Anti-inflammatory Effect of Eucommia Ulmoides Oliver Bark Extract on P.gingivalis LPS-induced YD-38 Cells

두충 추출물의 잇몸상피세포 염증에 대한 항염증 효과

Abstract

Periodontitis is a chronic inflammatory disease and gums pull away from the teeth and form spaces. The main goal of treatment is to control the infection and anti-inflammation. Eucommia ulmoides Oliv. Bark (EU) is a traditional Korean herbal used for the treatment of arthritis and hypertension. In the present study, we investigated the anti-inflammatory properties of EU in Porphyromonas gingivalis-LPS (LPS-PG) induced YD-38 epithelial cells. We observed significant inhibition of nitric oxide (NO) production and the expression of interleukin-8 (IL-8), interleukin-6 (IL-6), tumor necrosis factor alpha ($TNF-{\alpha}$), cyclooxygenase-2 (COX-2) in LPS-PG-induced YD-38 cells. These results support that EU has an anti-inflammatory effects for the treatment of periodontitis.

두충(Eucommia ulmoides Oliver. Bark, Du-zhong, EU)은 두충나무의 줄기껍질로서 주피를 제거하여 말린 약재로 우리나라 중부 이남에 서식하며, 15 ~ 20년 된 두충나무 껍질을 약으로 사용한다. 두충에는 lignin 계열 화합물 pinoresiol glucoside, pinoresinol, cycloolivil 성분과 iridoid 계열 화합물인 aucubin, ulmoside 등이 있으며, phenolic compounds, steroids, terpenoids 등이 보고되어 있고 그 외 다당류 및 아미노산 등을 함유하고 있다.¹⁾ 약리작용으로는 항노화, 혈압강하, 항비만, 항염, 항우울, 항균작용 등이 알려져 있다.^2-7) 또한 파골세포의 조절을 하여 근골을 강화시켜 골다공증 및 관절염에도 효과가 있다고 보고되고 있다.⁸⁾

치아는 우리 몸에서 유일하게 밖으로 돌출되어 있는 뼈이며 잇몸 밖으로 나와있는 부분은 법랑질과 상아질로 구성되어 있고 치아의 중심부는 신경과 혈관이 있으며 치아의 뿌리는 치조골과 잇몸으로 둘러 쌓여 있다.^9,10) 치아는 박테리아에 의해 설탕, 전분 등이 분해되면서 생기는 산에 의하여 법랑질이 손상을 받게 되면서 치주질환을 야기한다.¹¹⁾ 입속의 세균의 종류는 500종에 달하고 이 세균 막을 치태(plaque)라 부르며 평균적으로 치태 1 g당 1000억 마리 정도의 세균이 존재한다고 보고되고 있다.¹²⁾ 이러한 세균막인 치태가 쌓이게 되면 잇몸과 치아 사이에 틈이 벌어져 치주낭(periodontal pocket)이라는 주머니가 형성된다. 치주낭 내에 증식된 세균에 의해 잇몸에 염증을 일으키게 되고 만성염증에 의한(gingivitis), 치주염(periodontitis)과 같은 치주질환이 유발되게 된다.¹³⁾

치태 세균의 독소 물질 중 치주염을 유발하는 물질은 gingivalis bacterial 중 Porphyromonas gingivalis(P. gingivalis)로 치주세포에서 bacterial lipopolysaccharides(LPS)를 분비하여 염증반응을 일으키고 면역세포들에 의한 면역 반응으로 cytokines와 chemokines이 분비되게 된다. P.gingivalis-LPS(LPS-PG)에 의해 염증이 유도된 상피세포에서는 염증에 관련된 cytokines인 interleukin-8(IL-8)과 interleukin-6(IL-6), TNF-α와 같은 유전자가 분비되어 구강상피세포에 염증을증가 시킨다고 보고되어있다.^14,15) 또한 염증반응에 중요한 기능을 수행하는 Prostagalndin(PG)이 세포분열이나 증식에 영향을 준다고 보고되어 있으며 PG의 생합성에 관여하는 중요한 효소인 cyclooxygenase(COX)에 의해 촉진된다.¹⁶⁾ COX는 두 종류의 isoenzyme으로 존재하며 COX-1과 COX-2로 존재하는데 COX-1은 house keeping gene으로 혈소판 응집, 위 점막의 세포보호기능, 신장의 정상기능을 유지하는 역할을 하고 반면에 COX-2는 정상세포 내에서 매우 낮은 상태로 유지 하다 염증과 같은 자극원에 의해 발현되며 COX-2의 과도한 발현은 백혈구, 혈관의 평활근세포, 류마티스 활액세포 등을 생성하게 된다.¹⁷⁾ 구강 내에서 이러한 염증이 증가되게 되면 치주염 및 치은염이 발생하게 되고 이러한 구강 내 염증은 치주염 뿐만 아니라 동맥경화증이나 관상동맥 성 심장질환의 진행에도 영향을 줄 수 있다는 보고가 있으며, 흡연보다 더 위험성이 높은 뇌졸중의 위험인자로 분류하고 있는 추세이다.^18,19)

통계에 따르면 치주질환 환자의 수가 2011년 기준 7,996,459명이였고 2012년에는 8,358,569명, 2013년에는 10,825,914명으로 매년 환자 수가 증가하고 있는 질환 중의 하나이다.^20-22)

이에 본 연구에서는 두충 추출물이 만성염증으로 인한 치주질환을 개선 가능성을 확인하고자, 치주질환을 일으키는 LPS-PG에 의해 유도되는 염증반응에 따른 pro-inflammation cytokines와 염증반응 매개물질 Nitric Oxide(NO)의 조절능력을 연구함으로써 두충 추출물의 치주염 개선 효과를 확인하고자 하였다.

재료 및 방법

세포주 및 재료

인간 아랫잇몸상피세포(human lower gingiva epithelial cell)인 YD-38 cell(한국세포주은행, KCLB No. 60508)을 사용하였다. 세포의 배양 배지는 1% penicillin-streptomycin(GIBCO, Grand Island, NY, USA)과 10% fetal bovine serum(FBS) (GIBCO, Grand Island, NY, USA)을 첨가한 Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 1640(GIBCO, Grand Island, NY, USA) 배지를 사용하였으며, 세포는 37℃, 5% CO₂ incubator(Thermo, Carlsbad, CA, USA)에서 배양하였다. LPS-PG(InvivoGen, San Diego, CA, USA)을 사용하였다.

두충 추출물 제조 및 성분 분석

본 연구에서 사용된 두충은 ㈜광명당 제약(KMD medicinal herbs, Korea)에서 제공받아 사용하였으며, 두충 100 g에 1 L의 50% 에탄올로 80℃에서 3시간, 2회 환류추출 하였다. 추출물을 filter paper(No.42, Whatman, Kent, UK)로 여과하고 50℃에서 감압농축기로 농축하여 건조 분말하여 분말 시료를 본 연구에 사용하였다. 성분 분석을 위하여 두충 50% 에탄올 건조물 39.58 mg 에 50% 에탄올 10 ml를 넣은 후 5분간 초음파 추출 후 0.22 μm HLB-M 멤브레인 필터(FUTECS, Daejeon, Korea) 하여 검액으로 사용하였다. 두충에 함유된 주요 성분은 geniposidic acid, geniposide 이다. geniposidic acid(PubChem CID:443354, purity 98.2%, Wako , Osaka, Japan)는 약 2.14 mg에 메탄올(Honeywellinternational, Morris Plains, USA) 10 ml을 넣은 후 5분간 초음파 추출 후 0.22 μm HLB-M 멤브레인 필터(FUTECS, Daejeon, Korea) 하여 geniposidic acid 표준액으로 사용하였다. geniposide(PubChem CID:107848, purity 98.3%, Aladdin reagent , Shanghai, China)는 약 2.09 mg에 에탄올(Honeywellinternational, Morris Plains, USA) 10 ml을 넣은 후 5분간 초음파 추출 후 0.22 μm HLB-M 멤브레인 필터 하여 geniposidic acid 표준액으로 사용하였다. 분석용 UPLC 는 Waters system H Class 를 사용하였고 Waters Acquity UPLC HSS T3 column(100 mm x 2.1 mm, 1.8 μm, Milford, MA, USA) 를 분석용 컬럼으로 사용하였다. 이동상 용매는 0.1% TFA(A) 및 Acetonitrile(0.1%TFA, B) 를 사용하였으며, 용매의 농도구배는 0->20분(5->80%, B) 이다. 유속은 0.5 mL/min, 컬럼 온도는 30℃ 였으며 검출은 240nm에서 수행하였다.

세포 생존율 평가

YD-38 세포를 96-well plate에 1 × 10⁴ cells/well이 되도록 분주하여 37℃, 5% CO₂ incubator에서 24시간 동안 배양 후 EU 추출물을 농도별로 처리하여 24시간 배양하였다. 세포 생존율 평가를 위하여 well당 10 μL의 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) MTT; Sigma-Aldrich CO., Louis, MO, USA)용액을 5 mg/mL 첨가하여 4시간 동안 반응시켰다. MTT 시약의 첨가로 생성된 formazan을 녹이기 위해서 dimethyl sulfoxide(Sigma-Aldrich Co.)를 100 μL씩 첨가하고 1시간 후 microplate reader를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.

Nitric oxide (NO) 생성능

YD-38 세포를 96-well plate에 1 × 10⁴ cells/well이 되도록 분주하여 37℃, 5% CO₂ incubator에서 24시간 동안 배양 후 치주질환 염증을 유발시키기 위해 P.gingivalis-LPS(LPS-PG)을 20 μg/mL의 농도로 처리하여 염증을 유발 시키고 EU 추출물을 농도별로 처리하였다. 24시간 후에 배양 상등액 100 μL를 취하여 96 microplate로 옮긴 후 100 μL Griess Reagent(1% sulfanilamide, 0.1% napthyl-ethylenediamine dihydrochloride/2.5% H₃PO₄)를 넣고 10분간 실온에서 방치한 후 ELISA reader를 사용하여 흡광도 540 nm에서 측정하였다. Sodium nitrite 표준검량선으로부터 흡광도 값을 넣어 NO 생성능을 계산하였다.

RNA 분리

YD-38 세포를 6-well plate에 1 × 10⁶ cells/well이 되도록 분주하여 37℃, 5% CO₂ incubator에서 24시간 동안 배양 후 치주질환 염증을 유발시키기 위해 P. gingivalis-LPS(LPS-PG)을 20 μg/mL의 농도로 처리하여 염증을 유발 시키고 EU 추출물을 농도별로 처리하였다. 24시간 후에 PBS로 2회 세척 후 RNA를 추출하기 위하여 Trizol reagent(Invitrogen Co., Carlsbad, CA) 300 μL를 넣고 scraper로 모아 균질화한 후 상온에 5분간 방치 후 tube에 넣은 뒤 chloroform(Sigma-Aldrich CO., Louis, MO, USA)을 200 μL 분주하여 섞어주고 12,000 rpm에서 15분간 원심분리 한다. 투명한 상층부를 취하여 새로운 튜브에 옮긴 다음 동일양의 isopropanol(Sigma-Aldrich CO., Louis, MO, USA) 200 μL 을 넣고 섞어준 뒤에 상온에서 5분간 방치한 다음 12,000 rpm으로 15분간 원심분리를 하였다. pellet을 확인 한 후 용액을 걷어낸 후 75% 에탄올을 1 mL 넣어 세척하고 12,000 rpm으로 10분간 원심분리를 한 후 에탄올을 제거하고 이 작업을 2회 반복 후 에탄올을 완전히 제거하기 위해 Hood 안에서 pellet을 말린 후 DEPC-Water(Sigma-Aldrich CO., Louis, MO, USA) 20 μL를 넣어준 다음 nano drop에 RNA 1 μL를 260 nm, 280 nm에서의 흡광도를 측정하여 total RNA 양을 정량하였다.

Real-Time PCR

RNA는 2μg/μL의 양으로 정량 한 후 cDNA synthesis mix 4 μL, RTase 1 μL를 넣고 nuclease free water로 20 μL로 맞춘뒤 simpliamp thermal cycler(Applied biosystem, USA)을 이용하여 42℃에서 30분, 72℃에서 10분간 반응시켜 cDNA를 합성시켰다. 그 후 cDNA와 ROX가 포함된 2× SYBR green mix, primer를 각각 넣어 quant studio 3 real-time PCR(Applied biosystem, USA) 기기를 이용하였다. PCR 조건은 50℃ 2분, 95℃ 10분간 pre-denaturation 후 95℃ 15초, 60℃ 1분, 72℃ 40초를 40 cycles 수행하였다. Internal standard로 GAPDH를 사용하여 target gene의 relative quantitative (RQ)는 real-time PCR analysis software로 분석하였다.(table I)

Table Ⅰ. Primer sequences of the Real-Time PCR

통계처리

실험 결과는 3회 반복하였으며, 가장 대표적인 실험결과를 평균±표준편차(mean ± S.E.M)로 나타내었고, 유의 수준은 #p<0.05, *p<0.05와 **p<0.01로 Student t′-test를 실시한 결과를 표시하였다.

결과 및 고찰

지표성분 분석 결과

HPLC 분석결과 두충의 지표성분 geniposidic acid의 함량은 6.07% geniposide의 함량은 3.31%이었다.(Fig. 1).

Fig. 1. UPLC chromatograms of Eucommia ulmoides Oliv. Bark (EU) extract. Column,Waters Acquity UPLC HSS T3 (100 mm x 2.1 mm, 1.8 μm, Milford, MA, USA); column temperature, 30℃; mobile phase, water(0.1% phosphoric acid)-acetonitrile as mobile phase in gradient manner (0-20min, 5-80% acetonitrile; post-run time, 5min); flow-rate, 0.5ml/min detected wavelength: 240nm.

MTT 세포 생존율 측정

EU 추출물의 세포독성을 측정하기 위해 YD-38 세포에 EU 추출물을 50, 100 μg/mL의 농도로 처리 후 24시간 뒤에 MTT 용액을 이용하여 세포 생존율을 평가하였다(Fig. 2). EU 추출물을 농도별로 처리하였을 때 유의적인 변화가 나타나지 않았으므로 YD-38 치주세포의 세포독성에 영향을 미치지 않은 것으로 판단되었다.

Fig. 2. Cell viability of Eucommia ulmoides extract on YD-38 cells. cells were treated with EU 50, 100 μg/mL for 24 h. Cell viability was determined by the MTT assay. Values are mean±S.E.M (n=4).

NO 분비 억제에 의한 항염증 효과

초기 염증에 관여하는 NO는 주로 LPS 또는 TNF-α 등의 염증 유발 물질에 의해 자극된 세포가 염증을 유발할 때 분비하는 염증반응 매개물질로 알려져있다. 이와 같은 NO의 생성은 L-arginine의 guanidino nitrogen이 산화에 의해 L-citrulline으로 변화하는 L-arginie-nitric oxide 경로를 통하여 생성되는데, 대식세포, 호중구 등의 면역세포와 섬유모세포, 혈관의 평활근, 및 기도 상피세포에 있는 inducible nitric oxide synthase(iNOS) 효소의 활성에 의해 NO가 다량 생성되며 염증 반응을 증가시킨다고 알려져 있다. 본 연구에서는 EU 추출물의 항염증 효과를 확인하기 위하여 치주질환에서 치주염증을 일으키는 P. gingivalis-LPS(LPS-PG)를 이용하여 YD-38 잇몸상피세포에 염증을 유발한 뒤 EU 추출물을 처리하여 NO 생성의 조절을 확인하였다. 그 결과 LPS-PG 대비 EU 추출물 처리 시 NO 생성이 감소되는 것을 확인하였다(Fig. 3.). MTT 로 세포독성을 확인 한 후 세포독성이 없는 범위 내에서 NO를 확인함으로서 세포독성은 없으면서 염증을 억제시키는 효과가 있는지 확인하였다.

Fig. 3. The effect of EU on the production of NO by YD-38 cells in the presense of LPS-PG. YE-38 cells were treated with EU 50, 100 μg/mL in the presence of LPS-PG (20 μg/mL) for 24 h. The 24 hrs-conditioned media were collected for NO₂- assay. The results are mean±S.E.M of triplicated from a representative experiment (#p<0.05; significantly different from the control, *p<0.05, **p<0.01; significantly different from the LPG-PG-treated group).

치주질환의 염증성 사이토카인 유전자의 발현

치주질환의 염증에 관여하는 염증 물질인 LPS-PG를 치주세포인 YD-38 세포에 처리하여 염증을 유발 한 뒤 EU 추출물을 농도별로 처리한 결과 치주질환에 관련된 염증성 사이토카인의 mRNA 발현을 확인하였다. 치주질환에 관련된 염증성 사이토카인으로는 IL-8과 IL-6, TNF-α, COX-2와 염증매개인자로 알려진 NO생성을 억제함으로써 EU의 항염증 효과를 확인하고자 하였다. 잇몸상피세포주에 LPS-PG에 의해 증가된 IL-8, IL-6, TNF-α, COX-2의 발현을 EU 추출물 처리시 대조군 대비 감소시키는 결과를 나타냈다(Fig. 4). 본 실험의 결과로 잇몸세포의 염증을 EU 추출물이 감소시킴으로써 EU 추출물의 항염증 효과를 확인 할 수 있었다.

Fig. 4. Expression of IL-8, IL-6, TNF-α, COX-2 mRNA by real-time PCR. YD-38 cells were treated with EU 50, 100 μg/mL in the presence of LPS-PG (20 μg/mL) for 24 h. The control group was cultured without LPS-PG. The levels of IL-8 (A), IL-6 (B), TNF-α (C), COX-2 (D) mRNA expression were measured by quantitative real-time PCR. The expression was normalized as a ratio using GAPDH (house keeping gene). Values are expressed as mean±S.E.M of triplicated from a representative experiment (#p<0.05; significantly different from the control, *p<0.05, **p<0.01; significantly different from the LPG-PG-treated group).

결론

본 연구는 두충 추출물의 치주염개선 효과를 측정하기 위하여 인간 아랫잇몸상피세포인 YD-38 세포를 이용하여 치주염에 염증을 일으키는 유발 물질인 LPS-PG로 염증반응을 유발한 뒤 두충 추출물에 대한 염증성 사이토카인의 발현 정도를 평가하였으며, 염증매개인자인 NO, 염증성 cytokines인 IL-8, IL-6, TNF-α, COX-2의 발현 조절을 함으로써 치주세포 염증에 대한 항염증 효과를 확인하였다. 두충 추출물의 치주염 관련 인자의 발현을 억제함으로써 치주질환에 대한 치약 및 개선 소재로 사용될 수 있음을 시사한다고 할 수 있다.