Evaluation of Clinical Usefulness of Herbal Mixture HO-Series for Improving Hangover

복합생약 HO-Series의 숙취개선 임상적 유용성 평가

Abstract

The purpose of this study is to investigate the hangover relieving effect of HO-series. HO-S1 is an herbal mixture, which consists of extracts from Flower of Pueraria lobata Ohwi, Glycyrrhiza glabra Linné, Fruit of Lycium chinense Miller, Poria cocos Wolf, Acanthopanax sessiliflorum Seeman, Scutellaria baicalensis Georgi, Atractylodes lancea De Candlle and Zingiber officinale Roscoe. HO-S2 is a candidate that has been performed to ultra filtration based on HO-S1. HO-S3 is a mixture of amino acids and vitamins based on HO-S2. HO-01 is the final beverage base produced based on HO-S3. The antioxidant activity of HO-series was similar to that of vitamin C or trolox. The production of t-BHP induced reactive oxygen species(ROS) was significantly blocked in the presence of HO-series. In vivo study, AUC of alcohol and acetaldehyde concentrations in HO-S2 and HO-S3 treated groups significantly decreased. Hepatic alcohol dehydrogenase(ADH) and acetaldehyde dehydrogenase(ALDH) activity were significantly higher in HO-S2 and HO-S3 treated groups. And 2E1 activity and glutathione were significantly elevated, while the malondialdehyde level was not significantly in liver tissue. After alcohol exposure, the sensitivity scores of blood alcohol and acetaldehyde concentration and hangover symptoms were significantly decreased in the HO-01 intake group compared with the non-intake group. ALDH activity was significantly increased in the HO-01 intake group. HO-series have antioxidant activity and a protective effect from ROS. HO-S2, HO-S3 and HO-01 are potentially highly beneficial in relieving hangover, as it scavenges reactive free radicals and boosts the endogenous antioxidant system.

한국의 음주문화는 서구와는 다른 형태를 나타내고 있다. 우리나라의 음주문화는 알코올을 즐기는 것과 더불어 사회적인 관계를 풀어내는 수단으로 사용된다.¹⁾ ‘세계알코올대사전’에 “한국인은 술 마시기를 매우 좋아하며, 타인의 음주행위에 대해 매우 관대하다”고 기술되어 있다. 또한 당시 서구인의 시각에서 본 우리나라 사람들의 음주와 폭음실태가 비교적 자세히 묘사되어있다. 이러한 음주문화는 알코올의 과다 섭취로 이어져 매년 알코올에 대한 폐해로 막대한 비용을 지출하고 있다. 알코올 섭취로 인한 숙취해소 관련 음료시장은 1992년 제일제당의 컨디션 출시 이후 성장을 해왔다. 현재는 주요 소재뿐만 아니라 음료가 주를 이루던 숙취관련 시장에 정제 또는 캡슐 형태의 숙취해소 관련 제품의 개발로 시장은 다양화되고 있다.²⁾ 다양한 형태의 숙취관련 제품이 출시되고 있으나 이러한 제품은 식품의약품안 전처(식약처)에서 일반식품으로 관리하고 있으며 숙취해소 효과에 대한 기능성을 인증을 받은 예는 아직 없다. 식약처에서 2019년 기능성 표시식품의 기능성 및 안전성 확보와 소비자 선택권을 보장하고 예방을 통한 식품산업 활성화를 이루고자 기능성 표시방법을 마련하였다.³⁾ 식품에 과학적 근거 없이도 무분별하게 숙취해소라는 표현을 쓸 수 없도록 기존 숙취 해소 관련 제품의 경우는 5년간의 유예기간을 두고 과학적 근거가 있는 경우에만 사용하도록 개선하였다.

숙취해소 소재를 발굴하기 위한 과학적 노력은 대부분 혈중 알코올 농도 저하나 알코올 대사 관련 효소인 알코올탈수소효소(alchol dehydrogenase, ADH)와 아세트알데히드탈수소효소(acetaldehyde dehydrogenase, ALDH)활성 촉진에 초점이 맞춰져 있다.^{4, 5)} 알코올 대사와 관련된 내용에 비해 실제 음주 후 느끼는 갈증, 졸음, 두통, 어지러움, 구토, 무력감, 복통, 등 임상적 숙취증상 개선 검증은 상대적으로 미미한 상태이다. 식약처의 조치에 따라 앞으로 숙취해소 소재 연구 및 관련 제품의 개발에 있어 유효성에 대한 체계적이고 과학적 근거 중심의 효능 검증이 필수적이다.

본 연구에서는 한방에서는 술의 독을 없애주는 소주독제(消酒毒濟) 약재로 명의별록(名医別錄)에 수록된 갈화(Flower of Pueraria lobata Ohwi)를 중심으로, ^{5, 6)} 감초(Glycyrrhiza glabra L inné), 구기자(Fruit of Lycium chinense Miller), 복령(Poria cocos Wolf), 가시오가피(Acanthopanax sessiliflorum Seeman), 황금(Scutellaria baicalensis Georgi), 창출(Atractylodes lancea De Candlle) 및 건강(Zingiber officinale Roscoe)으로 구성된 복합소재를 이용하여 숙취해소 제품개발을 위한 전략적 연구를 진행하고자 한다. 제품의 최적화를 위하여 복합소재 추출물(HO-S1), 한외여과(ultra filtration)추출물(HO-S2) 및 한외여과 후 비타민과 아미노산이 혼합된 HO-S3의 효과를 시험관내와 동물 실험을 통해 비교분석하고, 음료제품의 형태인 HO-01에 대한 알코올 대사 관련 지표 및 숙취 증상 개선에 대한 인체적용시험을 수행하여 숙취 관련 제품 개발뿐만 아니라 숙취관련 제품 개발의 가이드라인을 제시하고자 하였다.

재료 및 방법

실험재료

실험에 사용한 갈화(Flower of P. lobata), 감초(G. labra), 구기자(Fruit of L. chinense), 복령(P. cocos), 가시오가피(A. senticosus), 황금(S. baicalensis), 창출(A.lancea) 및 건강(Z. officinale)은 한풍제약에서 2019년 1월에 구입하였다. 본 실험에 사용한 8종의 천연물은 한풍제약의 조형권 박사가 대한민국약전 및 대한민국약전 외 한약(생약) 규격집의 시험법에 따라 검증 후, 각 생약 표본은 한풍제약에서 보관 중이다(HP-19-01).

후보소재 HO-Series 중, HO-S1은 갈화, 감초, 구기자, 복령, 가시오가피, 황금, 창출, 건강을 6:3:3:2:2:2:1:1의 비율로 200 g을 달아 10배의 물을 가하여 90~100℃로 3시간 2회 추출 후 여과하고 60oC 이하로 감압 농축하여 약 55±5 brix의 연조엑스 약 120±10 g을 얻었다. HO-S2는 HO-S1 추출액을 한외여과(ultra filtration)한 후 감압농축하여 약 55±5brix의 연조엑스 약 87±5 g을 얻었고, HO-S3는 HO-S2을 100 g 기준으로 glycine, threonine, alanine, valine, methionine, Vitamin B1, B2, B3을 15:10:10:5:4:0.04:0.04:0.04의 비율로 혼합하여 제조하였다.

인체적용시험에 사용한 HO-01은 HO-S3을 기초로 음료 기호도를 높이기 위해 감미료를 첨가하였으며, 최종 1회 분량이 80 mL이 되도록 95℃ 살균하고 충진 및 밀봉하여 제조하였다.

HO-01의 기준규격 설정

식품공전의 시험방법⁷⁾에 따라 성상, 이물(일반, 금속성), 수분함량 54.9% 이하, 대장균군 검출 여부를 기준규격으로 설정하였다. 함량의 경우 glycyrrhizin, baicalin, baicalein 및 wogonin을 지표 물질로 선정하고, 생약규정집의 시험방법⁸⁾으로 측정하여 glycyrrhizin의 경우 1.97 mg/g 이상, baicalin, baicalein 및 wogonin은 3개의 합으로 15.8 mg/g 이상으로 설정하였다.

HO-01 생약혼합추출 농축액은 이미 또는 이취가 없고 고유의 향미가 있는 갈색 및 흑갈색의 연조엑스이며, 수분함량은 15.3%, 이물 및 대장균군은 검출되지 않았다.

감초 및 황금의 지표성분함량은 HPLC(S511, Sykam, Germany)를 사용하여 분석하였으며 표준물질인 glycyrrhizin, baicalin, baicalein, wogonin등은 Wako사에서 구입하여 농도구배로 검량선을 구하였다. 검체 약 1 g을 70% 에탄올 40 mL에 넣고 1시간 초음파 추출하고 여과하여 50 mL이 되도록 70% 에탄올 넣어 검액으로 사용하였다. 표준품은 약 10 mg을 70% 에탄올 50 mL에 녹여 표준액으로 사용하였다. 검액과 표준액 20 µL 또는 10 µL로 HPL C 분석을 하였으며, glycyrrhizin의 이동상은 6% 아세트산‧아세토니트릴 혼합액(3:2)을 사용했고, baicalin, baicalein, wogonin 분석의 이동상은 A) 1% 아세트산 B) 아세토니트릴‧메탄올 혼합액(7:3)을 조제한 후 gradient program으로 조합하였고 컬럼은 Zorbax SB-Aq(5 µm, 4.6 × 150 mm)를 사용하였으며 이동상 1.0 mL/min으로 UV detector 270 nm에서 분석하였다. HPLC를 이용하여 HO-01 중 감초의 glycyrrhizin과 황금의 baicalin, baicalein, wogonin 함량을 분석한 크로마토그램은 Fig. 1과 같다. 분석 결과 HO-01 중 감초의 glycyrrhizin 함량은 2.19±0.02 mg/g으로 확인되었고, 황금의 baicalin은 17.2±1.1 mg/g, baicalein은 0.128±0.002 mg/g, wogonin은 0.076±0.002 mg/g으로 3가지 지표성분의 합은 17.4±1.1 mg/g으로 확인되었다.

Fig. 1. HPLC chromatograms showing peaks corresponding to the marker compounds, (A) glycyrrhizin, (B) baicalin, and (C) baicalein and wogonin of HO-01 with absorbance detection at 270 nm.

라디컬 소거능

DPPH 용액과 시험물질은 1:1로 혼합하여 암실에서 30분 방치하고 microplate reader(BioTek, Winooski, VT, USA)로 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시험물질은 50, 100, 500 µg/mL의 농도로 희석하였으며, 흡광도 측정 시 시험물질의 색을 보정하기 위해 각 시료와 메탄올을 1:1로 혼합하여 그 값을 보정하였다. 양성대조군으로는 Vitamin C(Ascorbic acid) 50 µM을 사용하였다.

SOD(superoxide dismutase) 유사 활성은 SOD assay kit(Dojindo Molecular Technologies, Rockville, USA)를 사용하였다. 시료를 50, 100, 500 µg/mL의 농도별로 희석하여 96 well plate에 20 µL씩 분주한 후, 200 µL WST 용액과 20 µL enzyme을 넣고 37℃에서 20분간 incubation 한 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군으로는 500 µg/mL trolox를 사용하였다.

세포배양

시험물질의 세포 독성 및 보호효능을 측정하기 위하여 사람의 간세포 유래 HepG2(American Type Culture Collection: ATCC, Manassas, VA, USA)세포를 사용하였다. HepG2 세포는 DMEM배지(Invitrogen Inc., Carlsbad, CA, USA)에 10% FBS(Invitrogen Inc., Carlsbad, CA, USA), 1% 페니실린 및 1% 스트렙토마이신(Invitrogen Inc., Carlsbad, CA, USA)을 혼합하여 배양하였고, 이를 37℃ 습윤한 CO₂ 배양기(5% CO₂, 95% air, Thermo Fisher Scientific, Grand Island, NY, USA)에서 2-3일 간격으로 배양하여 실험에 사용하였다.

세포 생존율

세포 생존율 측정은 Carmichael 등(1988)의 방법을 일부 변형시켜 측정하였다.⁹⁾ 배양된 세포에 1 mg/mL MTT용액을 넣어 3시간 배양 후 상층액을 제거하고, DMSO를 첨가하여 교반 후 540 nm의 파장에서 microplate reader(BioTek, Winooski, VT, USA)로 흡광도를 측정하여 세포 생존율을 계산하였다.

t-BHP로 유도된 산화적 스트레스에 대한 간세포 보호

배양한 HepG2세포를 1×10⁵ cells/mL로 96 well plate에 분주하고 37℃ CO₂ incubator에서 24시간 배양하였다. 배지를 제거한 후 시료가 농도별로 첨가된 FBS-free DMEM 배지를 24시간 처리하였다. 그 후에 배지를 제거하고 dulbecco’s phosphate buffered saline(DPBS, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 세척하고 시험물질을 농도 별로 희석해서 전 처리하고 4시간 뒤에 FBS-free DMEM 배지에 200 µM tBHP(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 함께 24시간 동안 37℃ CO₂ incubator에서 배양한 후 MTT assay(SigmaAldrich, St. Louis, MO, USA)를 통하여 세포의 생존율을 측정하였다.

t-BHP로 유도된 ROS의 생성 억제

배양한 HepG2 세포를 1×10⁵ cells/mL로 96 well black plate에 분주하고 37℃ CO₂ incubator에서 24시간 배양하고 시료를 농도별로 24시간 전 처리하였다. 산화적 스트레스를 유도하기 위해 100 µM t-BHP 처리 15분 뒤, 10 µM 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate(H2DCFDA)를 10 µL를 넣고, 30분 동안 37℃ CO₂ incubator에서 반응하였다. 이후 DCF형광은 485 nm와 530 nm에서 Synergy HT multi-mode microplate reader(BioTek Instruments, Winooski, VT, USA)를 이용하여 측정하였다.

동물의 사육

본 연구에서는 6주령의 자성 SD 랫트(180±5 g, (주)오리엔트 바이오, 광주)를 사용하였다. 1 주간의 적응기를 둔 후 체중범위에 따른 무작위법에 의하여 군분리를 실시한 후 사용하였다. 실험에 사용된 동물들은 인수 및 순화기간 동안 이상증상이 관찰되지 않았다. 모든 실험은 원광대학교 동물윤리승인을 받아 수행하였다(WK19-056).

실험군의 구성 및 처치

실험군은 6마리씩 대조군(EtOH), 시료투여군, 상업적인 숙취음료 제품군(컨디션 파워(CP), 제일제당, 한국)으로 나누었다. 시험에 앞서 사료 섭취로 인해 나타날 수 있는 위 장관을 통한 알코올의 흡수 방해 현상을 배제하기 위해 알코올 투여 전 9시간 및 시험 전 기간 동안 절식시켰으며 이때 물은 제한 없이 공급하였다. 각 시료는 알코올 투여 30분전에 200 mg/kg, 알코올 투여는 4 g/kg으로 각각 10 mL /kg의 액량으로 경구 투여하였다.

혈장 및 장기 채취

알코올 투여 0, 15, 30, 60, 120, 300, 480, 540분 후 diethyl ether 마취상태에서 heparinized capillary tube(kimble chase life science and research produsts, LLC, vineland, USA)를 이용하여 안와정맥총 채혈을 수행하였다. 알코올 투여 9시간 후 마취하고 복대 동맥으로부터 혈액을 채취하여 방혈치사 하였다. 시간별로 획득한 혈액은 튜브에 담고 4℃, 4,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 혈장을 분리하였다. 실험동물의 간 조직은 혈액채취 후 즉시 적출하여 액체질소로 급속 동결시켜 -70℃에 보관하였다.

Cytosol 및 Microsome 분리

적출된 간의 3배 용량의 homogenizing buffer를 가하여 분쇄한 후 4℃ 10,000 g로 20분간 원심분리하고 상등액을 취하여 4℃ 105,000 g에서 1시간 동안 초원심분리를 수행하였다. 여기서 얻은 상등액(cytosol)은 ADH, ALDH 측정에 사용하였다. Microsomal pellet은 buffer에 재분산하고 4℃, 105,000 g에서 1시간 동안 재 원심분리하여 획득한 microsome은 cytochrome P450 2E1측정에 사용하였다.

혈중 알코올 및 아세트알데히드 농도 측정

혈중 알코올 농도는 ethanol fluorometric assay kit(BioVision, milpitas Boulevard, Milpitas, USA)를 이용하여 측정하였다. 각 개체의 10 μL 혈청를 96 well plate에 loading한 후 40 μL ethanol assay buffer를 첨가하였다. 그리고 46 μL ethanol assay buffer와 0.2 μL ethanol probe, 0.2 μL ethanol enzyme mix를 섞은 reaction mixture를 첨가하였다. 상온에서 10분 간격으로 60분 동안 반응시키면서 flurometric assay방법을 이용하여 Ex/Em=535/590 nm파장으로 측정하였다. 혈중 아세트알데히드 농도는 enzychrom acetaldehyde assay kit(BioAssay Systems, Hayward, USA)를 이용하여 측정하였다. 각 개체의 20 μL 혈청를 96well plate에 loading한 후 75 μL Assay buffer를 첨가하였다. 그리고 1 μL NAD/MTT, 1 μL enzyme A, 2 μL enzyme를 섞은 working reagent를 첨가하였다. 상온에서 30분 동안 반응시키면서 565 nm 파장으로 측정하였다.

농도-시간 곡선하면적

경구 투여한 알코올의 약물동태학 거동을 평가하기 위해, 농도-시간 곡선하면적(area under the curve; AUC)을 약물동태학 지표로 산출하였다. 0분부터 15, 30, 60, 120, 300, 480, 540분에 검출된 알코올 및 아세트알데히드 농도를 이용하여 시간 농도곡선을 작성하고, AUC는 사다리꼴 면적 계산 공식을 이용하여 최종 채혈 시까지의 값을 구하였다.

간 조직의 ADH 및 ALDH 활성

Alcohol dehydrogenase activity colorimetric assay kit(BioVision, Milpitas Boulevard, Milpitas, USA)로 측정하였다. Sample 10 μL를 96 well plate에 loading한 후 40 μL ADH assay buffer를 첨가하였다. 그리고 82 μL ADH assay buffer와 8 μL developer, 10 μL substrate를 섞은 reaction mixture를 첨가하였다. 37℃에서 3분간 반응시킨 후 2분 간격으로 60분 동안 37℃에서 colorimetric assay방법을 이용하여 450 nm파장으로 측정하였다. Acetaldehyde dehydrogenase activity colorimetric assay kit(BioVision, Milpitas Boulevard, Milpitas, USA)로 측정하였다. 10 μL Sample를 96well plate에 loading한 후 40 μL ALDH assay buffer를 첨가하였다. 그리고 43 μL ALDH assay buffer와 2 μL ALDH substrate Mix, 5 μL acetaldehyde를 섞은 reaction mixture를 첨가하였다. 상온에서 5분간 반응시킨 후 2분 간격으로 60분 동안 상온에서 colorimetric assay방법을 이용하여 450 nm파장으로 측정하였다.

ADH 또는 ALDH activity = B/(T×V) × 희석배수

B: NADH생성량으로 측정된 ADH또는 ALDH, T: 반응시간, V: 반응에 사용한 protein량

Cytochrome P450 2E1 활성

100 μL 간 마이크로좀에 100 μL ascorbic acid, 100 μL substrate(p-nitrophenol)와 600 μL PBS버퍼를 혼합하여 37℃에서 2분간 방치하였다. 이 후 100 μL NADPH를 가하여 37℃에서 3분간 방치하고 perchloric acid를 500 μL을 넣어 반응을 종결하였다. 종결된 용액은 3000 rpm에서 원심분리하여 상등액에 10 N의 NaOH을 가해 발색된 4-nitrocatechol의 생성량을 546 nm에서 측정하였다.

간 Malondialdehyde 함량

Malondialdehyde(MDA)는 thiobarbituric acid(TBA, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 반응을 이용한 Draper와 Hadley(1990) 법으로 측정하였다.¹⁰⁾ 간 조직 9배 용량의 homogenate buffer을 첨가하여 균질화한 후 sample 200 μL를 0.75% TBA 750 μL, acetic acid 750 μL, 8.1% SDS 100 μL 및 DW 200 μL와 혼합하였다. 1시간 동안 100℃에서 끓이고 15분 동안 ice에서 식힌 뒤 n-butanol 및 DW를 첨가 후 원심분리 수행하였다. 이후 상층액을 532 nm에서 측정하였다.

간 Glutathione 함량

Glutathione은 Griffith(1980)법으로 측정하였다.¹¹⁾ 간 조직에 EDTA 2 mM이 함유된 1M HClO4 용액을 5배 용량으로 가하고 polytron(IKA-WERKE)으로 분쇄하여 20% homogenate를 만들었다. Homogenate를 5,000 rpm에서 5분간 원심분리한 후 상등액을 취해서 phosphate 완충액을 이용하여 glutathione 농도가 표준 검량선 농도범위 내에 들도록 희석한 후 총 glutathione정량을 위한 검체로 사용하였다. Microcuvette에 0.3 mM NADPH용액 0.7 mL, 6 mM DTNB 용액 0.1 mL에 검체 또는 glutathione 표준액 0.2 mL을 가해서 섞은 후 상온에서 4분간 방치하였다. 여기에 glutathione reductase(50 unit/mL)을 가해서 섞어준 후 412 nm에서 약 1분간 흡광도의 변화를 측정하여 기울기 변화를 구하였다.

인체적용시험

평소 주량이 소주 1병 이상인 건강한 성인 남성(20~40세) 15명을 대상으로 교차 시험(crossover design) 방식으로 숙취 해소 효과를 확인하는 인체적용시험을 수행하였다. 본 연구는 한양대학교 기관생명윤리위원회의 인체적용시험승인(HYU-2020-01-008-1)을 받았으며, 모든 피험자들에게는 시험에 앞서 연구의 기간, 목적 및 방법, 예상되는 효과 및 위험성에 대해 충분히 설명하고, 자발적으로 시험참여 동의서를 받았다. 시험 기간 중 발생한 부작용으로 인하여 시험을 계속할 수 없다고 주치의가 판단하거나 환자가 거부한 경우, 사고 등의 재해나 타 질환의 발병으로 수술 또는 입원치료가 필요한 경우, 기타 시험을 지속할 수 없다고 주치의가 판단한 경우, 시험 중 알코올 섭취 후 구토를 한 경우는 제외하였다.

인체적용시험 대상자는 시험음료를 일주일간 하루에 음료 1병을 복용하였고, 시험당일 알코올 함량 20.1% 소주 360 mL에 마른안주 25 g을 30분 동안 마시게 하였다. 혈중 알코올 농도 및 아세트알데히드 농도는 음주 후 30, 90, 150, 210분에 혈액을 채취하여 측정하였고, 혈중 ADH, ALDH, 활성은 음주 전, 음주 후 30, 90, 150, 210분에 혈액을 채취하여 측정하였다. 음주 150분 후 및 다음 날 아침(12시간 후) 갈증(thirst), 졸음(sleepiness), 두통(headache), 어지러움(dizziness), 구토(nausea), 무력감(weakness), 복통(stomach pain), 설사(diarrhea), 집중곤란(concentration disorder), 자극에 민감(sensitive), 수면곤란(sleep disorder), 진땀(sweating), 우울증(depression) 및 기억단절(remember interruptions)의 14개 항목에 숙취가 있고 없음에 따라 5점 척도법(숙취가 낮을 경우 최저 1점, 숙취가 높을 경우 최대 5점)으로 평가하였다.

혈액학적 지표

본 연구에 사용한 시험음료 제품의 혈액학적 변화를 평가하기 위하여 시험제품 섭취 전과 섭취 후 혈액학적 검사(total protein, albumin, total bilirubin, alkaline phosphatase, AST(SGOT), ALT(SGPT), γ-GT, creatinine, BUN, triglyceride, total cholesterol, HDL cholesterol, LDL cholesterol) 및 심전도를 실시하였고, 연구기간 내내 부작용과 이상반응을 평가하였다.

통계분석

시험에 얻어진 결과는 평균±표준편차로 표기하였으며 graphpad prism v5.0 또는 IBM SPSS Statistics(ver. 24) 프로그램을 활용하여 paired t-test를 수행하여 유의성을 검증하였다. 통계적인 유의성은 p값이 0.05 이하인 경우를 기준으로 판정하였다.

결과

후보소재 3종(HO-S1, HO-S2, HO-S3)의 라디칼 소거

후보소재 3종(HO-S1, HO-S2, HO-S3) 모두 농도 의존적인 DPPH와 superoxide 라디칼 소거능를 나타내었다(Fig. 2). 후보소재 3종은 500 µg/mL의 농도에서 양성대조군인 vitamin C 50 µM와 유사한 수준의 DPPH 라디칼 소거능을 나타냈다. Superoxide 라디칼 소거능의 경우 양성대조군인 trolox와 유사하거나 HO-S1의 100, 500 µg/mL, HO-S2의 500 µg/mL에서 유의적으로 더 높게 나타났다.

Fig. 2. Antioxidant activity of HO-series. The values were presented as means±SD. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 significantly different from the control group.

간세포 안전성 및 산화적 스트레스에 대한 간세포 보호

후보소재 3종(HO-S1, HO-S2, HO-S3)은 100 µg/mL의 농도까지 세포 독성이 관찰되지 않았다(Fig. 3). 따라서, 후보소재의 처리농도를 10, 30, 100 µg/mL의 농도로 설정하였다. t-BHP로 산화적 스트레스를 유도한 후 세포 생존율은 49.1%로 유의적인 감소를 나타내었다. HO-S1, HO-S2, HO-S3이 전 처리된 세포에서 모두 농도 의존적인 세포 생존율 증가를 나타내었다. HO-S1, HO-S2, HO-S3 100 µg/mL처리 농도는 대조군 대비 각각 25.2, 30.5, 40.9%p의 증가된 세포 생존율을 보여 t-BHP로 유도된 산화 스트레스에 대해 세포 보호효과가 있는 것으로 판단되었다. 양성대조군 silymarin 50 µg/mL은 53.6%의 생존율을 나타내었다(Fig. 4).

Fig. 3. Cytotoxicity of HO-series in HepG2 cells. The values were presented as means±SD.

Fig. 4. Protective effect of HO-series on t-BHP induced cytotoxicity in HepG2 cell. The values were presented as means±SD. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 significantly different from the only t-BHP treated group.

ROS 생성 억제

산화적 스트레스 유도를 위해 t-BHP 노출시킨 대조군의 reactive oxygen species(ROS) 생성량을 100%로 환산하였을 때 HO-S3 시료가 100 µg/mL 농도로 전 처리된 세포에서 대조군 대비 21.4%p의 유의적인 감소를 나타내었다. 양성대조군으로 사용한 silymarin 50 µg/mL에서는 66.2%p의 유의적인 ROS 생성량 감소를 나타냈다(Fig. 5).

Fig. 5. Inhibitory effect of HO-series on t-BHP induced reactive oxygen species (ROS) in HepG2 cells. The values were presented as means±SD. *P<0.05, ***P<0.001 significantly different from the only t-BHP treated group.

혈중 알코올 및 아세트알데히드 농도

혈중 알코올 농도는 EtOH 군에서 섭취 후 1시간(219.4±52.7 mg/dL)까지 지속적으로 증가 후 서서히 감소하였고, 9시간이 경과한 후 혈중 알코올 농도는 39.3±22.6 mg/dL로 관찰되었다. HO-series 및 양성대조군은 대조군 대비 각 시간별 혈중 알코올 농도에 유의적인 영향을 미치지 않았다. 알코올의 농도-시간 곡선하면적 (AUC)은 HO-S3의 경우 322.5±0.9 mg/dL/hr으로 EtOH군(338.8±35.0 mg/dL/hr) 대비 4.8%p의 유의적인 감소를 나타내었다. 양성대조군의 경우 323.1±17.5 mg/dL/hr으로 4.7%p 감소하였으나 유의적 차이는 아니었다(Fig. 6).

Fig. 6. Effect of HO-series on the blood concentration of alcohol and area under the curve (AUC). The values were presented as means±SD. *P<0.05 significantly different from the control group.

EtOH군의 혈액 중 아세트알데히드 수준은 섭취 후 1시간(1.30±0.85 mg/dL)까지 지속적으로 증가 후 서서히 감소하였고, 9시간이 경과한 후혈중 아세트알데히드 농도는 0.15±0.10 mg/dL로 관찰되었다. HO-series 및 양성대조군은 대조군 대비 각 시간별 혈중 아세트알데히드 농도에 유의적인 영향을 미치지 않았다. 아세트알데히드의 농도-시간 곡선하면적(AUC)은 HO-1은 1.7±1.0, HO-S2는 1.2±0.4, HO-S3는 1.0±0.6 mg/dL/hr으로 EtOH군(1.7±0.4 mg/dL/hr) 대비 각각 1.8, 27.2, 40.9%p 감소로 HO-S2과 HO-S3군에서 유의적 차이를 나타내었다. 양성대조군의 경우 1.2±0.5 mg/dL/hr으로 EtOH 군 대비 유의적 차이를 나타내었다(Fig. 7).

Fig. 7. Effect of HO-series on the blood concentration of acetaldehyde and area under the curve (AUC). The values were presented as means±SD. *P<0.05 significantly different from the control group.

간 조직의 ADH 및 ALDH 활성

알코올 섭취에 따른 알코올 대사효소에 HO-series가 미치는 효과를 알아보기 위해 간 조직의 ADH와 AL DH 효소활성을 측정한 결과를 Fig. 8에 나타내었다.

Fig. 8. Effect of HO-series on hepatic ADH and ALDH activity. The values were presented as means±SD. *P<0.05 significantly different from the control group.

간 조직의 ADH의 경우, HO-S1(1.68±0.42 µmol/min/mg protein), HO-S2(1.76±0.41 µmol/min/mg protein), HO-S3(1.78±0.14 µmol/min/mg protein)으로 EtOH 군(1.21±0.43 µmol/min/mg protein) 대비 38.7, 46.0, 47.6%p의 유의적(p<0.05) 증가를 나타내었다. 간 조직의 AL DH의 경우, HO-S1(0.28±0.097 µmol/min/mg protein), HO-S2(0.30±0.01 µmol/min/mg protein), HOS3(0.30±0.07 µmol/min/mg protein)으로 EtOH 군(0.24±0.86 µmol/min/mg protein) 대비 15.4, 23.0, 23.6%p의 증가하는 경향을 나타내었다.

Cytochrome P450 2E1 효소 활성

Cytochrome P450 2E1 효소 활성은 p-nitrophenol hydroxylation으로 측정하였다. 그 결과 EtOH 투여군은 1.41±0.1 nmol/mg protein을 나타내고, 양성대조군은 EtOH 투여군 대비 약 20.8%p 로 유의적 증가를 나타내었다. HO-S1, HO-S2, HO-S3에서 EtOH투여군 대비 각각 8.7, 29.9, 28.4%p의 증가를 나타내었으며, 그중 HO-S2, HO-S3은 유의적 차이를 나타내었다(Fig. 9).

Fig. 9. Effect of HO-series on cytochrome 2E1 activity. The values were presented as means±SD. *P<0.05 significantly different from the control group.

간 조직에서 MDA 및 GSH 함량

HO-S1, HO-S2, HO-S3 투여에 의한 MDA는 EtOH 투여군(302.4±81.1 µM/gliver) 대비 각각 11.5, 24.9, 31.4%p의 감소를 나타내었으나, 유의적 차이는 없었다. 양성 대조군은 EtOH 투여군 대비 21.4%p 감소하였으나 유의적 차이는 아니었다(Fig. 10).

Fig. 10. Effect of HO-series on hepatic MDA and GSH by alcohol induced hepatic toxicity. The values were presented as means±SD. *P<0.05 significantly different from the control group.

양성대조군의 GSH 함량은 9.4±2.0(µM/g liver)로 EtOH 투여군(8.1±1.2 µM/g liver) 대비 16.0%p 증가 나타내었으며, HO-S1, S2, S3의 GSH 함량은 각각 9.1±1.8, 8.7±1.4, 11.4±1.2(µM/g liver)으로 EtOH 투여군 대비 각각 12.8, 7.8, 40.7%p로 증가를 나타내었으며, 그중 HO-S3에서 유의적 차이를 확인하였다.

HO-01의 인체적용시험

혈중 알코올 농도는 대조군과 시험군 모두 음주 후 30분에서 혈중 알코올 농도가 가장 높았다. 음주 후 30분을 기준으로 혈중 알코올 농도를 비교했을 때 대조군은 음주 후 90, 150, 210분에서 각각 10.5, 23.6, 35.3% 감소하였다. 시험군 또한 음주 후 90, 150, 210분에서 각각 16.4, 27.5, 27.5% 감소하였다. 혈중 아세트알데히드 농도가 음주 후 30분을 기준으로 210분에서 대조군 17.32%, 시험군은 55.16% 감소하여 시험군의 감소율이 매우 높게 나타났다(Table I).

Table I. Effect of HO-01 on the blood concetration of alcohol and acetaldehyde

Values are Mean±SD. Statistically significant difference between control group and HO-01 group(*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001)

시험군은 대조군에 비해 음주 후 30분, 90분, 150분에서 ADH 활성이 각각 11.3, 36.2, 4.31% 증가하였다. ALDH 활성 또한 시험군은 대조군에 비해 전 시간대에서 각각 203.6, 121.9, 176.8, 141.8, 161.9% 통계적으로 유의하게 증가하였다(Table II).

Table II. Effect of H O-01 on the blood of ADH and ALDH

Values are Mean±SD. Statistically significant difference between control group and HO-01 group(*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001)

주관적인 숙취 증상을 알아보기 위한 설문 조사에서는 음주 후 150분에서 과도한 갈증(16.79%), 졸음(22.33%), 두통(19.32%), 어지러움(24.29%), 구토(9.29%), 무력감(28.99%), 복통(11.50%), 집중곤란(27.92%), 자극에 민감(35.83%), 수면곤란(30.07%), 진땀(11.02%), 우울증(11.50%), 기억단절(11.50%) 항목에서 감소하였다. 음주 후 12시간에서 과도한 갈증(25.00%), 졸음(19.32%), 두통(26.14%), 어지러움(23.13%), 구토(6.54%), 무력감(18.37%), 복통(6.54%), 설사(9.77%), 집중곤란(23.13%), 자극에 민감(6.54%), 수면곤란(5.31%), 진땀(16.67%) 항목에서 감소하였다(Table III, IV).

Table III. Hangover symptom evaluation on 150min after drinking alcohol

Values are Mean±SD.

Table IV. Hangover symptom evaluation on l2hr after drinking alcohol

Values are Mean±SD.

HO-01 섭취에 의한 혈액학적 지표

시험제품 HO-01 섭취에 의한 혈액학적 변화를 평가하기 위하여 시험제품 섭취 전과 섭취 150분 후, 혈액학적검사(total protein, albumin, total bilirubin, alkaline phosphatase, AST(SGOT), ALT(SGPT), γ-GT, creatinine, BUN, triglyceride, total cholesterol, HDL cholesterol, LDL cholesterol) 및 심전도를 시행한 결과, 총 15명의 대상자 중에서 시험제품 섭취 전후 혈액학적으로 특별한 이상 소견을 보이지 않아 시험제품이 인체에 무해함을 확인할 수 있었다(Table VI).

Table V. Blood test of before and after drinking alcohol

Values are Mean±S.D.

감초(Glycyrrhiza glabra L inné), 구기자(Fruit of Lycium chinense Miller), 복령(Poria cocos Wolf), 가시오가피(Acanthopanax sessiliflorum Seeman), 황금(Scutellaria baicalensis Georgi), 창출(Atractylodes lancea De Candlle) 및 건강(Zingiber officinale Roscoe)

고찰

숙취 증상은 주요 원인으로 알려진 아세트알데히드가 체내에 높은 농도로 축적될 경우, 뇌의 혈액순환 저하로 이어져 두통을 일으키거나 속쓰림, 매스꺼움, 구토, 탈수로 인한 갈증, 설사 및 근육통 등을 유발시키는 것으로 보고되고 있다. 급만성적으로 알코올을 섭취할 경우 간 조직에서 알코올 대사 효소 체계의 활성 변화로 알코올 대사가 저해되어 알코올, acetaldehyde, 대사과정 중 생성되는 유해 대사산물, 활성 산소(reactive oxygen radicals, ROS) 및 nicotinamide adenine dinucleotide(NADH)의 과잉 생성 등으로부터 야기되는 다양하고 복잡한 기전을 통하여 알코올성 지방간, 간염, 간경화증 및 간암을 유발해 사망을 초래하게 된다.^{12, 13)}

따라서 알코올성 간 손상 정도는 알코올 및 acetaldehyde의 대사 효소의 활성 조절을 통한 이들의 분해 정도에 따라 영향을 받는다. 현재까지 체내에서 알코올과 acetaldehyde농도를 빠르고 안전하게 낮추어 숙취 해소와 간 기능 회복에 도움을 준다고 밝혀진 천연물로는 헛개나무와 천마혼합추출물, ¹⁴⁾ 오미자 농축액, ¹⁵⁾ 민들레즙¹⁶⁾ 등이 보고되었다.

갈화는 과음으로 인한 두통, 발열, 가슴 속이 답답하고 편안치 않아서 팔다리를 가만히 두지 못하는 증상, 갈증, 식욕부진, 복부팽만, 구토증 등을 치료하기 위해서 갈화해성탕(葛花解醒湯), 갈화청열환(葛花淸熱丸)으로 조제되어 사용되고 있다. 그 외 항산화, 혈장 내 지질대사 개선효능이 있으며,¹⁷⁾ Hwang 등(2018), Cho 등(2000)와 Xiong 등,(2010)의 연구에 따르면 실험동물의 급성 알코올 투여 및 알코올에 의한 지방간 동물모델에서도 혈중 알코올 농도 저하 및 간 보호 효과가 확인된바 있다.^{17, 18, 19)}

감초는 간세포 보호능 및 알코올 투여에 의한 지방간 모델에서 간 보호능이 검증되었으며 그 외, 항진균, 항염증 및 산화적 스트레스 억제에 대한 연구가 진행된바 있다.^{20, 21)}

구기자는 구기자나무의 열매로서 지방간의 저해작용과 간세포 신생의 촉진작용이 보고되어 있다.^{22, 23)}

복령은 높은 항산화 및 면역증강 효능이 연구된바 있으며(Wang 등, 2015), Gilbert 등(2014) 연구에 따르면 간염 개선에 효과적이다.^{24, 25)}

가시오가피는 항염, 항산화, 면역조절, 간기능 촉진 등의 효과가 보고되어 있다.^{26, 27)}

황금은 항히스타민, 항균작용, 항암작용, 항박테리아 활성, 항염증 효과 등이 밝혀져 있으며, 한방에서는 이질, 발열, 황달 및 종기의 치료에 사용되고 있다.^{28, 29)}

창출은 한방에서 불필요한 수분을 제거하는 이뇨작용과 비위의 기능을 좋게 하여 소화 기능을 강화하는 데 사용한다.³⁰⁾

건강은 위의 기능을 좋게 하여 소화 기능을 강하게 하며, 오심, 구토를 개선한다. 또한 항혈소판 작용, 항염증 및 항산화 효과가 보고되고 있다.³¹⁾

선행연구들을 통해, 갈화의 알코올 분해에 관여하는 효소와 감초, 복령, 구기자, 오가피, 황금추출물에서의 항산화 및 간독성 개선, 감초, 창출, 생강은 위장관 보호를 할 것으로 예측됨에 따라 8종의 시료를 혼합 추출할 경우 숙취개선에 효과적일 것이라 사료되었다.

이 연구에서는 혼합 추출물(HO-S1)의 효능을 높이기 위한 방법으로 당류, 단백질, 생체 물질, 고분자 물질을 분리할 수 있는 한외여과를 수행하였다(HO-S2). 또한 HO-S2 동량에 숙취해소에 효과 있다고 알려진 비타민과 아미노산을 혼합한 HO-S3의 효능을 시험관내 및 동물로 평가하였다. HO-S3을 기반으로 한 음료제품 형태인 HO-01에 대한 인체적용시험을 실시하였다.

Martinez-Hurtado 등(2018)의 연구는 숙취 증후군의 주요 매개 인자로서 산화적 스트레스를 시사하였으며, 다양한 항산화제가 알코올 노출에 의한 부작용을 억제 할 수 있음을 보여 주었다.³²⁾ 각각의 8종 추출물 및 HO-series 모두 높은 항산화능을 나타내었다. 간세포에서 산화적 스트레스 유발제인 t-BHP 처리군에서 생성되는 ROS가 HO-series 처리에 따라 유의적 감소를 나타내며 간세포 보호능 또한 관찰되었다.

음주 시 알코올은 소화기의 점막을 통해 빠르게 흡수되어 5분 내에 혈중에 나타나기 시작하며, 30-90분 사이에 최대 농도를 보이는 것으로 알려져 있다.^{33, 34, 35)} 혈중 알코올 수준은 섭취 후 1시간까지 지속적으로 증가하다가 서서히 감소하는 경향을 나타내었고, 9시간이 경과한 후에도 알코올이 혈중에 존재하고 있음을 알 수 있었다. 실험동물의 혈중 알코올 및 알데히드 농도를 농도-시간 곡선하면적을 정량한 결과, 알코올 투여 후 HO-S2 또는 HO-S3을 투여한 군의 경우 알코올 투여군과 비교하여 유의한 감소를 나타내었다.

직접적인 아세트알데히드를 분해 대사하는 ALDH 효소활성을 촉진하는 것이 숙취 해소에 효과적이라 할 수 있다.^{36, 37)} Hwang 등(2019)의 연구에 따르면, 알코올 투여에 의하여 감소한 ADH와 AL DH의 활성이 불미나리, 지구자, 방풍, 갯기름나물, 미숙과 복분자 딸기 및 인진쑥을 주원료로 한 혼합추출물에 의하여 증가하는 경향을 보였으며, ADH 활성보다 AL DH활성이 상대적으로 높아 빠른 아세트알데히드 감소에 복합물이 작용하였을 것으로 예상한바 있다.³⁸⁾ 우리의 연구 결과 또한 HO-series 투여에 의해 ADH의 활성과 ALDH 활성이 동시에 증가되어 숙취해소에 더 큰 영향을 미치는 것을 확인하였고 특히 한외여과를 수행한 HO-S2와 비타민 및 아미노산 조성이 더해진 HO-S3이 숙취해소 소재로서 활용도가 가장 높을 것으로 판단된다.

흡수된 알코올 중 대부분 ADH에 의해 대사고, 나머지는 부분은 MEOS(microsomal ethanol oxidzing system cytochrome)의 주효소인 CYP2E1이나 catalase에 의해 분해되어 아세트알데히드로 대사된다.³⁹⁾ Hepatic microsome을 분리하여 간의 약물 대사능력을 측정한 결과 MEOS를 구성하는 CYP2E1의 활성과 관련이 있는 p-nitrophenol hydroxylation 활성이 HO-S2, HO-S3에서 유의적인 증가를 나타내었다.

알코올의 대사체인 아세트알데히드는 acetaldehyde protein adducts의 생성과 지질과산화(lipid peroxidation)에 의한 생성물을 일으켜 간 독성에 관여한다.⁴⁰⁾ 이 연구에서도 급성 알코올 급여는 간조직의 지질과산화물 생성을 증가시켰으나, HO-series 투여에 의한 유의적 감소는 관찰되지 않았다.

GSH의 중요 역할로는 redox 반응 및 해독작용을 통하여 정상 세포들의 구조 및 기능을 유지해준다. GPx의 환원형 GSH는 산화형인 GSSG으로 산화시키면서 H₂O₂를 제거한다.^{41, 42)} GSSG는 glutathione reductase에 의해 다시 GSH로 환원되어 인체 내에서 균형을 이루면서 존재하게 된다. HOS3에서 GSH의 유의적 증가를 나타내었다.

알코올 섭취에 따른 인체의 변화를 알아볼 수 있는 지표 중 대표적인 것이 혈중 알코올 농도 측정이다. 하지만 숙취에 대한 증상은 혈중 알코올 농도가 낮아진 시점 또는 혈중에 알코올이 사라진 이후에도 지속되므로 숙취 증상 평가에 대해서는 설문형식을 통한 연구가 동시에 시행되고 있다. 이에 혈중 알코올 지표 외, 건강기능식품시험법가이드의 숙취 정도 설문지를 참고하여 알코올 섭취 150분, 12시간 후 대상자들에게 설문지를 작성하도록 하여, 숙취 증상의 호전을 평가하고자 하였다.

건강한 성인 남자를 대상으로 HO-01 복용 유무에 따른 음주 후 혈중 알코올, 아세트알데히드 농도, ADH 및 AL DH활성 변화 및 숙취증상 정도에 따른 변화를 관찰한 결과, 혈중 알코올 농도는 HO-01을 복용한 경우 복용하지 않은 대조군에 비해 음주 후 30분을 기준으로 90, 150분경과 시점에서 유의적 감소를 나타내었다. ALDH 활성은 HO-01을 복용한 경우 대조군에 비해 전시간대에서 유의적 증가를 나타내었다. 그리고 시험제품 복용 시 음주 후 발생할 수 있는 갈증, 졸음, 두통, 어지러움, 구토, 무력감, 복통, 설사, 집중곤란, 자극에 민감, 수면곤란, 진땀, 우울증 및 기억단절의 숙취 증상이 대조군에 비해 빠른 호전을 보이는 것은 시험제품이 알코올의 흡수를 지연시키고, 흡수된 알코올 분해를 빠르게 하는 것으로 판단된다.

또한 제품 섭취에 따른 안전성을 평가하기 위하여 시험제품 복용 전과 복용 후 혈액학적 검사를 실시하고 연구기간 내내 부작용과 이상반응을 평가한 결과 이상 소견 및 특별한 부작용과 이상 반응은 나타나지 않았다.

결론

본 연구에서는 숙취해소에 좋은 것으로 알려진 식품 소재들의 항산화, 간세포 손상의 보호 소재 8종을 스크리닝하고, 결과 및 경제성을 바탕으로 혼합비율을 설정하여 세포, 동물 및 인체적용 실험을 통해 알코올 대사와 관련된 숙취 개선효과를 검토하였다. HepG2세포에서 t-BHP와 HO-series를 처리하였을 때 알코올에 의한 간세포 손상정도가 낮아지는 것을 관찰하였다. In vivo에서 HO-series의 알코올 대사와 관련된 숙취해소 효과를 확인하고자 흰 쥐에 알코올과 HO-series를 투여한 결과, 알코올 투여 후 1시간까지 급격하게 혈중 알코올 수치가 대조군에서 증가하는 것이 관찰되었으며, HO-S2 및 HO-S3투여군은 유의적인 차이로 알코올 및 아세트알데히드 농도-시간곡선하면적이 감소되었음이 관찰하였다. ADH 및 ALDH 활성의 증가는 HO-series의 알코올 분해 및 대사산물의 제거 활성에 기여할 것으로 예상된다. 알코올 대사에 있어 CYP2E1 및 GSH 증가로 간세포의 활성에도 유의적 차이를 나타내었다. 인체를 대상으로한 HO-01 숙취 해소 음료 섭취는 혈중 알코올 및 아세트알데히드알데히드 농도 감소, ALDH의 활성을 유의적으로 증가시키며 숙취에 대한 증상 개선에도 효과적임을 확인할 수 있었다.

이를 통해 추출물의 한외여과물질인 HO-S2과 비타민 및 아미노산 혼합물질인 HO-S3, 음료제품인 HO-01 섭취에 의한 ALDH 활성 증가 및 간세포 손상 방어계를 향상시킴으로써 알코올 섭취로 인한 간 손상에 대한 보호 및 숙취 개선 효과가 있는 것으로 시험관 내, 동물 및 임상의 단계에 따라 검증하였다. 또한 HO-01의 섭취에 따른 혈액학적 검사에서 이상소견이나, 시험기간 동안 중등도 이상의 부작용이나 치료를 필요로 하는 심각한 이상반응이 나타나지 않았기에 안전한 숙취 개선 식품소재로 사용될 수 있을 것으로 판단된다.