The Korea Journal of Herbology (대한본초학회지)

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Comparative Study of Bang-poong (root of Saposhnikovia divaricata Schischkin) and Related Species on Neuroprotective and Acetylcholinesterase Inhibitory Effects

방풍류(防風類) 약재(藥材)의 신경세포보호효과 및 아세틸콜린에스터라제 저해 효과 비교

  • Ju, In Gyoung (Department of Life and Nanopharmaceutical Sciences, Graduate School, Kyung Hee University) ;
  • Lee, Seungmin (Department of Oriental pharmaceutical Science, College of Pharmacy, Kyung Hee University) ;
  • Choi, Jin Gyu (Department of Oriental pharmaceutical Science, College of Pharmacy, Kyung Hee University) ;
  • Oh, Myung Sook (Department of Life and Nanopharmaceutical Sciences, Graduate School, Kyung Hee University)
  • 주인경 (경희대학교 일반대학원 나노의약생명과학과) ;
  • 이승민 (경희대학교 약학대학 한약학과) ;
  • 최진규 (경희대학교 약학대학 한약학과) ;
  • 오명숙 (경희대학교 일반대학원 나노의약생명과학과)
  • Received : 2019.08.28
  • Accepted : 2019.09.25
  • Published : 2019.09.30
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Abstract

Objectives : Bang-poong (Saposhnikovia divaricata; SD) was traditionally used to treat inflammatory disorders. In this study, we aimed to investigate whether Bang-poong and related species including SD, Glehnia littoralis (GL), and Peucedanum japonicum (PJ) possess neuroprotective effects and acetylcholinesterase (AChE) inhibitory activities. Methods : Roots of SD, GL and PJ were extracted with distilled water (DW) or 70% ethanol (EtOH). We assessed 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) free radical scavenging activities of the extracts. To examine neuroprotective effects, we measured cell viability in PC12 or HT22 cells after treatment of the extracts with $H_2O_2$ or amyloid-beta ($A{\beta}$). To assess anti-neuroinflammatory effects, we measured the nitric oxide (NO) levels after treatment with the extracts and lipopolysaccharide (LPS) in BV2 microglial cells. In addition, we performed AChE inhibition assay to explore effects of the extracts on the cholinergic system. Results : DW and EtOH extracts of SD, GL and PJ showed mild DPPH free radical scavenging activities. Also, DW extracts of GL and PJ showed protective effects against $H_2O_2$-induced toxicity in PC12 cells. In LPS-activated BV2 cells, EtOH extracts of SD, GL and PJ exerted inhibitory effects on NO production. Meanwhile, DW extracts of SD, GL and PJ inhibited the $A{\beta}$-induced cell death in HT22 cells. In addition, DW and EtOH extracts of GL exhibited remarkable inhibitory activities on AChE. Conclusions : We demonstrated that SD, GL and PJ exert anti-oxidative, anti-neuroinflammatory and AChE inhibitory activities. These results indicate that SD, GL and PJ could be potential candidates for neurological disorders.

Keywords

Ⅰ. 서 론

방풍(防風)은 산형과(Umbelliferae) 방풍(Saposhnikovia divaricata Schischkin)의 뿌리를 건조한 것으로, 봄에는 꽃대가 나오기 전에, 가을에는 莖葉이 말랐을 때 캐어 莖葉과鬚根을 제거하여 사용한다. 본초학적으로는 祛風解表, 勝濕止痛, 祛風止痙하는 효능을 가지고 있어 外感風寒 또는 風熱表證, 風疹瘙痒證, 風寒으로 인한 風濕痹證, 破傷風, 抽搐痙攣등의 질환에 사용한다1). 防風과 이름 및 효능이 유사한 약재(防風類 藥材)로서 해방풍(海防風)과 식방풍(植防風)이 防風과혼용되어 유통되고 사용된다. 海防風은 산형과 (Umbelliferae)갯방풍( Glehnia littoralis Fr. Schmidt ex Miquel)의 뿌리 및 뿌리줄기를 사용하며 養陰淸熱, 益胃生津, 鎭痛, 發汗의효능이 있어 肺熱燥咳, 虛勞久咳, 陰陽咽乾, 口渴로 인한 천식, 만성결핵, 기관지염, 폐결핵 및 관절염 등의 질환 치료에 민간약으로써 사용된다2). 植防風은 산형과(Umbelliferae) 갯기름나물( Peuced anum japonicum Thunberg)의 뿌리로서 發汗, 祛痰, 解熱의 효능이 있어 感氣 증상인 가래, 기침, 두통치료에 사용하며, 전신마비나 신경통 등을 치료한다3).

防風의 외면에는 윗부분에 촘촘한 돌림마디 모양의 가로 주름이 보이고 갈색의 털 모양으로 된 엽초와 가는 뿌리 자국이 있다. 횡단면 피부는 회갈색으로 열극이 여러 개 보이고, 목부는 황색이고, 방사상 무늬와 황갈색 원형무늬가 있다. 한편, 海防風은 짧고 가는 가로주름의 돌림마디가 있는 뿌리줄기가 있으며 뿌리에는 어두운 적갈색의 작은 입상돌기가 있다. 횡단면 피부는 엷은 유백~유황색이며 빈틈이 있고 갈색의 작은 점이 산재되어 있으며 목부는 엷은 황색으로 비교적 치밀하다. 植防風은 근두부에 오목한 줄기자국이 보이고 잔뿌리자국이 있으며 횡단면에 갈색 환상의 형성층이 뚜렷하다. 피부는 회갈색~엷은 갈색이고 목부는 황갈색이며 치밀하다4). 防風은 prim-O-glucosylcimifugin, cimifugin, 4′-O-β-dglucosyl-5-O-methylvisamminol, 海防風은 bergapten, imperatorin, 植防風은 peucedanol 7-O-β-dglucopyranoside 등을 함유하며, hamaudol, scopoletin, psoralen 등 coumarin 및 chromone 계열의 화합물을 공통으로 함유한다5,6,7,8).

防風은 항산화, 항암9), 염증 억제를 통한 관절염 완화 효과10)를 나타내는 것으로 보고되어 있다. 防風에 함유된 chromone 계열의 화합물들은 진통효과를 가지고11), cimifugin은 알레르기성 염증을 억제한다12). 또한, panaxynol은 항암효과를 나타내며13) 4'-O-β-D-glucosyl-5-O-methylvisamminol은 혈관경련 억제 효과를 나타내는 것14)으로 보고된 바 있다. 海防風은 항산화15), 항염증16), 항진균17), 항암18), 피부염 완화 효과 19)에 대한 보고가 있으며, 海防風의 염화메틸렌 분획과 海防風이 함유하는 성분 중 imperatorin은 항염증 작용을 나타내고20,21), (9Z) 1,9-heptadecadiene-4,6-diyne-3,8,11&nd ash; triol, (10E) 1,10-heptadecadiene-4,6-diyne-3,8,9-triol은 항균 및 항진균 작용을 나타내는 것으로 보고되어 있다22). 植防風은 항비만23,24), 항암25), 항천식26), 골다공증 억제 효과27), 퇴행성관절염 완화28) 효과에 대한 보고가 있다. 植防風에서 분리된 coumarin 들은 평활근 수축을 억제하고29) 항혈소판작용을 보이며30) pteryxin은 항비만 효과를 나타낸다31).

중추신경계에서의 防風類 藥材의 작용에 대한 선행연구를 살펴보면. 海防風은 뇌유래신경성장인자(brain-derived neurotrophic factor)를 조절하여 성체 신경발생을 유도하며32,33) , 植防風은 미세아교세포의 활성화를 조절하여 뇌염증을 억제한다34) . 그러나 防風의 약리활성에 대하여는 연구가 되지 않았으며, 防風類 藥材의 기원별 및 추출 용매별 약리활성을 비교한 연구는 보고된 바 없다. 따라서, 본 연구에서는 防風, 海防風, 植防風을 물 및 에탄올로 추출한 시료들의 뇌신경질환에 대한 약리 활성을 평가 하고 비교하고자 하였다. 뇌신경질환은 다양한 원인에 의해 발병되며, 노화에 의한 산화스트레스와 염증반응의 활성화가 주된 병리작용기전으로 알려져 있다35,36) . 또한, 뇌신경질환의 대표적인 질환 중 치매에서는 아세틸콜린의 신경전달이 감소하여 학습 및 기억 기능의 감퇴가 나타난다37) . 이에, 防風類 藥材의 용매별 추출물들의 항산화, 항염증 및 아세틸콜린을 가수분해하는 아세틸콜린에스터라제(AChE)에 대한 억제 활성을 평가하였을 때 의미 있는 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.

Ⅱ. 재료 및 방법

1. 재료

1) 약재

본 실험에서 사용한 防風은 중국 동북지방, 海防風은 경북 영천, 植防風은 경북 영주에서 재배된 것이며 모두 정도 생약(Gyeonggi, Korea)에서 구입하였다. 각각의 약재 10 g에 10배의 증류수(DW) 또는 70% ethanol (EtOH)을 가하여 환류추출기에서 3 시간 동안 가열 추출하였다. 각 추출물을 감압여과 후 농축하였으며, 이후 동결건조하여 powder 형태의 시료를 얻었다. 시료는 –20℃에서 보관 후 매 실험마다 적절한 용매에 녹여 사용하였다.

2) 시약

세포배양에 필요한 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium, fetal bovine serum (FBS), Horse serum, penicillin/streptomycin (P/S)은 Hyclone (Auckland, New Zealand)에서 구입하여 사용하였다. 1,1-diphenyl2-picrylhydrazyl (DPPH), Dimethyl sulfoxide (DMSO), hydrogen peroxide (H2O2), lipopolysaccharide (LPS), 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide (MTT), acetylthiocholine iodide, 5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB), AChE from Electrophorus electricus와 기타 언급하지 않은 시약은 Sigma-Aldrich사(St Louis, CA USA)에서 구입하였다. amyloid beta 25-35(A& beta;25&nd ash; 35)는 Anaspec사(Fremont, CA USA)에서 구입하였으며, 증류수를 가하여 500 μM이 되도록 희석 후 37℃에서 3일 동안 incubation하여 amyloid plaque을 제조하였다38). 실험에 사용된 모든 시약은 분석용 등급 이상으로 사용하였다.

2. 방법

1) DPPH radical 소거작용측정

0.2 mM DPPH solution 100 μL와 1 ㎎/㎖의 한약재 추출물 100 μL를 혼합하여 상온에서 30분간 반응시킨 후 517 ㎚에서 spectrophotometer (Versamax microplatereader; Molecular Device, Sunnyvale, CA, USA)로 흡광도를 측정하였으며, 흡광도 값을 이용하여 DPPH 자유 라디칼 소거능을 다음과 같이 계산하였다.

DPPH free radical scavenging activity (%)＝{control-(sample-blank)}/control × 100

2) HT22 세포에서 Aβ25–35 plaque에 대한 세포 보호효과 측정

HT22 hippocampal neuronal 세포는 강인숙 교수 연구실(Kyung Hee University, Korea)에서 분양받아 사용하였다. 세포배양은 37℃의 5% CO2, 95% air 조건에서 10% FBS, 1% P/S를 포함하는 high-glucose DMEM 배지를 사용하였다. 세포 보호 효과를 측정하기 위하여 HT22 세포를 96 well microplate에 4.0×103 cells/well로 분주하였다. 24시간 후, 한약재 추출물을 100 ㎍/㎖로 1시간 전처리 한 후, 3 & mu;M의Aβ25&nd ash; 35 plaque를 23시간 더 처리하였다. 약물처리 및 Aβ25–35 plaque과의 반응이 종료된 후 상층액을 제거하고 MTT 1 ㎎/㎖를 처리하여 4시간 동안 반응시킨 후, 용액을 제거하고 DMSO 를 이용해 decrystalization 후 spectrophotometer로 570 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율은 대조군에 대한 백분율로 표시하였다.

3) PC12 세포에서 H2O2에 대한 세포 보호효과 측정

Rat pheochromocytoma PC12세포는 한국세포주은행(Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였다. 세포배양은 세포배양은 37℃의 5% CO2, 95% air 조건에서 10% horse serum, 5% FBS, 1% P/S를 포함하는 high-glucose RPMI1640 배지를 사용하였다. 세포 보호효과를 측정하기 위하여 PC12 세포를 96 well microplate에 3.0×104 cells/well로 분주하였다. 24시간 후, 한약재 추출물을 100 ㎍/㎖로 1시간 전처리하고 75 μM의 H2O2를 23시간 더 처리하였다. 약물처리 및 H2O2 와의 반응이 종료된 후 상층액을 제거하고 MTT 1 ㎎/㎖를 처리하여 4시간 동안 반응시킨 후 용액을 제거하고 DMSO를 이용해 decrystalization 후 spectrophotometer로 570 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율은 대조군에 대한 백분율로 표시하였다.

4) BV2 세포에서의 LPS에 대한 항염증 효과 측정

BV2 세포는 김선여 교수 연구실(Gachon University, Korea)에서 분양받아 사용하였다. 세포배양은 37℃의 5% CO2,95% air 조건에서 10% FBS, 1% P/S를 포함하는 highglucose DMEM 배지를 사용하였다. 세포생존율과 NO 생성에 대한 억제 활성을 측정하기 위하여 BV2 세포를 96 well microplate에 2.0×104 cells/well로 분주하였다. 24시간 후, 한약재 추출물을 100 ㎍/㎖로 1시간 전처리하고 100 ㎎/㎖의 LPS를 23시간 더 처리하였다. 약물처리 및 LPS와의 반응이 종료된 후 상층액 70 μL을 회수하여 NO 생성량 측정에 사용하였다. 상층액이 제거된 세포에 MTT 1 ㎎/㎖를 처리하여 4시간 동안 반응시킨 후 용액을 제거하고 DMSO를 이용해 decrystalization 후 spectrophotometer로 570 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율은 대조군에 대한 백분율로 표시하였다. 회수한 상층액은 동량의 griess reagent와 반응시켜 10분 뒤 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. NO 농도는 sodium nitrite를 표준물질로 하여 정량곡선 대비 수치로 계산하였다.

5) AChE 저해 활성 측정

AChE 저해 활성 측정은 Ellman법의 방법을 변형하여 colorimetric 방법으로 측정하였으며, acetylthiocholine iodide를 기질로 사용하였다39). 620 μL의 0.1 M의 sodium phosphate buffer (pH 7.0), 25 μL의 Ellman’s reagent (10mM 5,5′-Dithiobis(2-nitrobenzoic acid), 15 mM sodium bicarbonate), 25 μL의 AChE 및 80 μL의 한약재 추출물(100 ㎍/㎖)을 가한 후 shaking 하였다. 이후 blank설정을 위하여 각각 tube에 반으로 나눈 후 하나는 25 μL acetylthiocholine iodide (75 mM)을 가하여 반응시키고, 다른 하나는 25 μL의 0.1 M의 sodium phosphate buffer (pH 8.0)를 가하여 반응시켰다. 96 well microplate에 넣고 37℃에서 20분간 incubation 시킨 후 412 ㎚에서 spectrophotometer (Versamax microplatereader; Molecular Device, Sunnyvale, CA, USA)로 흡광도를 측정하였다. AChE 저해 활성(AChE inhibition (%))은 다음의 수식을 이용하여 계산하였으며, control군에 대한 %로 표시하였다.

AChE inhibition (%)＝{control-(sample-blank)}/control × 100

3. 통계처리

모든 측정값은 mean ± SEM으로 표시하였다. 통계처리는 Graphpad Prism 5.0 software (San Diego, USA)를 이용하였으며, 통계적 유의성은 One-way ANOVA, 사후검정은Tukey ’s test를 사용하였다. 분석 시 p 값이 0.05 미만일 때 유의하다고 판단하였다.

Ⅲ. 결 과

1. 시료 추출

防風類 藥材를 추출한 결과는 다음과 같다(Table 1). 防風은DW 추출물이 46.6%, EtOH 추출물이 31.6%, 海防風은 DW 추출물이 38.0%, EtOH 추출물이 20.9%, 植防風은 DW 추출물이 50.4%, EtOH 추출물이 41.8%의 수득률을 보였다. 용매별로 수득률을 비교하였을 때, DW, EtOH 추출물 모두植防風에서 수득률이 가장 높았으며, 防風, 海防風, 植防風에서 모두 EtOH 추출물보다 DW 추출물에서 높은 수득률을 보였다.

Table 1. Extraction Solvent, Method and Yield of Each Sample.

2. 防風類 藥材의 DPPH radical 소거 활성

防風類 藥材의 DPPH free radical 소거 활성을 측정하여 Table 2에 표시하였다. 防風 추출물 중에는 DW 추출물이 31.23%로 EtOH 추출물보다 더 강한 활성을 보였으며, 海防風,植防風 추출물 중에는 EtOH 추출물이 각각 32.87%, 3 0.28%로 DW 추출물보다 더 강한 활성을 보였다. 양성대조약물인黃芩 물 추출물40)의 1 ㎎/㎖에서 소거 활성은 89.86%로 나타났다.

Table 2. DPPH free radical scavenging activities of extracts at concentration of 1 ㎎/㎖. DW extract of Scutellaria baicalensis Georgi root is used as a positive control.

3. PC12 세포에서 防風類 藥材의 H2O2로 유도된 세포독성에 미치는 영향

PC12 세포에서 防風類 藥材가 H2O2 독성에 대한 세포보호효과를 나타내는지 평가하기 위하여 MTT 법을 이용하여 세포생존율을 측정하였다. 그 결과, H2O2 단독 처리군의 세포 생존율은 대조군 대비 41.26±0.26%로 유의하게 감소하였다.海防風, 植防風 추출물 처리군에서는 DW 추출물 처리군에서 각각 대조군 대비 55.94±1.40%, 56.74±1.24%의 세포 생존율을 보여 H2O2 단독 처리군에 비해 통계적으로 유의하게 증가한 것을 확인하였으며, EtOH 추출물 처리군에서는 H2O2 단독 처리군의 세포생존율과 차이를 보이지 않았다. 防風은DW, EtOH 추출물 모두 유의한 효과를 보이지 않았다(Fig 1.).

Fig. 1. Protective effects of SD, GL, and PJ on H2O2-induced cytotoxicity in PC12 cells. Cells were treated with DW or EtOH extract of SD, GL and PJ at concentration of 100 μg/ml for 1 h and treated with 75 μM of H2O2 for a further 23 h. Cell viability was presented as a percentage of the control. Values are expressed as the mean ± SEM. *** p < 0.001; compared with the control group. ## p < 0.01; compared with the H2O2 only treated group. SD; Saposhnikovia divaricata, GL; Glehnia littoralis, PJ: Peucedanum japonicum

4. BV2 세포에서 防風類 藥材의 LPS에 의한 NO 생성에 미치는 영향

防風類 藥材가 BV2 세포 생존율에 미치는 영향과 LPS에 의한 NO 생성 억제 효과를 확인하고자 BV2 세포에 6종 추출물 100 ㎍/㎖과 LPS를 처리하였다. MTT assay로 세포 생존율을 확인하였을 때, 세포 독성이 관찰되지 않았다(Fig 2A.). NO 양을 측정한 결과, LPS 단독 처리군(17.04±0.21 & mu;M)에서 대조군(0.86±0.06 μM) 대비 통계적으로 유의하게 NO 양이 증가하였다. 防風, 海防風, 植防風 각 약재의 EtOH 추출물 처리군에서 각각 9.34±0.19 μM, 13.72±0.31 & mu; M, 5.22± 0.16 μM로 LPS 단독 처리군 대비 통계적으로 유의한 억제효과를 보였다(Fig 2B.).

Fig 2. Inhibitory effects of SD, GL, and PJ on NO production in LPS-activated BV-2 cells. Cells were treated with DW or EtOH extract of SD, GL and PJ at concentration of 100 ㎍/㎖ for 1 h and stimulated with LPS for a further 23 h. The culture medium was then collected for measurement of secreted NO. Cell viabilities (A) are expressed as a percentage of the controls. NO production (B) in BV-2 cells was assayed by measuring the levels of nitrite in the supernatant fluid. Values are indicated as the mean ± SEM. *** p < 0.001; compared with the control group. ### p < 0.001; ## p < 0.01; compared with the LPS only treated group. SD; Saposhnikovia divaricata, GL; Glehnia littoralis, PJ: Peucedanum japonicum

5. HT22 세포에서 防風類 藥材의 Aβ로 유도된 세포독성에 미치는 영향

HT22 세포에서 防風類 藥材가 Aβ독성에 대한 세포 보호효과를 나타내는지 평가하기 위하여 MTT 법을 이용하여 세포생존율을 측정하였다. 그 결과, Aβ25-35 plaque 단독 처리군의 세포 생존율은 대조군 대비 62.61 ± 0.26%로 유의하게 감소하였다. 防風, 海防風, 植防風 각 약재의 DW 추출물 처리군에서 각각 대조군 대비 72.14 ± 0.13%, 69.92 ± 0.49%, 77.23 ± 0.87%의 세포 생존율을 보여 Aβ25-35 plaque 단독처리군에 비해 통계적으로 유의하게 증가한 것을 확인하였다(Fig 3.).

Fig. 3. Protective effects of SD, GL, and PJ on Aβplaque-induced cytotoxicity in HT22 cells. Cells were treated with DW or EtOH extract of SD, GL and PJ at concentration of 100 ㎍/㎖ for 1 h and treated with 3 μM of Aβplaque for a further 23 h. Cell viability was presented as a percentage of the control. Values are expressed as the mean ± SEM. *** p < 0.001; compared with the control group. ### p < 0.001; ## p < 0.01; compared with the Aβ plaque only treated group. SD; Saposhnikovia divaricata, GL; Glehnia littoralis, PJ: Peucedanum japonicum

6. 防風類 藥材의 AChE 저해효과 비교

防風類 藥材의 AChE 억제 활성을 100 ㎍/㎖ 농도에서 측정한 결과 防風 추출물은 DW 추출물에서 1.20%, EtOH 추출물에서 1.28%로 가장 약한 효과를 보였고 植防風 추출물 또한 DW 추출물에서 4.28%, EtOH 추출물에서 3.63%로 약한 효과를 나타냈다. 海防風 추출물은 DW 추출물에서 17.48%, EtOH 추출물에서 8.62%로 비교한 6종 추출물 중 가장 강한효과를 보였다. 양성대조약물인 Donepezil은41)의 10 ng/㎖에서 소거활성은 53.82%로 나타났다(Table 3).

Table 3. Inhibitory effect of DW or EtOH extract of SD, GL and PJ at concentration of 100 ㎍/㎖ on AChE activity in comparison with donepezil at 10 ng/㎖.

Ⅳ. 고 찰

본 연구에서는 防風類 藥材 DW 및 EtOH 추출물의 신경세포 보호 효과 및 AChE 저해 효과를 비교하였다.

防風은 風을 치료하는 약으로, 祛風解表, 勝濕止痛, 祛風止痙하는 효능이 있다. 이러한 효능 때문에 防風은 風寒濕痹,關節疼痛, 四肢攣急 등을 치료하는 처방에 구성약재로 사용이 된다1). 風寒濕邪는 肢體에 침범하여 痹痛을 유발하며, 오래停滯할 경우 熱로 전환되어 紅腫疼痛을 유발한다42). 이러한 증상은 현대의학적 관점에서 염증으로 해석이 가능하며, 이러한 해석은 祛風濕製를 관절염 치료 등에 사용하는 근거가 된다43). 防風의 風을 치료하는 효능 또한 항염증 활성을 매개하는 것으로 해석할 수 있으므로 만성염증이 원인이 되는 질환인 뇌신경질환에 대한 치료 가능성을 기대할 수 있다. 따라서 본 연구에서는 防風類 藥材 3종의 신경계에 대한 약리활성에 대하여 평가하였다.

중추신경계에서 산화스트레스는 다양한 뇌신경 질환의 병인으로 작용한다. 산화스트레스는 활성산소종의 증가와 이를 방어하는 항산화 시스템의 기능 저하로 인하여 발생하며 활성산소는 신경세포에 세포막 지질 과산화, 세포내 미토콘드리아, 단백질과 DNA 등을 손상시켜 세포독성을 야기한다36). 본 연구에서는 防風類 藥材의 자유 라디칼 소거 활성을 측정하기 위해 DPPH free radical의 소거활성을 측정하였다. DPPH assay는 안정화된 자유 라디칼을 가지고 있는 물질인 DPPH 가 자유 라디칼이 소거될 때 짙은 자색에서 옅은 황색이 되는 원리를 이용한 시험법이다44). 실험 결과, 防風, 海防風, 植防風 DW 및 EtOH 추출물 1 ㎎/㎖에서 모두 10~35% 범위의 약한 자유라디칼 소거능을 보였다. 또한, 산화스트레스가 유도하는 신경 세포 독성에 대하여 防風, 海防風, 植防風 DW 및 EtOH 추출물이 보호효과를 나타내는지 확인하고자 PC12 세포에서 H2O2 독성에 대한 세포보호효과를 평가하였다. 그 결과, 海防風, 植防風 DW 추출물에서 유의한 세포보호효과를 나타내는 것을 확인하였다. 본 연구 결과는 防風類 藥材의 항산화 작용을 통한 뇌신경 질환 개선 가능성을 시사한다.

미세아교세포는 중추신경계의 대식세포 유사세포(macrophage-like cell)로, 병적 상태, 즉 신경퇴행성 질환, 뇌졸중, 외상성 손상 그리고 뇌종양의 침범 등과 같은 상태에서 면역방어 기능을 수행한다45). 어떠한 자극에 의해 미세아교세포가 과도하게 활성화되면 염증 매개물질 중 하나인 NO를 방출하여 신경세포에 손상을 야기한다45). 본 연구에서는 그람음성균의 표면을 구성하는 물질로 염증을 유도하는 대표적인 독성인 LPS를 이용하여 미세아교세포의 활성화를 유도하였으며46) , 이에 따라 증가되는 NO에 대한 防風類 藥材의 억제 활성을 평가하였다. 그 결과 防風, 海防風, 植防風의 EtOH 추출물이 NO 생성을 억제하는 것을 확인하였으며, 그 중 植防風 EtOH 추출물이 가장 강한 것을 확인하였다.

본 연구 결과는 防風, 海防風, 植防風의 항염증 효능에 대한 기 보고 연구들을 뒷받침하며, 항염증 효과를 통해 뇌신경질환을 개선할 수 있는 가능성을 제시한다. 防風類 藥材의 항염증 활성에 대한 유효성분 규명 연구로서 Kamino 등의 防風, 海防風의 항염증을 나타내는 성분 분석 연구에 따르면 防風은3'-O-angeloylhamaudol, ledebouriellol, hamaudol 성분이, 海防風은 umbelliferone, scopoletin 성분이 항염증 활성에 관여하는 것으로 확인되었다47). 植防風의 항염증에 관한 활성성분은 praeruptorin A, xanthotoxin, psoralen, bergapten 등의 coumarin 계열 성분들일 것으로 사료된다34).

Aβ는 퇴행성뇌질환인 알츠하이머형 치매의 가장 잘 알려진병리적 산물이자 병을 일으키는 요인이다51). Aβ의 병리 기전은 명확히 규명되지 않았지만 뇌에서 산화스트레스와 염증을 발생시켜 지속적인 신경 세포의 기능장애를 야기하고 신경퇴행화를 가속화시키는 것으로 알려져 있어 알츠하이머병 약물 개발에 있어 대표적인 신경독성으로 사용된다36,48). 본 연구에서는 HT22 세포에서 Aβ독성에 대한 防風類 藥材의 세포 보호 효과를 확인하였으며, 본 연구 결과 防風, 海防風, 植防風 DW 추출물에서 세포 보호효과를 보였다. 이는 防風類 藥材가 알츠하이머병에 대한 개선 효과를 나타낼 수 있음을 시사한다.

아세틸콜린은 신경 말단에서 신호를 전달하는 신경전달물질 중 하나로, 뇌에서 학습과 기억 형성에 관여한다37). 알츠하이머병과 같은 퇴행성 치매 환자에서는 아세틸콜린의 양이 감소되어 학습 및 기억 장애가 일어나기 때문에, 증상 개선을 위해 아세틸콜린을 분해하는 AChE를 저해하여 아세틸콜린양을증가시키는 AChE 저해제를 사용한다49). 본 연구에서는 AChE의 기질인 acetylthiocholine의 분해를 발색법을 통해 분석하여 AChE의 활성을 측정하였다. 防風類 藥材의 AChE 억제활성을 평가한 결과, 防風과 植防風은 AChE 억제효과를 보이지 않았으며, 海防風은 DW 추출물, EtOH 추출물 100㎍/㎖에서 각각 17.48%, 8.62%의 약한 억제효과를 나타냈다.

본 연구의 결과를 통해, 防風類 藥材의 뇌신경질환 개선 가능성을 확인하였으며, 신경세포보호 효과는 防風, 海防風, 植防風모두 DW 추출물이 우수하며 염증 억제 효과는 防風, 海防風, 植防風 모두 EtOH 추출물이 우수한 것을 확인하였다. 또한, AChE 저해 활성은 海防風에서만 나타나는 것을 확인하였다.

Ⅴ. 결 론

본 연구에서는 防風, 海防風, 植防風의 용매별 시료들에서 신경세포보호효과 및 AChE 저해 효과를 비교하였고 다음과 같은 결론을 얻었다.

1. 防風類 藥材를 DW와 EtOH로 각각 추출하였을 때 수득률은 防風, 海防風, 植防風 추출물 모두 EtOH 추출물보다 DW 추출물에서 높았다. 2. 防風類 藥材 용매별 시료의 DPPH radical 소거 활성을 비교하였을 때 큰 차이를 보이지 않았다.

3. PC12 세포에서 防風類 藥材 용매별 시료의 H2O2 독성에 대한 세포 보호효과를 비교하였을 때 海防風, 植防風DW 추출물에서 防風 추출물 및 海防風, 植防風 EtOH 추출물에 비해 강한 효과를 보였다.

4. HT22 세포에서 防風類 藥材 용매별 시료의 Aβ독성에 대한 세포 보호효과를 비교하였을 때 防風, 海防風, 植防風 모두 DW 추출물에서 EtOH 추출물에 비해 강한효과를 보였다.

5. BV2 세포에서 防風類 藥材 용매별 시료의 LPS로 유도한 NO 생성에 대한 억제 효과를 비교하였을 때 防風, 海防風, 植防風 모두 EtOH 추출물에서 DW 추출물에비해 강한 효과를 보였다.

6. 防風類 藥材 용매별 시료의 AChE 억제 활성을 비교하였을 때 海防風 추출물이 防風, 植防風에 비해 강한 효과를 보였다. 이상의 결과는 뇌신경질환에 대한 防風, 海防風, 植防風의적용 가능성을 시사한다.

감사의 글

본 결과물은 농림축산식품부의 재원으로 농림식품기술기획평가원의 고부가가치식품기술개발사업의 지원을 받아 연구되었음(318027-04).

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