Journal of Physiology & Pathology in Korean Medicine (동의생리병리학회지)

The Physiological Society of Korean Medicine and The Society of Pathology in Korean Medicine (대한동의생리학회·한의병리학회)
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Effects of Juglans regia Complex Extract on Osteoclast Differentiation from Bone Marrow Derived Macrophage

호두복합추출물이 골수유래대식세포의 파골세포 분화에 미치는 효과

  • Kong, Hae Jin (Department of Acupuncture & Moxibustion Medicine, College of Korean Medicine, Daejeon University) ;
  • Kang, Jae Hui (Department of Acupuncture & Moxibustion Medicine, College of Korean Medicine, Daejeon University) ;
  • Ryu, Hwa Yeon (Department of Acupuncture & Moxibustion Medicine, College of Korean Medicine, Daejeon University) ;
  • Lee, Hyun (Department of Acupuncture & Moxibustion Medicine, College of Korean Medicine, Daejeon University)
  • 공해진 (대전대학교 한의과대학 침구학교실) ;
  • 강재희 (대전대학교 한의과대학 침구학교실) ;
  • 유화연 (대전대학교 한의과대학 침구학교실) ;
  • 이현 (대전대학교 한의과대학 침구학교실)
  • Received : 2019.03.08
  • Accepted : 2019.06.08
  • Published : 2019.06.25
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Abstract

The purpose of this study was to evaluate the inhibitory effects of Juglans regia complex extract(JCE) consisted of Juglans regia, Eucommia ulmoides, Eleutherococcus senticosus and Zingiber officinale on osteoclast differentiation. Cell toxicity test by using CCK-8, TRAP activity and TRAP positive multi-nucleated cell counting were performed to evaluate inhibitory effect on differentiation of osteoclast from bone marrow derived macrophages(BMMs) induced by receptor activator of nuclear $factor-{\kappa}B$ ligand(RANKL). As a result, JCE inhibited RANKL-induced osteoclast differentiation in BMMs dose-dependently without cytotoxicity. These results suggest that JCE may have a potential role for treating bone lytic diseases such as osteoporosis.

Keywords

서 론

세계보건기구(World Health Organization ; WHO)에서는 골다공증을 미세구조의 이상과 골량의 감소를 특징으로 하여 뼈가 약해지는 결과로 골절이 발생하기 쉬운 상태가 되는 전신적인 골격계질환으로 정의하고 있다1). 건강보험심사평가원 자료에 따르면 골다공증(M81 병적 골절을 동반하지 않은 골다공증)으로 병의원에 내원한 환자 수는 2013년 744,820명에서 2017년 855,764명으로 증가 추세에 있다2). 2012년 국민건강영양조사에서 50세 이상 성인에 있어서 골다공증 유병률이 남성 7.8%, 여성 34.9% 로 높았으나, 이에 대한 인지도는 남성 10.6%, 여성 24.0%, 치료율은 남성9.1%, 여성 11.6% 로 여성에 있어 특히 낮은 경향을 보였다3).

뼈는 조골세포에 의해 골 생성, 그리고 파골세포에 의한 골 파괴 및 골 흡수가 지속적으로 발생하는 역동적인 조직이다. 따라서뼈의 항상성을 유지하기 위해서는 조골세포와 파골세포 간의 균형이 중요하며 이 균형의 붕괴는 골절과 같은 뼈 질환을 쉽게 초래하게 된다. 노령화에 의한 이러한 조골세포와 파골세포 간의 균형의 붕괴는 파골세포의 뼈 파괴 능력이 조골세포의 뼈 형성 능력보다 과도해져 항상성이 깨어지는 것으로 인해 발생하게 된다4). 그러므로 노령화에 따른 골 질환 발생에 있어 예방 및 치료 방법으로 조골세포의 뼈 형성 촉진보다 파골세포에 의한 골 흡수 억제가 더 중요하다 할 수 있다5). 특히, 폐경 후 여성은 체내의 에스트로겐 호르몬 감소로 골 흡수 억제가 줄어들고, 장에서는 칼슘의 흡수가 감소하여 현저한 골 소실이 일어나 골절의 위험이 크게 증가하므로골 흡수 억제가 임상적으로 중요하다6).

파골세포는 골 내막에 위치하며 골 조직에 존재하는 유일한 다핵세포로 단핵-탐식세포 계통의 조혈전구세포에서 분화된다. 파골세포로의 분화는 실제적인 골 흡수에 있어 매우 중요한 과정 중 하나이며, 이를 매개하는 주요한 신호물질은 Receptor activator of nuclear factor-κB ligand(RANKL)이다7). RANKL은 파골세포의 분화, 생존, 다핵화 그리고 활성화에 총체적인 역할을 하는 신호물질로 tumor necrosis factor(TNF)계열의 사이토카인이다. 이는 수용체인 receptor activator of nuclear factor-κB(RANK)와 결합하여 TNF receptor associated factor 6(TRAF6)를 활성화하고, 이는 nuclear factor of activated T cells cl(NFATc1), nuclear factor-κB(NF-κB) 등과 같은 전사인자를 활성화시켜 파골세포의 분화과정이 진행될 수 있게 한다. 따라서 RANKL 신호과정의 각 단계를 차단함으로써 과도한 파골세포 형성을 억제시키는 것이 골다공증에 대한 치료적 접근이라 할 수 있다8).

현재 임상에서는 골다공증을 치료하기 위해 bisphosphonate,칼시토닌, 부갑상선호르몬 등과 같은 약물들을 사용하고 있으며, 이 중 bisphosphonate 계열의 약물이 가장 대표적으로 사용되고 있다9) . 그러나 최근 소화기관의 궤양, 염증, 하악골 괴사 등과 같은많은 부작용이 보고되고 있다10,11). 그로 인해 제한된 임상적 사용이 발생함에 따라 부작용을 최소로 하는 골다공증 치료제로써 한약제재들에 대한 관심이 높아지고 있다. 국내에서는 황금12), 두충13), 오가피14) 등 단일 한약재의 파골세포에 대한 연구가 있으나, 한약복합제제를 통한 연구는 아직 부족한 실정이다.

이에 본 연구에서는 파골세포 분화에 효과가 있다고 밝혀진 단일 한약재 중 호두, 두충, 오가피, 생강을 사용하여 단독 추출물 및 복합 추출물의 파골세포 분화 억제 효과를 알아보고자 하였다. 이를 위해 세포독성 측정에서 안전성을 확인한 후, TRAP activity, TRAP 활성세포 염색 세포 수 측정 실험을 시행하여 유의성 있는 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.

재료 및 방법

1. 재료

1) 약재

실험에 사용된 호두(Juglans regia), 두충(Eucommia ulmoides), 오가피(Eleutherococcus senticosus), 생강(Zingiber officinale), 호두복합추출물(호두1:두충1:오가피1:생강1)은 한약규격품을 대전대학교 본초학교실에서 감정한 후 분쇄하여 시료 제조에 사용하였으며 대표적 한약공급업체인 옴니허브(Korea)에서 구입해정선하여 사용하였다.

2) 실험재료 및 기기

실험에 사용된 10% fetal bovine serum(FBS), phosphate buffer saline(PBS), antibiotics (Penicillin/Streptomycin), M-CSF, α-minimum essential medium(α-MEM), red blood cell lysis buffer(RBC lysis buffer), 10% formaldehyde, 4-nitrophenylphosphatedisodium salt, 10 mM tartrate, 50 mM citrate buffer(pH4.6) 그리고 0.1N-NaOH는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)사의 제품을 사용하였다. M-CSF(60 ng/㎖), RANKL(100 ng/㎖) 그리고 cell counting kit-8 (CCK-8)는 R&D system(Minneapolis, MN, USA)사의 제품을 사용하였다. TRAP은 KAMIYA BIOMEDICAL COMPANY(Seattle, WA 98168, USA)사의 제품을 사용하였다. 흡광도 측정기는 Molecular Devices(CA, USA)사의 제품을 사용하였다.

2. 실험방법

1) 시료 제조

생강을 제외한 각각의 약재를 100 g 정량 후 1ℓ의 30% 에탄올에 30분 동안 sonication하였다. 각각 분쇄된 약재 100 g 을 환류추출기(heating Mantle, MS-DM609/20L)를 사용하여 45℃에서 30% 에탄올을 1ℓ 가하여 60분 추출한 후 다시 70% 에탄올 1ℓ를 가하여 같은 조건으로 60분 동안 재탕하였다. 그 후 감압증류기(N-1200A, EYELA. CO. LTD, Japan)를 이용하여 유기용매를 제거하는 농축과정을 거치고, 동결건조기(PF-10/ALPHA 1-2LD, Germany)를 통하여 건조된 호두 추출물(JSE) 3.828 g(수득률3.8%), 두충 추출물(ECE) 1.308 g(수득률 1.3%), 오가피 추출물(ACE) 1.716 g(수득률 1.7%), 호두복합추출물(JCE, 호두1:두충1:오가피1:생강1) 1.419 g(수득률 1.4%) 을 수득하였다.

2) 파골세포 분화

수컷 6-7 주령 ICR 마우스(Orient Bio Inc.)의 경골 및 대퇴골로부터 골수 세포를 분리하고 골수 유래 대식세포(Bone marrow-derived macrophages ; BMMs)를 사용하였다. BMMs는 10% FBS, Antibiotics(Penicillin, Streptomycin) 및 M-CSF(30 ng/㎖)를 함유하는 α-MEM에서 배양되고 유지되었다. 파골 세포 분화에 대한 JSE, ECE, ACE, JCE의 효과를 측정하기 위해 M-CSF (60 ng/㎖)와 RANKL(100 ng/㎖)을 첨가한 BMMs(96-well plate에 1x104 cells/well)을 4일 동안 배양하였다.

3) 세포 독성 측정

BMMs를 96-well plate에 1x104 cells /well로 분주하고 M-CSF (60 ng/㎖)를 처리한 후 JSE, ECE, ACE, JCE를 농도별로 첨가하여 4일간 배양하였다. 그 후 각각의 well에 CCK-8 용액을 처리하고, 2시간 동안 배양한 후 Molecular Devices(CA, USA)를 이용하여 450 ㎚에서 흡광도를 측정하여 Cell viability를 평가하였다.

4) TRAP Activity 측정

TRAP 효소 활성을 특이적으로 측정하기 위해서 RBC lysis buffer로 세포를 파괴하고, 추출물에 존재하는 phosphatase 활성을 tartrate 존재 하에 측정을 시행하였다. 효소의 활성은 p-nitrophenylphosphate을 기질로 하여 형성된 p-nitrophenol의 양을 흡광도를 이용하여 측정하였다. 96-well에 4×103 cells/well로 cell을 접종하고 분화인자와 시료를 처리하여 4일간 배양하였다. 배양 후 PBS로 세척한 다음 10% formaldehyde로 cell을 고정하여 기질용액(1.36 ㎎/㎖ 4-nitrophenyl phosphate disodium salt, 10 mM tartrate, 50 mM citrate buffer(pH4.6))을 분주하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 효소 반응액을 새로운 plate에 옮기고 0.1N-NaOH로 반응을 중지시켜 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

5) TRAP 활성세포 염색 세포 수 측정

파골세포를 분화시킨 후 일정 면적 내에 존재하는 3개 이상의핵을 포함하면서 TRAP 양성인 세포 수를 측정함으로써, 파골세포의 분화정도를 측정하였다. 세포를 10% formaldehyde으로 고정하고, 활성화된 TRAP 염색 kit를 이용하여 TRAP 양성 세포로 염색하였다. JSE, ECE, ACE, JCE를 농도별로(3.125 ㎍/㎖, 6.25 ㎍/㎖, 12.5 ㎍/㎖, 25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖, 400㎍/㎖, 800 ㎍/㎖) 처리 후, 신선한 배지 및 각 추출물 처리를 매3일마다 교체하고 TRAP 염색을 통해 파골 세포 분화를 관찰하였다. 현미경 관찰(배율, × 40)에서 TRAP 양성 다핵 세포 수를 세어파골 세포로 간주하였다.

6) 대조군 및 실험군 설정

모든 실험에서 JSE, ECE, ACE, JCE를 처리하지 않은 non treated group을 대조군으로 설정하여 0으로 명하였다. 실험군은 총 9군으로 각각의 추출물을 농도별(3.125 ㎍/㎖, 6.25 ㎍/㎖, 12.5 ㎍/㎖, 25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖, 400 ㎍/㎖, 800 ㎍/㎖)로 처리하였으며, 각 군을 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200, 400, 800으로 명하였다.

7) 통계분석

정량적인 결과는 평균값과 표준편차로 표시하였다. 세포 독성 측정의 경우 통계적인 차이는 Studentʹs t-test를 이용하여 분석하였고 p 값이 0.05 이하인 경우 통계적으로 유의한 것으로 간주하여 별표(*)로 표시하였다. TRAP activity 및 TRAP 활성세포 염색 세포 수 측정의 경우 Studentʹs t-test를 이용하여 분석한 후,Bonferroni 보정을 통해 p 값이 0.05 이하인 경우 통계적 유의한 것으로 간주하여 별표(*)로 표시하였다.

결 과

1. 파골세포에 대한 세포독성

CCK-8을 이용하여 JSE, ECE, ACE, JCE를 농도별로 처리하여 세포독성을 측정하였다. ECE, ACE, JCE처리군 중 모든 농도에서 세포독성이 발현되지 않았으나, JSE 처리군 중 200 ㎍/㎖, 400㎍/㎖, 800 ㎍/㎖ 농도에서 대조군에 비해 각각 72.84%, 57.44%, 27.48% 의 생존율 감소를 보여 대조군에 비해 유의성 있는 세포독성이 나타났다(p<0.05, p<0.01)(Fig. 1).

Fig. 1. Effect of JSE, ECE, ACE, JCE on cell cytotoxicity. BMMs were treated with various concentration of JSE, ECE, ACE, JCE. BMMs were cultured 4 days with M-CSF(60 ng/㎖) in the presence or absence of JSE, ECE, ACE, JCE. The cell viability was evaluated by CKK-8 as described in materials and methods. Data are expressed as the percentage of control. Values are means ± SD of duplicate. (A) : JSE, (B) : ECE, (C) : ACE, (D) :JCE. (*p<0.05, **p<0.01 compare to control)

2. RANKL에 의해 유도된 파골세포 분화 억제효과

JSE, ECE, ACE, JCE의 파골세포 분화에 대한 효과를 알아보기 위하여 마우스로부터 분리한 대식세포에 JSE, ECE, ACE, JCE 를 농도별로 처리하고 RANKL로 파골세포로의 분화를 유도하였다. 그 결과, JSE, ECE, ACE, JCE 처리군 모두에서 대조군에 비해 유의성 있게 RANKL에 의해 유도된 파골세포의 분화를 농도 의존적으로 억제하였다.

1) TRAP Activity 측정

대조군에 비해 JSE, ECE, ACE, JCE 처리군 모두 파골세포의 분화 억제에 영향을 주는 것으로 나타났다(p<0.05, p<0.01, p<0.005). JSE 및 ECE 처리군의 경우 50 ㎍/㎖ 이상의 농도에서, 대조군에 비해 유의성 있는 TRAP 활성을 줄이는 것으로 나타났다(p< 0.005). ACE 및 JCE 처리군의 경우 25 ㎍/㎖ 이상의 농도에서 대조군에 비해 유의성 있는 TRAP 활성 감소 효과가 있는 것으로 나타났다(p<0.01, p<0.05, p<0.005). 이 중 ACE 처리군에서 가장 우수한 TRAP 활성 감소 효과가 나타났다(p<0.01, p<0.005)(Fig. 2).

Fig. 2. Effect of JSE, ECE, ACE, JCE on TRAP activity of BMMs induced by RANKL. BMMs were treated with various concentration of JSE, ECE, ACE, JCE. BMMs were cultured 4 days with M-CSF(60 ng/㎖) in the presence or absence of JSE, ECE, ACE, JCE. TRAP activity were measured using absorbance. The absorbance were measured at 450 nm using a microplate reader. (A) : JSE, (B) : ECE, (C) : ACE, (D) : JCE. (*p< 0.05, **p< 0.01, ***p<0.005 compare to control)

2) TRAP 활성세포 염색 세포 수 측정

파골세포를 분화시킨 후 일정 면적 안에 존재하는 3개 이상의핵을 포함하면서 TRAP 양성인 세포 수를 측정함으로써, 파골세포의 분화 억제 효과를 측정하였다. JSE, ECE, ACE, JCE 처리군에서 IC50(Half maximal inhibitory concentration) 값이 각각 13.52 ㎍/㎖, 37.49 ㎍/㎖, 12.05 ㎍/㎖, 25.40 ㎍/㎖ 으로 확인되었다. JSE, ECE, ACE, JCE 처리군 모두에서 대조군에 비해 유의성 있는 파골세포의 분화를 억제 효과로 농도 의존적으로 파골세포의 수를 감소시키는 것으로 나타났다(p<0.05, p<0.01, p< 0.005). 특히 ACE 처리군이 가장 우수하게 파골세포 분화를 억제하는 결과를 보였다(Fig. 3, Fig. 4).

Fig. 3. Inhibition effect on osteoclast differentiation by JSE, ECE, ACE, JCE BMMs were cultured for 4 days with M-CSF(60 ng /㎖) and RANKL(100 ng /㎖) in the presence or absence of JSE, ECE, ACE, JCE. After 4 days cells were fixed in 10% formalin and stained for TRAP. TRAP-positive cells containing three or more nuclei were counted as multi-nucleated osteoclast. Values are means ± SD of duplicates. (A) : JSE, (B) : ECE, (C) : ACE, (D) : JCE. (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.005 compare to control) MNCs N. : Multi-Nucleated Cells Number

Fig. 4. JSE, ECE, ACE, JCE suppresses RANKL-induced osteoclast differentiation. Osteoclast precursors were cultured with M-CSF(60 ng /㎖) and RANKL(100 ng /㎖) for 4 days in the presence or absence of JSE, ECE, ACE, JCE. After 4 days, cells were fixed in 10% formalin and stained for TRAP. Values are means ± SD of duplicates. Scale bar: 500 ㎛. (A) : JSE, (B) : ECE, (C) : ACE, (D) : JCE.

3) 세포독성과 TRAP activity 비교

세포독성 실험과 TRAP activity 실험을 비교하여 보았을 때,JSE 처리군에서는 세포독성이 발생하였으나(Cell viability IC50 :899 ㎍/㎖), ECE, ACE, JCE 처리군에서는 세포독성이 발생하지 않았다. TRAP activity 실험에 있어서 cell viability IC50값이 JSE 처리군은 13.52 ㎍/㎖, ECE 처리군은 37.49 ㎍/㎖, ACE 처리군은 12.05 ㎍/㎖, JCE 처리군은 25.40 ㎍/㎖으로 실험군 모두에서 대조군에 비해 유의성 있는 파골세포 분화 억제효과가 나타났다(Fig. 5).

Fig. 5. Combination graph of cell viability and TRAP activity of JSE, ECE, ACE, JCE on osteoclast induced by RANKL.

고 찰

골다공증은 노년에 특별한 임상 증상이 없어 쉽게 간과되어 골절의 위험성을 증가 시킬 수 있어, 심각한 상황을 야기 시킬 수 있는 질환이다. 골절이 발생하면 통증이 심할 뿐만 아니라 골절 부위를 일정기간 고정하여야 하며, 유합 이후에도 기능회복이 제한되는 경우 일상생활 활동에도 지장을 초래하며, 사회적인 고립감과 우울, 삶의 질 저하가 초래될 수 있다15). 특히 고관절 골절은 65세 이상에서 사망률이 급증하게 되는 골절 질환 중 하나로16), 이를 통해 골다공증으로 인해 야기되는 문제의 심각성을 알 수 있다.

골다공증은 원인에 따라 크게 두가지로 분류할 수 있는데, 45∼ 70세에 폐경으로 인해 에스트로겐의 분비가 감소되면서 나타나는 폐경기 후 골다공증(제 1형)과 60세 이상에게 있어 노령으로 안한노인성 골다공증(제 2형)의 일차적 골다공증과, 혈액종양질환이나 스테로이드 사용, 내분비질환, 골 기질 생성 장애, 기계적 불용이나 고정, 비타민 D의 대사장애, 영양결핍 등에 의해서 나타나는 이차적 골다공증이 있다17,18).

파골세포는 뼈의 조직에 존재하는 유일한 다핵세포로 뼈의 내막에 위치하며, 흡수가 일어나는 뼈의 표면에 근접하게 있어 주름의 형태를 보이게 된다. 또한 TRAP을 가지며 산 생성이 활발한 특성을 가진다19). 파골세포는 골수 내의 조혈 단핵세포로부터 유래하고, 이 단핵전구세포는 혈액내로 순환하며, 뼈의 내막층에서 전구세포들이 증식하여 다핵세포를 형성하기 위해 융합되고 뼈를 흡수하는 것으로 알려져 있다20). 파골세포가 조혈기관 기원인 바를활용하여 다수의 파골세포를 얻기 위해서 골수세포 배양이 널리 이용되고 있다. 이러한 골수세포 배양시 관찰되는 다핵세포는 TRAP 양성반응을 나타내는데, 이러한 특성이 다른 뼈의 조직세포와 파골세포를 구별할 수 있는 세포화학적 표지효소로 이용할 수 있게 된다21).

호두는 性은 溫하고, 味는 甘한 약재로써, 腎臟을 補하여 허리와 무릎을 강건하게 하여 腎虛腰痛을 치료하며22), 조골세포를 활성화시켜 뼈 손실을 방지하는 효과가 있다고 보고되고 있다23).

두충은 性은 溫하고, 味는 甘微辛한 약재로써, 肝臟과 腎臟을補益하여 근육과 뼈를 튼튼하게 하고 허리와 무릎을 강건하게 하여 허리와 무릎의 시린 통증과 힘이 없는 것을 치료하며22), 두충 물추출물이 파골세포의 분화 및 활성, 골 흡수의 억제효과가 있다고 알려져 있다13).

오가피는 性은 溫하고, 味는 辛苦한 약재로써, 肝臟과 腎臟을溫補하여 뼈와 근육을 강건하게 하는 효능으로 근육과 뼈가 약해진것을 치료한다22). 오가피 물 추출물은 골수유래 대식세포 유래 파골세포의 분화 억제효과 및 난소적출로 인한 골다공증에서의 골 손상 억제 효과에 대해 보고되었다14,24).

호두, 두충, 오가피, 생강으로 구성된 호두복합추출물의 파골세포 분화 억제 효과를 보기 위해 본 연구에서는 마우스의 골수유래 대식세포를 M-CSF와 RANKL이 함유된 배지에서 파골 전구세포로 배양하여 세포독성 평가와 TRAP 활성세포에서 TRAP activity 및 활성세포 염색 세포 수 측정 실험을 실시하였다.

세포독성 평가는 M-CSF와 RANKL을 처리하여 BMMs로 분화한 배지에서 JSE, ECE, ACE, JCE를 3.125 ㎍/㎖, 6.25 ㎍/㎖, 12.5 ㎍/㎖, 25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖, 400 ㎍/㎖, 800 ㎍/㎖ 의 농도로 첨가하여 CCK-8을 사용하여 측정하였다. JSE를 제외한 실험군에서는 세포독성이 나타나지 않았으나, JSE 처리군에서는 200 ㎍/㎖ 처리군에서 72.84%의 생존율을 보여대조군에 비해 유의성 있는 세포독성이 나타났으며(p<0.05), 400㎍/㎖ 처리군에서 57.44%, 800 ㎍/㎖ 처리군에서 27.48%의 생존율로 유효성 있는 세포독성이 나타났다(p<0.01). 반면, ECE, ACE, JCE 처리군에서는 모든 농도에서 세포독성이 나타나지 않았다. JSE를 포함하는 JCE 처리군에서 세포독성이 나타나지 않은 것은 한약재간의 상호작용으로 인한 효과로 사료된다.

TRAP activity 평가 역시 세포독성 평가와 같은 BMMs 분화배지를 이용하여 JSE, ECE, ACE, JCE를 3.125 ㎍/㎖, 6.25 ㎍/㎖, 12.5 ㎍/㎖, 25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖, 400㎍/㎖, 800 ㎍/㎖ 의 농도로 첨가한 후 TRAP으로 염색하여 측정하였다. JSE, ECE, ACE, JCE 처리군 모두에서 대조군에 비해 유의성 있는 파골세포 분화 억제 효과가 나타났다(p<0.05, p<0.01, p<0.005). 특히 ACE 처리군에서 IC50값이 12.05 ㎍/㎖ 로 파골세포 분화 억제에 가장 효과적인 것으로 나타났다.

현미경으로 TRAP으로 염색한 파골세포의 다핵세포의 수를 측정하여 JSE, ACE 처리군에서는 50 ㎍/㎖ 의 농도에서부터, ECE, JCE 처리군에서는 100 ㎍/㎖ 의 농도에서부터 다핵세포가 관찰되지 않아 JSE, ECE, ACE, JCE 처리군 모두에서 대조군에 비해 유의성 있는 파골세포 분화 억제 효과가 나타났다. 그러나 JSE 처리군의 경우 cell viability IC50값이 13.52 ㎍/㎖ 으로 세포독성으로 인한 파골세포 분화 억제효과가 발생했을 가능성도 있을 것이라 사료된다.

이상의 결과를 종합해보면, JSE 처리군에서는 200 ㎎/㎖, 400 ㎎/㎖, 800 ㎎/㎖ 농도에서 세포독성이 나타난데 비해, JCE을 처리한 군의 경우 세포독성이 나타나지 않는 것으로 보아 한약재의 상호작용으로 단일 물질보다 복합물질에 있어 더욱 안전한 것으로 사료된다. 또한 JSE, ECE, ACE, JCE 처리군 모두에서 대조군에 비해 유의성 있는 파골세포 분화 억제 효과가 있어, 향후 이 약재들이 골다공증 예방 및 치료에 활용될 가능성을 확인하였다. 향후 호두복합추출물로 골다공증 관련 연구를 시행할 때, 파골세포 분화 억제에 가장 우수한 효과를 보였던 오가피의 용량에 따른 효과, 파골세포 분화 억제와 관련된 유전자의 탐색, 조골세포에 미치는 영향 등을 고려한 심도 있는 연구가 필요할 것으로 사료된다.

결 론

수컷 6-7 주령 ICR 마우스(Orient Bio Inc.)의 경골 및 대퇴골로부터 골수 세포를 분리하고 BMMs를 이용하여 호두, 두충, 오가피 단독 및 호두복합추출물(호두, 두충, 오가피, 생강)이 파골세포 분화 억제에 미치는 영향을 알아보기 위해 세포독성, TRAP activity와 TRAP 활성세포 염색 세포 수 측정을 시행하여 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.

세포독성 측정 실험을 시행하여 호두복합추출물 처리군에서 세포독성이 발현되지 않았다. 두충, 오가피 단독 처리군에서 세포독성이 나타나지 않았으나, 호두 단독 처리군 중 일부 농도에서 세포독성이 나타났다.

TRAP activity 측정 실험을 시행하여 호두, 두충, 오가피, 호두복합추출물 처리군 모두에서 대조군에 비해 유의성 있는 파골세포 분화억제 효과를 확인하였다.

TRAP 활성세포 염색 세포 수 측정 실험을 시행하여 호두, 두충, 오가피, 호두복합추출물 처리군 모두에서 대조군에 비해 유의성 있는 파골세포 분화억제 효과를 확인하였다.

세포독성 측정 실험과 TRAP activity 측정 실험을 종합하여 볼 때, 호두복합추출물 처리군은 세포독성 없이 농도 의존적으로 파골세포 분화를 억제하는 것으로 나타났다.

References

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