The Korea Journal of Herbology (대한본초학회지)

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Investigation of the effect of Terminalia chebula fruit extract and its active ingredient, gallic aicd on muscle differentiation

가자(訶子) 추출물과 그 유효성분 갈산이 근분화에 미치는 영향

  • Cheon, Seonghye (Department of Biochemistry, Chungnam National University) ;
  • Lee, Hyo Seong (Department of Biochemistry, Chungnam National University) ;
  • Han, Hyo Sang (Department of Health Administration, Joongbu University) ;
  • Kim, Kee Kwang (Department of Biochemistry, Chungnam National University)
  • Received : 2019.01.04
  • Accepted : 2019.03.25
  • Published : 2019.03.30
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Abstract

Objectives : Decrease in muscle mass and loss of muscle function due to aging are associated with various diseases. As interest in healthy aging increases, efforts to prevent and treat muscle hypoxia as an illness are increasing. Considering the physical limitations, a pharmacologic approach to the treatment of myopenia is needed. Methods : Terminalia chebula Rets has a wide range of pharmacological effects and is used as a medicinal product in traditional medicine. However, the drug effect on the treatment of muscle disorders has not been revealed. The purpose of this study was to evaluate the value of water extract of Terminalia chebula (WETC) as a therapeutic agent to relieve symptoms of muscle hypoxia. Results : WETC showed strong radical scavenging ability. In addition, WETC increased cell activity of myoblast, and we observed that WETC induces myoblast differentiation by immunoblot analysis using differentiation protein markers as well as cell morphology of myoblast. Based on these results, we examined the effect of chebulic acid, chebulagic acid, gallic acid, geraniin, and punicalagin on cell activity and differentiation of myoblasts. Gallic acid significantly increased cell activity of myoblast, and it was found to be an effective substance which not only induces myoblast differentiation but also promotes proliferation. Conclusions : We suggest that the WETC with antioxidant effect and its indicator gallic acid on cell activity, proliferation and differentiation of myoblast can be studied and developed as a food and medicine for prevention and treatment of various muscle diseases.

Keywords

Ⅰ. 서론

訶子는 新修本草에 처음 收載되었으며, 임상에서 斂肺, 澀腸, 降火利咽의 효능이 있어 久咳失音, 久瀉, 脫肛, 便血, 崩漏, 帶下, 遺精, 尿頻數의 증상을 치료하는 데 사용되고 있다1).訶子는 대한민국 약전에 가자 (訶子) Terminalia chebulaRetzins 또는 융모가자 (絨毛訶子) Terminalia chebulaRetzins var. tomentella Kurt. (사군자과 Combretaceae)의 잘 익은 열매라고 收載되어 있다2). 訶子는 triterpene,gallyl glucose 및 gallic acid 등을 함유하고 있다. Tannin으로 chebulagic acid, chebulinic acid, chebulic acid,glucogallin, chebulin 등을 함유한다. Triterpenoids로terminoic acid, arjugenin, arjunoic acid, chebupentol 등이 있다. 그 외에 Shilimic acid, quinic acid, ethyl gallate,daucosterol, \(\beta\)-sitosterol을 함유한다. Sennoside A,tannase, polyphenol oxidase, oxidase, ascorbic acidoxidase 등을 함유하고 있다. 이외에 Se, K, Mg, Fe와 Cu 등의 미량원소와 비타민 C 등을 함유하고 있다3). 訶子의 약리작용으로는 항균활성4-6), 항돌연변이 유발효과7), 간섬유화 억제활성8), 항당뇨활성9, 10), 암세포성장 억제11-13), 항염활성14)등의 여러 연구들이 보고되었다.

근육은 뼈를 보호하고 체형을 바르게 유지시켜 주며 칼슘유입을 촉진시켜 골 밀도를 높여 주는 기능을 한다. 근형성(myogenesis)은 근육조직이 형성되는 과정으로 근원세포(myoblast)의 분화를 통해 이루어진다. 근형성 과정에서myoblast는 말단이 분화하여 긴 관성형의 근세포 (myocyte)가 되고, 분화된 myocyte는 세포막 융합을 통해 다핵성세포인 근관세포 (myotube)를 형성한다15, 16). 근육조직이 외상과근육위축병 (muscular dystrophy)과 같은 질병에 노출되면위성세포 (satellite cell) 상태로 증식하고 있던 myoblast가분화와 융합을 통해 손상된 부위의 근육을 치유하고 재생시킨다. 따라서 myoblast의 분화 및 융합은 배아 발달 과정에서의근육 형성뿐만 아니라 성인의 골격근을 유지하고, 복구하는데중요한 역할을 한다. 때문에 다양한 동물 모델에서 myoblast의 배양 시스템을 구축하고 이를 이용한 근육의 증식과 분화에 관련된 연구의 필요성이 강조되고 있으며, 퇴행성 근육 질환의 치료를 위한 연구와 전임상 시험에 myoblast가 실제로사용되며 연구되고 있다17-19).

근육 감소증은 근육 섬유가 지방으로 대체되고 근육 내에과도한 섬유성 결합조직이 형성됨에 따라 근골격의 크기 및질량이 감소하고 근력의 세기가 약해지는 현상이다20). 건강한성인의 경우 골격근의 합성 및 분해가 균형적으로 유지되지만연령이 높아짐에 따라 그 균형이 유지되지 못하며 근육 조직의 질량과 근력의 감소 현상이 나타난다21-24). 이를 바탕으로근육 감소증은 노화와 밀접한 관련이 있다고 알려져 있으며,실제로 60~70세의 5~13%, 80세 이상의 50% 인구가 근육감소증을 겪고 있다25). 인구 고령화와 함께 건강한 노화에 대한 관심이 높아지고 있다. 근육 감소증은 근육 대사의 변화에의한 근육 기능 상실을 야기할 뿐만 아니라 산화적 스트레스의 유발, 신경접합부의 변성을 통해 고령층의 신체 활동 장애를 초래하고 다양한 질병의 발병 및 질병의 예후에도 큰 영향을 미친다20). 노령화된 환자들에게 근육 감소증의 극복을 위한 운동 요법은 물리적인 한계가 존재한다. 따라서 질병의 진전을 늦추거나 그 영향을 부분적으로 극복할 수 있는 영약학적 연구와 치료 약물 개발의 필요성이 대두되고 있다.

천연물의 생리활성에 대한 관심이 증대되고 있는 가운데소재물질을 탐색하고, 이를 식･의약품에 실용화하기 위한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 한의학에서 다양한 질병의 치료제로 사용되는 訶子 추출물은 항산화 효능26), 생체 내에서노화의 방지, 궤양 형성의 억제, 심혈관 보호 및 상처 치유 효과를 가지고 있다27, 28). 현재 訶子 추출물의 구성 물질은 가수분해성 탄닌류의 gallic acid, chebulagic acid, punicalaginmcorilagin과 페놀류의 chebulic acid, ellagic acid, 이외에도gerannin 등이 알려져 있다29). Gallic acid의 항산화, 항균,항바이러스 및 세포보호활성 효능30)과 chebulinic acid,tannic acid, ellagic acid의 암세포 성장 억제 효과가 입증되며11) 訶子 추출물뿐만 아니라 그 구성 물질이 가지는 생리학적 활성에 대한 영향과 이를 바탕으로 한 연구가 활발하게 이루어지고 있다. 하지만 訶子 추출물 및 그 구성 물질과 근육의 증식과 분화와의 관련성에 대해서 연구된 바가 없다. 따라서 본 연구에서는 myoblast 세포를 이용하여 높은 항산화 효능을 가진 訶子 열수 추출물 (WETC)이 근육세포의 활성과분화에 미치는 영향을 확인하였고, WETC의 구성 물질로 알려진 단일 화합물 가운데 근육의 증식 및 분화에 영향을 미치는 유효 물질을 조사하여 유의미한 결과를 얻었기에 이에 보고하는 바이다.

Ⅱ. 재료 및 방법

1. 재료

1) 약재

실험에 사용된 訶子는 한약 제약 회사 (Jeong-SeongDrugstore, Korea)로부터 2018년 8월에 구매 (NO:2018-0815)하여 기원의 진위와 품질의 우열을 가천대학교 한의과대학 본초학교실에서 감정하였고, 약재는 ultrasonic cleaner를 이용하여 불순물을 제거하고 실험에 사용하였으며 실험에사용된 WETC의 구성 물질은 chebulic acid, chebulagicacid, punicalagin, gallic acid (Sigma Aldrich, USA);chebulic acid (ChemFaces); geraniin (Dalian MeilunBiotech Co., Ltd, China)를 통해 개별 구매하여 실험에 사용하였다.

2) 시약 및 기기

본 실험을 위해서 Ham's F-10 medium (WELGENE,Korea), Dulbecco's modified Eagle medium (WELGENE,Korea), calf serum (Hyclone, USA), horse serum(Gibco, USA), 100 U/mL penicillin, 100 ㎍/mLstreptomycin (WELGENE, Korea), filter paper (AdvantecNo.2, Japan), DPBS (Corning, USA), Versene (Gibco,USA), potassium persulfate (Sigma, USA), ABTS (Sigma,USA), MTS solution (Promega, USA), anti-Pax-3/7(Santa Cruz Biotechnology, USA), anti-Myh3 (SantaCruz Biotechnology, USA), anti-GAPDH (Meridian lifeScience/Meridian Bioscience, USA), Horseradishperoxidase-conjugated secondary antibodies (Abcam,USA), 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; Thermo-Fisher Scientific, USA) 등이 사용되었다. 본 실험에 사용된기기는 CO2 incubator (Thermo Fisher Scientific), waterbath(HAAKE, Germany), automaticnon-pressurepot (DaeꠓWoong, Korea), filterpaper (AdvantecNo.2, Japan),rotary vacuum evaporator (Eyela,Japan), 동결건조기(IlshineBioBase, Korea), ultrasonic cleaner (Branson,USA), microplate reader (Molecular Devices EMax Plus,USA), LSM 510 Live Configuration Vario Two VRGBconfocal laser-scanning microscope (Carl Zeiss, Germany)등 이다.

2. 방법

1) 訶子 열수추출물 제조

訶子 약재를 100 g으로 중량을 측정한 뒤 분쇄하였다.Automatic non-pressure pot에 분쇄된 약재와 1차 증류수2,000 ml와 함께 넣어주고 탕액이 끓는 시점으로부터 2 h 동안 가열하여 추출하였다. Filter paper로 추출액을 감압 여과하여 얻은 여과액을 rotary vacuum evaporator를 이용하여농축하였다. 농축액은 동결건조기를 이용하여 건조한 분말을제작하였고, 동결건조 추출물은 11.584 g으로 측정되었으며,수율은 11.584%였다.

2) 세포 배양

실험에 사용한 myoblast는 생후 3일 된 C57BL/6의 뒷다리 골격근에서 분리하여 배양하였다. Myoblast는 Ham'sF-10 medium에 10% calf serum, 1% 항생제 (100 U/mLpenicillin, 100 ㎍/ml streptomycin), 2.5 ㎍/ml fibroblastgrowth factor를 첨가한 growth medium 또는 Dulbecco’smodified Eagle medium에 1% horse serum, 1% 항생제(100 U/mL penicillin, 100 ㎍/ml streptomycin)를 첨가한differentiation medium에 배양하였다. 세포는 표준 세포 배양법인 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.

3) 항산화 효능 측정

ABTS (2,2'-azino-bis-3-ethylbenzothi`azoline-6-sulphonic acid) assay를 이용하여 측정하였다. Freeradical 상태의 ABTS를 만들기 위해 potassium persulfate2.4 mM과 ABTS 7 mM을 같은 부피로 혼합해주고 실온에서차광된 상태로 24 시간 반응시켰다. 그 후 free radical 상태의 ABTS를 증류수로 희석하여 흡광도가 0.7 부근이 되는working solution을 만들어 실험에 사용하였다. 96-wellplate의 각 well에 sample 20 ㎕와 ABTS working solution80 ㎕를 넣어준 뒤, 4 분간 암실에서 반응시키고 Microplatereader를 이용하여 650 nm에서 흡광도를 측정하였다. 아래식을 이용하여 항산화 효능을 계산하였다.

\(ABTS\ radical\ scavenging\ activity (\%)=(1- \left.\frac{A_{\text {Sample}}-A_{\text {Samplebank}}}{A_{\text {Blank}}}\right) \times 100 \)

4) 세포 생존율 평가

3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfo phenyl)-2H-tetrazolium, innersalt (MTS) assay를 통해 측정하였다. 96-well plate에 분주한 myoblast에 시료를 농도별로 처리한 뒤 24 h 동안 배양하였다. 그 후 각 well에 MTS solution을 20 ㎕ 첨가하여 37℃에서 90 min 동안 반응시키고, microplate reader를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정 하였다. 세포 생존율은 대조군 대비 시료를 처리한 세포의 흡광도를 백분율로 표시하여나타내었다.

\(세포 생존율 (\%) = \left(\frac{\text { 시료첨가군의 흡광도-시로자체의 흡광도 }}{\text { 대조군의 흡광도 }}\right) \times 100\)

5) 면역 블롯 분석

Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electropꠓhoresis (SDS-PAGE)를 이용하여 myoblast로부터 얻은 단백질 샘플을 분리하였다. 분리된 단백질을 nitrocellulosemembrane상으로 이동시키고, non-fat dry milk를 5% 농도로 PBST에 녹인blocking buffer 와 1 h 동안 처리하여 비특이적인 항체의 결합을 억제시켰다. Blocking buffer에 희석한 1차 antibody를 4℃에서 12 h 동안 처리한 후, 단백질과결합하지 않은 antibody는 PBST로 세척하였다. Super Signalsystem을 이용하여 Horseradish peroxidase-conjugatedsecondary antibodies에 결합하여 얻어진 신호를 확인하였다. 면역 블롯 분석에 사용한 1차 antibody의 종류는antiꠓPax-3/7, anti-Myh3, anti-GAPDH이다.

6) 면역 형광 현미경 분석

면역 형광 현미경 분석을 위해 myoblast를 chamber slide에 분주하였다. 세포에 시료를 정해진 농도 및 시간으로 처리한 뒤, 4% paraformaldehyde를 이용하여 10 min 동안 고정시키고 0.5% Triton X-100가 포함된 PBS를 15 min 동안처리하였다. 이 후 비특이적인 항체 결합을 억제하기 위해blocking buffer (PBS, 5% goat serum, 0.1% BSA.0.05% Tween 20)를 상온에서 1 h 동안 처리한 후 blockingbuffer에 희석한 anti-Myh3를 4℃에서 12 h 동안 반응시켰다. Mouse IgG에 대한 2차 antibody로는 Alexa Fluor488-conjugated goat antibody를 사용하였고, 세포핵은DAPI로 염색하였다. LSM 510 Live Configuration VarioTwo VRGB confocal laser-scanning microscope를 통해면역 형광을 분석하고 이미지화 하였다.

Ⅲ. 결과

1. WETC의 항산화 효능 평가

본 연구에서는 ABTS assay를 통해 WETC의 항산화 효능을 평가하였다. 항산화 효능이 잘 알려진 resveratrol을 양성대조군으로 사용하였고, 10, 100 M에서 각각 11.51±0.27%, 76.11±0.39%를 보인 resveratrol의 항산화 효능을 바탕으로 실험의 신뢰성을 검증하였다. WETC의 항산화 효능을 평가한 결과 10 ㎍/ml에서 29.42±0.2.81%, 25 ㎍/ml에서63.40±1.55%, 50 ㎍/ml에서 94.12±0.10%의 라디칼 소거능을 나타내며 농도 의존적인 항산화 효능을 확인하였다.

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Figure 1. Anti-oxidant activities of the resveratrol and WETC by ABTS assay. n=3 (biological replicates). Average±S.E.M.

2. WETC에 의한 myoblast의 분화 유도 확인

본 연구에서는 항산화 효능을 가진 WETC가 근육의 성장 및분화에 미치는 영향을 알아보고자 하였다. 먼저, myoblast에WETC가 미치는 영향을 확인하기 위하여 증식하고 있는 생존가능한 세포의 수와 세포 독성 또는 화학 감수성 분석용으로보편적으로 사용되는 MTS assay를 수행하였다. MTS assay는 tetrazolim salt가 미토콘드리아에서 생성되는 NADH,NADPH에 의해 formazan으로 바뀌고, 이 formazan을 490nm 흡광도로 측정하여 세포 생존율을 확인하는 방법이다31).MTS assay 결과, 0.05 mg/ml에서는 124.20±1.52%, 0.1mg/ml에서는 134.91±2.99%, 0.2 mg/ml에서는 143.78±2.45%의 세포 생존율을 보이며 WETC의 처리에 의해myoblast의 세포 생존율이 증가하는 것을 확인하였다 (Figure2A). Myogenesis 과정에서 myoblast는 myocyte로 분화한뒤 융합하여 다핵성 세포인 myotube를 형성한다15, 16).Myoblast의 세포 생존율을 증가시킨 WETC를 myoblast에0.1 mg/ml로 처리하고 세포의 모양을 관찰한 결과, 시간이지남에 따라 myoblast가 긴 관상형의 세포인 myocyte의 형태로 변화하는 것을 관찰하였다 (Figure 2B). 이 후, 면역 블롯 분석을 통해 WETC에 의한 myoblast의 형태 변화가myocyte로의 분화 유도에 의한 현상인지 조사하였다.myoblast에 0.1 mg/ml의 WETC를 24, 48 h 동안 처리한후 면역 블롯 분석을 통해 Pax-3/7과 Myh3 단백질의 발현을 비교한 결과, WETC의 처리에 의해 Pax-3/7의 발현이 감소하고 Myh3 단백질의 발현이 증가하며 WETC가 myoblast의 분화를 유도하는 것을 확인하였다 (Figure 2C).

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Figure 2. Effect of WETC on the differentiation of myoblasts. (A) Myoblast were treated with indicated concentrations of WETC for 24 h. Cell viability was measured by MTS assay. (B, C) Myoblast were treated with 0.1 ㎍/mlWETC for 24, 48 h. (B) The morphology of cells was photographed at the indicated times. (C) Immunoblot analysis was performed using anti-Pax-3/7, anti-Myh3; GAPDH was served as control.

3. WETC의 구성 물질이 Myoblast의 분화에 미치는 영향 검증

이 전 연구를 통해 myoblast의 세포 생존율을 증가시키며분화를 유도하는 WETC의 효능을 검증하였다. WETC의 구성 물질들 가운데 myoblast 세포의 세포 생존율의 증가와 분화를 유도하는 대표적인 유효물질이 무엇인지 확인하기 위한실험을 수행하였다. Chebulic acid, chebulagic acid, gallicacid, geraniin, punicalagin은 WETC의 대표적인 구성 물질로 알려져 있다. Myoblast에 다섯 가지 구성 물질을 농도별로 24 h 동안 처리한 후 MTS assay를 통해 세포 생존율을측정한 결과, 5가지 구성 물질에 의해 myoblast의 세포 생존율이 모두 증가한 것을 확인하였다. 특히, gallic acid를 처리한 myoblast의 경우 10 ㎍/ml에서 133.08±1.84%, 20 ㎍/ml에서 159.69±2.49%, 40 ㎍/ml에서 181.00±3.15%의세포 생존율을 보이며 myoblast의 세포 생존율이 가장 크게 증가하였다. Myooblast에 20 ㎍/ml의 농도의 다섯 가지 구성 물질을 48 h 동안 처리한 후 면역 블롯 분석을 통해myoblast의 Pax-3/7과 Myh3 단백질 발현 변화를 확인하였다. 그 결과, chebulagic acid, gallic acid, geraniin에 의해myoblast의 myh3 발현이 증가하며 분화를 유도하는 구성 물질을 검증하였다. 더불어, gallic acid와 geraniin를 처리한myoblast의 경우 Myh3 뿐만 아니라 Pax-3/7의 발현도 증가하였다. 이는 gallic aicd와 gerannin은 myoblast의 생리활성에 관여하여 myoblast의 증식과 분화를 모두 촉진한다는것을 의미한다.

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Figure 3. Effect of the constituents of WETC on differentiation of myoblast. (A) myoblast were treated with indicated concentrations of the constituents of WETC for 24 h. Cell viability was measured by MTS assay. (B) myoblast were treated with 20 ㎍/ml WETC constituents for 48 h, and immunoblot analysis was performed using anti-Pax-3/7, anti-Myh3; GAPDH was served as control.

4. Gallic acid가 myoblast의 분화에 미치는 영향 확인

WETC의 다섯 가지 구성 물질 가운데 gallic acid는myoblast의 세포 활성을 가장 크게 증가시키며, 분화 유도와함께 증식을 촉진하는 효능을 가지는 것을 앞 선 결과를 통해확인하였다. WETC의 유효물질 중 가장 효과가 뛰어난 단일화합물인 gallic acid가 근육의 증식과 분화에 관여하는 생리활성 효능을 추가적인 실험을 통해 검증하였다. Myoblast에gallic acid를 48 h 동안 농도별로 처리하였고, 면역 블롯 분석을 통해 단백질의 발현 변화를 확인한 결과 Pax-3/7과 Myh3의 발현이 모두 농도 의존적으로 증가하며 myoblast의증식과 분화를 촉진하는 gallic acid의 효능을 확인하였다.Myoblast는 배양 배지의 변화를 통해 증식과 분화 환경을 각각 조성할 수 있다. 본 실험에서는 myoblast에 differentiationmedium (D.M.)을 48 h 동안 처리하여 분화를 유도하였다.또한 gallic acid에 의한 myoblast 분화 유도 효과를 확인하기 위해 growth medium (G.M.)에 gallic acid를 20 ㎍/ml로 희석하여 48 h 동안 처리하였다. 각각의 조건하에서myoblast의 Myh3 단백질의 발현 변화를 면역 형광 분석을통해 시각화하여 비교한 결과, D.M. 조건 하에서 분화를 유도한 myoblast는 control에 비해 Myh3의 발현이 크게 증가하였고, 세포 융합이 일어나 다핵성의 myotube가 형성된 것이 관찰되었다. 그리고 gallic acid를 처리한 myoblast에서는control 보다 Myh3의 발현이 증가하며 myoblast의 분화를유도하는 gallic acid의 면역 블롯 분석 결과를 재확인 하였다. 더불어, D.M. 조건하에서 형성된 myotube는 관찰되지않았지만 Myh3의 발현이 긴 관상형의 myocyte 형태와 유사하게 확인되었다.

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Figure 4. Effect of gallic acid on differentiation of myoblast. (A) myoblast were treated with indicated concentrations of gallic acid. Immunoblot analysis was performed using anti-pax-3/7, antimyh3; GAPDH was served as control. (B) myoblast were cultured in 20 ㎍/ml gallic acid or in differentiation media (D.M) for 48 h, and subjected to immunofluorescence. Myh3 (green) was visualized in the immunofluorescence image. DAPI (blue) was used for nuclear staining.

Ⅳ. 고찰

노화에 따른 근육 위축증은 산화적 스트레스, 염증, 내분비계의 비활성화, 영양 부족 등 다양한 요인과의 상호작용을 통해 발생한다. 그 중 산화적 스트레스는 세포 내 신호 전달 경로에 영향을 미쳐 단백질의 합성과 분해의 불균형을 초래하고, 세포 사멸을 유도하며 근육량의 손실을 일으키는 요인이된다32, 33). 최근 산화적 스트레스에 의해 근육 단백질의 합성을 자극하는 류신의 활성이 저해된 늙은 쥐에 항산화 물질을투여한 경우 근육 단백질 대사가 개선되었다는 연구 결과가있다34). 이처럼 산화적 스트레스에 의한 근육 감소증을 완화하기 위한 항산화 물질의 검증과 연구는 매우 중요하다.

한의학에서 訶子는 탁월한 약리학적 효능으로 의약의 왕이라 불리며 다양한 질병의 치료에 사용되고 있으며 訶子의열매, 뿌리, 잎 등 모든 기관들의 약용 가치가 잘 알려져 있다. 訶子를 열수 추출한 WETC의 대표적인 구성 성분에는chebulic acid, chebulagic acid, gallic acid, geraniin,punicalagin가 있다35). WETC가 myoblast의 세포 생존율과근육의 분화에 미치는 효과를 근육 감소증의 예방 및 치료 분야에 적용하여 연구 및 개발하기 위해서는 WETC의 다양한유효 성분 중 단일 화합물에 대한 연구가 필요하다.

본 연구에서는 ABTS assay를 통해 WETC의 항산화 효능을 평가하였고, 항산화 효능이 잘 알려진 resveratrol을 양성대조군으로 사용하여 10 ㎍/ml, 25 ㎍/ml, 50 ㎍/ml에서 라디칼 소거능을 나타내며 농도 의존적인 항산화 효능이 있음을확인하였다.

항산화 효능을 가진 WETC가 근육의 성장 및 분화에 미치는 영향을 알아보고자, WETC에 의한 myoblast의 변화를MTS assay 통해 확인하였다. 그 결과, 0.05 mg/ml, 0.1mg/ml, 0.2 mg/ml에서 세포 생존율을 보이며 WETC의 처리에 의해 myoblast의 세포 생존율이 증가하는 것을 확인하였다. Myoblast의 세포 생존율을 증가시킨 WETC를 myoblast에 0.1 mg/ml로 처리하고 세포의 모양을 관찰한 결과, 시간이 지남에 따라 myoblast가 긴 관상형의 세포인 myocyte의 형태로 변화하는 것을 관찰하였으며, myoblast에 0.1 mg/ml의 WETC를 24, 48 h 동안 처리한 후 면역 블롯 분석을 통해Pax-3/7과 Myh3 단백질의 발현을 비교한 결과, WETC의처리에 의해 Pax-3/7의 발현이 감소하고 Myh3 단백질의 발현이 증가하며 WETC가 myoblast의 분화를 유도하는 것을확인하였다.

Chebulic acid, chebulagic acid, gallic acid, geraniin,punicalagin은 WETC의 대표적인 구성 물질로 Myoblast에다섯 가지 구성 물질을 농도별로 24 h 동안 처리한 후 MTSassay를 통해 세포 생존율을 측정한 결과, gallic acid를 처리한 myoblast의 경우 10 ㎍/ml, 20 ㎍/ml, 40 ㎍/ml에서 세포 생존율을 보이며 myoblast의 세포 생존율이 가장 크게 증가하였으며 Myooblast에 20 ㎍/ml의 농도의 다섯 가지 구성물질을 48 h 동안 처리한 후 면역 블롯 분석을 통해 myoblast의 Pax-3/7과 Myh3 단백질 발현 변화를 확인한 결과,chebulagic acid, gallic acid, geraniin에 의해 myoblast의myh3 발현이 증가하며 분화를 유도하는 구성 물질을 검증하였으며, gallic acid와 geraniin를 처리한 myoblast의 경우 Myh3 뿐만 아니라 Pax-3/7의 발현도 증가하였다.

후기 발달 단계에서 골격근 내 위성세포는 MyoD, Myf5,myogenin 와 같은 근육 전사인자의 발현을 조절하는 전사인자인 Pax-3와 Pax-7을 발현을 통해 출생 후의 근육 성장및 근육의 재생을 조절한다. Myoblast에서 Pax-3와 Pax-7의 발현은 분화를 억제하고 증식을 촉진한다36). Myh3는myotube에서 가장 많이 발현되는 단백질 중 하나로 ATP의가수분해를 통해 근육의 수축에 관여하는 단백질로 myoblast가 분화함에 따라 그 발현이 증가한다37). 따라서 두 단백질은myoblast의 분화를 확인할 수 있는 마커 단백질로 사용된다.

WETC의 다섯 가지 구성 물질 가운데 gallic acid는 비만과 연관된 동맥 경화증의 발병 기전에 중요한 역할을 하는 혈관 평활근의 증식을 억제한다는 연구 결과가 있다38). 본 연구에서는 골격근의 증식과 분화에 미치는 gallic acid의 생리활성효능을 검증하였고, 그 결과 myoblast의 Pax-3/7과 Myh3의 발현이 모두 농도 의존적으로 증가하며 myoblast의 증식과 분화를 촉진하는 gallic acid의 효능을 확인하였다. 또한본 실험에서는 myoblast에 differentiation medium (D.M.)을 48 h 동안 처리하여 분화를 유도한 결과 D.M. 조건 하에서 분화를 유도한 myoblast는 control에 비해 Myh3의 발현이 크게 증가하였고, 세포 융합이 일어나 다핵성의 myotube가 형성된 것이 관찰되었다. 그리고 gallic acid를 처리한myoblast에서는 control 보다 Myh3의 발현이 증가하며myoblast의 분화를 유도하는 gallic acid의 면역 블롯 분석결과를 재확인 하였다. 더불어, D.M. 조건하에서 형성된myotube는 관찰되지 않았지만 Myh3의 발현이 긴 관상형의myocyte 형태와 유사하게 확인되었다. 그러므로 이러한 결과는 Gallic acid는 근육의 분화를 촉진하여 근육 감소증의 증상 가운데 근육의 크기와 질량의 증가에 직접적인 도움을 준다. 더불어myoblast의 세포 생존율을 증가시키고, 증식 자체를 촉진하여 근육 조직을 형성할 수 있는 잠재능력도 향상시키며 gallic acid는 근육 감소증의 치료뿐만 아니라 예방을 위한 약물의 개발에도 적용할 수 있음을 시사한다.

질병을 예방하고 치료하는 식･의약품의 개발에 천연 유래물질의 생리 활성을 이용하기 위해서는 질병의 근본적인 원인과 함께 천연 유래물질이 표적으로 하는 기작에 대한 연구가필요하다. 따라서 노화와 근육 감소증의 상관관계와 더불어WETC와 gallic acid가 myoblast의 증식과 분화에 관여하는구체적인 기작에 대한 심화 연구가 수행되어 진다면 새로운건강 기능 식품과 의약품으로 개발될 수 있는 가치가 있다고생각되는 바이다.

Ⅴ. 결론

본 연구에서 訶子 열수 추출물(WETC)이 항산화 효능 및myoblast의 세포 활성 증가 그리고 면역 블롯 분석을 통해WETC의 처리에 의해 myoblast의 분화 마커 단백질의 발현변화를 관찰하여 다음과 같은 결론을 얻었다.

1. ABTS assay를 통해 WETC의 라디칼 소거능을 나타내며농도 의존적인 항산화 효능이 있음을 확인하였다.

2. WETC가 근육의 성장 및 분화에 미치는 영향을 알아보고자 myoblast의 세포 생존율의 변화를 관찰하기 위해 MTSassay를 수행한 결과 농도 의존적으로 세포 생존율을 보이며 WETC의 처리에 의해 myoblast의 세포 생존율이 증가하는 것을 확인하였다.

3. myoblast에 WETC를 처리하고 세포의 모양을 관찰한 결과, 시간이 지남에 따라 myoblast가 긴 관상형의 세포인myocyte의 형태로 변화하는 것을 관찰하였으며, 면역 블롯 분석을 통해 Pax-3/7의 발현이 감소하고 Myh3 단백질의 발현이 증가하며 WETC가 myoblast의 분화를 유도하는 것을 확인하였다.

4. WETC의 대표적인 구성 물질 중 gallic acid를 처리한myoblast의 경우 농도의존적으로 세포 생존율을 보이며myoblast의 세포 생존율이 가장 크게 증가하였으며 면역블롯 분석을 통해 myoblast의 Pax-3/7과 Myh3 단백질발현 변화를 확인한 결과, chebulagic acid, gallic acid,geraniin에 의해 myoblast의 myh3 발현이 증가하며 분화를 유도하는 구성 물질을 검증하였으며, gallic acid와geraniin를 처리한 myoblast의 경우 Myh3 뿐만 아니라Pax-3/7의 발현도 증가하였다.

5. myoblast에 differentiation medium (D.M.)을 48 h 동안 처리하여 분화를 유도한 결과 control에 비해 Myh3의발현이 크게 증가하였고, 세포 융합이 일어나 다핵성의myotube가 형성된 것이 관찰되었고 gallic acid를 처리한myoblast에서는 control 보다 Myh3의 발현이 증가하며myoblast의 분화를 유도하는 gallic acid의 면역 블롯 분석 결과를 재확인 하였으며 Myh3의 발현이 긴 관상형의myocyte 형태와 유사하게 확인되었다.

향후 WETC가 노화와 다양한 질병의 원인이 되는 활성 산소를 제거하고, 근육의 대사과정에 관여하여 건강한 근육을합성함으로써 근육 감소증을 치료할 수 있는 효능에 대한 보다 깊은 연구가 필요한 것으로 생각되는 바이다.

감사의 글

이 논문은 충남대학교 자체연구비 지원에 의해 수행되었습니다.

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