포의 탈과립을 억제한다는 것을 의미하였다. 흥미롭게도 SPE의 저농도 처리군(100mg/kg)에서 유의성 있는 알레르기 억제 효과를 확인하였으며 이는 앞으로 의약품이나 건강 기능성 식품으로의 개발 가능성이 높은 것을 시사하였다.

결론

본 연구에서 우리는 SPE의 비만 세포 활성화에 대한 억제 및 기전을 세포 수준에서 연구하였고, 추가적으로 알레르기 동물모델에서 SPE의 알레르기 반응 억제 효과를 관찰하였다. SPE는 항원 자극에 의해 활성화된 비만세포를 가역적으로 억제하였으며 SPE는 동물모델에서 농도의존적으로 알레르기 반응을 억제하였다. 우리는 SPE의 알레르기 억제 기전으로 비만세포에서 항원 자극에 의한 Syk kinase 활성화 및 Syk 의존성 하위신호전달 단백질을 억제하는 것을 규명하였다. 결과를 종합할 때 우리는 이 보고에서 SPE의 IgE 매개성 알레르기 질환의 치료제나 기능성 식품으로 개발 가능성을 제시하고자 한다.