Microbiology and Biotechnology Letters (한국미생물·생명공학회지)

The Korean Society for Microbiology and Biotechnology (한국미생물·생명공학회)
권호 표지
DOI QR코드

DOI QR Code

Purification and Characterization of a Lipolytic Enzyme Produced by Aeromonas hydrophila PL43

Aeromonas hydrophila PL43이 생산하는 지질분해 효소의 정제 및 특성

  • Received : 2016.04.01
  • Accepted : 2016.04.27
  • Published : 2016.06.28
Download PDF
⟨ Previous Next ⟩

Abstract

A bacterial strain, producing an excellent lipolytic enzyme, was isolated from the intestinal tracts of an earthworm (Eisenia fetida). The strain was identified as Aeromonas hydrophila by phenotypic, chemotaxonomic characteristics and 16S ribosomal DNA analysis, and was designated as Aeromona hydrophila PL43. The lipolytic enzyme from A. hydrophila PL43 was purified via 35−45% ammonium sulfate precipitation, DEAE-sepharose fast flow ion-exchange, and sephacryl S-300HR gel filtration chromatography. The yield of the purified enzyme was 3.7% and 2.5% of the total activity of crude extracts with p-nitrophenyl butyrate (pNPB) and p-nitrophenyl palmitate (pNPP) as substrates, respectively. The molecular weight of the purified enzyme was approximately 74 kDa using gel filtration, sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), and zymography. The optimal activity of purified enzyme was observed at 50℃ and pH 8.0 using pNPB, and 60℃ and pH 8.0 using pNPP. The purified enzyme was stable in the ranges 20− 60℃ and pH 7.0−10.0. The activity of purified enzyme was inhibited by PMSF, pepstatin A, Co2+, Cu2+, and Fe2+, but was recovered by metal chelating of EDTA. The Km and Vmax values of the purified enzyme were 1.07 mM and 7.27 mM/min using pNPB and 1.43 mM and 2.72 mM/min using pNPP, respectively.

지렁이의 장내로부터 분리한 미생물 중에서 지질을 가수분해하는 활성이 높은 미생물을 선발하였으며, 동정하여 Aeromonas hydrophila PL43으로 명명하였다. A. hydrophila PL43이 생산하는 지질분해 효소의 정제는 황산암모늄 침전, DEAE-sepharose FF 이온교환 크로마토그래피, Sepharose S-300HR 겔 크로마토그래피 단계로 수행하였으며 최종적으로 정제한 지질분해 효소는 p-nitrophenyl butyrate (pNPB)를 기질로 사용했을 때, 84.5배로 정제되었고 효소 활성의 회수율은 3.7%이었다. p-nitrophenyl palmitate (pNPP)를 기질로 사용했을 때에는 56.6배로 정제되었고 효소 활성의 회수율은 2.5%이었다. SDS-PAGE를 수행한 결과, A. hydrophila PL43이 생산하는 지질분해효소의 분자량은 약 74 kDa으로 추정되었다. 지질분해 효소의 pH에 대한 영향은 pNPB와 pNPP 기질에서 pH 8.0에서 최대활성이 보였고 pH 7.0−10.0에서 안정하였다. pNPB를 기질로 사용한 경우에는 50℃에서 pNPP를 기질로 사용한 경우는 60℃에서 최대 활성을 나타냈으며, 정제한 지질분해 효소는 20−60℃에서 안정성을 나타내었다. 정제한 지질분해효소는 금속이온 Co2+, Cu2+, Fe2+에 의해서 효소활성이 억제되었으며, EDTA의 metal chelating에 의해 활성이 회복되었다. Inhibitor에 의한 저해는 효소 활성부위의 serine 잔기와 결합하여 효소 활성을 억제하는 PMSF에서 가장 우수하였으며 효소 활성부위의 aspatyl 잔기에 결합하여 효소활성을 억제하는 pepstatin A는 농도가 높아짐에 따라 효소활성을 저해하였다. 따라서 정제한 지질분해 효소는 활성부위에 serine 잔기와 aspartyl 잔기가 있는 것으로 사료되었다. 정제한 지질분해 효소의 Km 값과 Vmax 값은 pNPB를 기질로 사용 했을 때 Km 값과 Vmax 값은 1.07 mM과 7.27 mM/min이고, 기질이 pNPP일 때 Km 값과 Vmax 값은 1.43 mM 과 2.72 mM/min이었다.

Keywords

서론

지렁이는 토양 내 유기물의 혼합과 분해, 토양의 화학적 조성 변화를 통해 비옥한 환경을 만든다. 유기물을 자체적으로 소화하거나 영양분으로 분해 및 흡수하는 소화기능이 덜 발달된 지렁이는 장 내에 공생하는 다양한 미생물이 소화나 생리적인 기능에 많은 영향을 주는 것으로 보고되었다[7]. 최근에는 지렁이를 이용한 퇴비화(vermicomposting)로 유기물의 빠른 안정화, 악취제거, 분변토를 이용한 단백질 자원이나 토양 개량제 개발 등의 많은 친환경적인 연구가 진행되고 있다.

현재까지 알려진 4,000여종의 효소 중 산업적으로 이용되는 대부분의 효소는 미생물이 생산하고 있다. 산업의 발달로 기존의 화학제제에서 생화학적인 기전을 가지는 효소로 전환하는 노력이 이루어지고 있으며, 그 중에서 지질분해 효소는 세제산업(생물 계면활성제), 식품산업(유리지방산 증가, 풍미증진), 석유화학 산업(지방산 제조), 유가공산업, 제지산업, 화장품산업, 제약산업(소화보조제) 등에서 광범위하게 사용되고 있다.

지질분해 효소에는 esterase (EC 3.1.1.1)와 lipase (triacylglycerol acyl hydrolase, EC 3.1.1.3) 등이 있으며, triglyceride의 carboxylic ester 결합을 가수분해하여 diacylglycerol, monoacylglycerol, glycerol과 fatty acid의 생성을 촉진하는 효소로써 carboxylic ester hydrolase (EC 3.1.1)에 속한다[3]. 지질분해 효소는 일반적으로 활성부위에 serine, histidine, aspartic acid가 존재하며[5], 특히 대부분의 세균은 nucleophile elbow라 불리는 Gly-X1-Ser-X2-Gly서열을 보존부위(conserved motif)로 가지는데 X1은 histidine이나 tyrosine, X2는 glutamic acid, aspartic acid, methionine, leucine으로 알려져 있다[22, 26]. 지질분해 효소에 의한 ester bond의 절단은 우선적으로 활성부위의 serine이 기질과 반응을 하고 charge-relay system에 의해 활성부위의 다른 두 아미노산이 연쇄반응을 하며, serine의 hydroxyl group (-OH)이 acylation 된다[20].

지질분해 효소는 주로 세포 외 효소로 분비되며 다양한 동·식물뿐만 아니라 세균, 효모, 곰팡이 등의 미생물에서 생산된다. 특히 미생물의 지질분해 효소는 기질특이성, 최적온도 및 안정성, 최적 pH 및 안정성 등이 다양하며 유기용매에서도 활성을 보유하여 에스터화 반응(esterification)을 포함하는 다양하고 유용한 반응을 촉매하므로 산업적인 응용가능성이 높다[4,12]. 분자생물학의 발달로 재조합 기술이 발전함에 따라 효소의 대량생산이 용이해졌고, 지질분해 효소의 이용은 기존 식품산업의 향미 개발뿐만 아니라 석유화학, 세제산업, 유지공업, 화학산업, 환경산업, 화장품산업, 제약산업 등의 분야로 확대되고 있으며, 유류로 오염된 토양이나 폐수, 폐기물 등의 처리에도 많은 연구가 진행되고 있다.

본 연구는 지질분해 활성이 높은 미생물을 지렁이 장 내에서 분리 및 동정하였고, 분리 미생물이 생산하는 지질분해 효소의 정제 및 이화학적 특성을 규명함으로써 다양한 산업에 적용할 수 있는 기초 자료를 마련하고자 하였다.

 

재료 및 방법

미생물 분리 및 배지

지질분해 활성이 있는 미생물의 분리는 지렁이 농장(강원도 홍천)에서 구입한 지렁이(Eisenia fetida)를 이용해 clean bench 내에서 지렁이의 표면을 70% ethanol로 소독하고 화염 멸균하여 blade로 절개한 다음, 지렁이의 장 내용물을 취해 0.85% (w/v) NaCl 용액에 현탁하였다. 현탁액 1 ml를 0.85% (w/v) NaCl 용액 9 ml에 십진 희석하여 3% (v/v) olive oil이 함유된 spirit blue agar plate (Difco, Sparks, MD, USA)에 도말한 후 30℃에서 24시간 배양하였다[25]. 배양한 spirit blue agar plate에서 clearer halo를 형성하는 미생물 군집을 순수 분리하였다.

효소활성 측정

지질분해 활성의 측정은 지방산의 탄소수가 다른 p-nitrophenyl butyrate (pNPB)와 p-nitrophenyl palmitate (pNPP)를 각각 기질로 사용하였다[27]. 분리 미생물은 LB (Luria-Bertani) 액체배지에서 30℃, 24시간동안 진탕배양하고 원심분리(10,000 × g, 4℃, 30 min)하여 상등액을 조효소액으로 사용하였다.

pNPB에 대한 효소반응은 pNPB를 acetonitrile에 10 mM의 농도로 희석한 용액 10 μl와 99% cold ethanol 10 μl를 10 mM Tris·HCl (pH 8.0) 160 μl에 혼합한 후 조효소액 20 μl와 37℃에서 30분동안 반응시켰다. pNPP에 대한 효소반응은 isopropanol에 8 mM의 농도로 녹인 pNPP 용액 20 μl를 buffer solution (0.1 M Tris·HCl buffer, 0.1% (w/v) gum arabic, 0.2% (w/v) deoxycholate) 160 μl에 넣고 37℃에서 10분간 방치한 후 조효소액 20 μl와 혼합하여 37℃에서 30분동안 반응 후 spectrophotometer (VersaMaxTM ELISA Microplate Reader, Molecular Devices Co., CA, USA)를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다[9]. 효소 활성 1 U는 1분 동안 1 μmole의 p-nitrophenol을 생성하는 효소의 양으로 나타내었다.

미생물의 동정

분리 미생물의 형태적 동정은 Bergey's Manual of Determination Bacteriology의 분류 기준을 참고하였다. Gram염색은 LB 고체배지에 37℃, 18시간 배양한 분리 미생물을 slide glass에 도말하여 열 고정을 하고 crystal violet, iodine, ethanol, safranin을 순서대로 처리하였다. 아포염색은 Schaeffer-Fulton법을 사용하였으며 열 고정한 분리 미생물을 5% (w/v) malachite green, safranin을 처리하여 광학 현미경으로 관찰하였다.

분리 미생물의 생화학적 동정은 API 20NE kit (bioMerieux Co., France)를 이용하였고 그 결과를 API web database (http://apiweb.biomerieux.com)을 이용하여 분석하였다.

분리 미생물의 유전학적 동정은 16S ribosomal DNA 염기서열 분석을 통해 수행하였다. 분리 미생물로부터 분리한 chromosomal DNA를 universal primer인 27 forward primer (5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3')와 1492 reverse primer (5'-GGATACCTTGTTACGACTT-3')를 사용하여 PCR증폭을 통하여 약 1.4 kb의 fragment를 T vector (Invitrogen, CA, USA)에 결합시킨 후 형질 전환하여 T vector sequencing primer를 이용하여 염기서열을 분석하고 GenBank (NCBI, MD, USA)의 database에 등록된 16S rDNA 염기서열의 정보와 BLAST program (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)을 이용하여 분리 미생물을 동정하였다.

생장곡선

분리 미생물을 LB 액체배지에 1% (v/v) 접종하여 30℃에서 150 rpm으로 진탕배양하면서 spectrophotometer를 이용하여 흡광도(660 nm)를 측정하였고, 배양액 1 ml을 취하여 원심분리(10,000 × g, 10 min)하고 상등액을 조효소액으로 사용하여 지질분해 활성을 측정하였다.

효소의 분리 및 정제

분리 미생물을 LB 액체배지에 1% (v/v) 접종하여 30℃에서 24시간 동안 배양한 후, 배양액을 원심분리(10,000 × g, 4℃, 30 min)하여 상등액에 ammonium sulfate (Junsei, Japan)를 35−45%의 포화도가 되도록 천천히 교반하면서 넣은 후 4℃에서 12시간 동안 방치하였다. 원심분리(20,000 × g, 4℃, 25 min)하여 얻은 침전물을 소량의 10 mM Tris·HCl buffer (pH 7.2)에 용해시키고 dialysis (Spectra/Por 1, MWCO 6-8,000, Spectrum Laboratories, Inc.)를 4℃에서 12시간동안 10 mM Tris·HCl buffer (pH 7.2)로 수행하였다. 모든 정제과정은 효소 단백질의 변성을 최소화하기 위하여 4℃에서 진행하였다.

DEAE-sepharose fast flow으로 충전된 column (2.5 × 50 cm, Pharmacia, Biotech. AB Uppsala, Sweden)을 10 mM Tris·HCl buffer (pH 7.2)로 평형화시킨 후, 효소액을 주입하여 1 ml/min의 유속에서 동일완충액으로 흡착시켰다. 동일완충액에 용해시킨 linear gradient한 0−1 M NaCl로 용출하여 분획 당 4 ml씩 분취하였다[1]. 각 분획마다 지질분해 활성을 측정하고 단백질 함량은 280 nm에서 흡광도를 측정하였다.

Sephacryl S-300HR으로 충전된 column (1.5 × 100 cm, Pharmacia, Biotech. AB Uppsala, Sweden)을 10mM Tris·HCl buffer (pH 7.2)로 평형화시키고 효소액을 0.5 ml/min의 유속으로 용출하여 분획 당 2 ml씩 분취하였다. 각 분획마다 지질분해 활성을 측정하고 단백질 함량은 280 nm에서 흡광도를 측정하였다.

단백질 정량

지질분해 효소 단백질의 정량은 Lowry's method를 변형하여 실시하였다[19]. 효소액 50 ml에 biuret reagent (0.75 mmol/l cupric sulfate, 94 mmol/l sodium hydroxide) 550 ml를 넣어 25℃에 10분간 반응시킨 후, folin and ciocalteu's phenol reagent (Sigma, USA) 25 μl를 넣고 25℃에서 30분 동안 반응시켜서 spectrophotometer로 725 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준곡선은 bovine serum albumin (BSA, Sigma, USA)을 사용하였다.

분자량 측정

지질분해 효소 단백질의 분자량 측정은 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)를 사용하여 측정하였다[15]. 5 × Sample buffer (125 mM Tris· HCl (pH 8.3), 5% β-mecaptoethanol, 50% glycerol, 0.5% bromophenol blue, 10% SDS)와 효소액을 1:4로 혼합하여 30분간 방치 후 95℃에서 5분간 열처리를 하고 polyacrylamide gel에 주입하여 80 V에서 2시간동안 전기영동을 하였다. 전기영동한 후, coomassie brilliant blue로 4시간동안 염색하고 증류수로 탈색하였다. 표준 단백질로는 broad-range pre-stained marker (7−240 kDa, Elpis Biotech Inc., Korea)를 사용하였다.

Zymography 분석

Zymogram은 SDS-PAGE 전기영동한 후, 2.5% Triton X-100 (10 mM Tris·HCl buffer, pH 8.0)으로 15분, 10% Triton X-100 (10 mM Tris·HCl buffer, pH 8.0)으로 15분, 10 mM Tris·HCl buffer (pH 8.0)로 15분 동안 gel을 세척하고 chromogenic substrate plate (0.01% phenol red, 1% tributyrin (sigma), 10 mM CaCl2, 2% agar, pH 7.3−7.4)에 중층으로 올린 후 37℃에서 1시간 동안 incubation 하였다. Zymography의 다른 방법으로는 SDS를 제거한 gel을 10 mM Tris·HCl buffer (pH 8.0)로 평형화하고 pNPB 반응액(10 mM pNPB 1 ml, 99% ethanol 1 ml, 10 mM Tris·HCl buffer (pH 8.0) 16 ml)을 처리하여 37℃에서 30분 후 확인하였다[23].

최적반응 pH 및 pH 안정성

효소 활성의 최적 pH를 측정하기 위하여 0.1 M sodium acetate buffer (pH 4.0−6.0), 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 6.0−8.0), 0.1 M Tris·HCl buffer (pH 8.0−10.0), 0.1 M glycine-OH buffer (pH 10.0−12.0)를 지질분해 활성측정의 완충액으로 사용하였다. 효소의 pH 안정성은 정제한 효소 10 μl와 각각 pH 4.0−12.0로 조정한 완충액 190 μl를 혼합하여 37℃에서 6시간동안 방치한 후 잔존 효소 활성을 측정하였다.

최적반응 온도 및 온도 안정성

효소 활성의 최적 온도는 pNPB 반응액(10 mM pNPB 10 μl와 99% ethanol 10 μl, 10 mM Tris·HCl buffer (pH 8.0) 160 μl) 180 μl와 pNPP 반응액(8 mM pNPP 20 μl와 10 mM Tris·HCl buffer (pH 8.0, 0.1% gum arabic, 0.2% deoxycholate, 1% Triton X-100) 160 μl) 180 μl에 각각 효소액 20 μl를 넣고 20−80℃에서 각각 30분 동안 반응시킨 후 지질분해 활성을 측정하였다. 효소의 온도 안정성에 대한 측정은 정제한 효소를 최적온도 조건과 동일하게 30분간 방치한 후 잔존 효소 활성을 측정하였다.

금속이온과 inhibitor의 영향

지질분해 효소의 활성에 영향을 미치는 금속이온을 조사하기 위하여 CaCl2, CoCl2, CuCl2, FeCl2, MgCl2, MnCl2, ZnCl2를 사용하여 측정하였다. 정제한 효소 10 μl와 금속이온 190 μl를 혼합하여 금속이온의 최종 농도가 각각 2 mM과 10 mM이 되도록 하여 37℃에서 30분간 방치한 후 지질분해 활성을 측정하였다.

지질분해 효소 활성에 영향을 미치는 inhibitor를 조사하기 위해 ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF), antipain과 pepstatin A를 이용하여 측정하였다. 정제한 효소 10 μl와 inhibitor 용액 190 μl를 혼합하여 inhibitor의 최종 농도가 각각 2 mM과 10 mM이 되도록 하여 30℃에서 30분간 방치하였다. 그중 20 μl를 취하여 각각 pNPB 반응액 180 μl와 pNPP 반응액 180 μl에 넣어 37℃에서 30분간 반응시킨 후 지질분해 활성을 측정하였다.

Km 및 Vmax 측정

지질분해 효소의 Km 값과 Vmax 값은 pNPB와 pNPP의 기질농도([S])에 따른 반응속도(V)를 측정하고 측정값의 역수를 취해 Lineweaver-Burk plot을 작성하여 결정하였다. 이때 pNPB의 농도는 0.4−1.0 mM, pNPP의 농도는 0.4−1.6 mM로 변화시켰으며 각 기질 농도에서의 효소 활성은 37℃에서 30분간 반응 후 측정하였다.

 

결과 및 고찰

지질분해 효소 생산미생물의 분리 및 선발

지렁이의 장 내용물을 0.85% (w/v) NaCl 용액에 십진 희석하여 3% (v/v) olive oil이 함유된 spirit blue agar plate에 도말하고 30℃에서 24시간 배양하여 clearer halo를 생성하는 총 430주를 1차 선발하였다(data not shown). 1차 선발한 균주들을 LB 액체배지에 접종하여 30℃에서 24시간 배양한 후 pNPB와 pNPP를 기질로 하여 각각 지질분해 활성을 측정하고 pNPB 분해 활성이 높은 균주 13주와 pNPP 분해 활성이 높은 균주 10주를 2차 선발하였다. 두 기질에 대한 분해 활성이 높은 8균주로 다시 지질분해 활성을 측정하여 비교한 결과, 지질분해 활성이 가장 우수한 PL43 균주를 최종선발하였다(Fig. 1).

Fig. 1.Lipolytic activities of strains isolated from earthworm intestine.

선발된 미생물의 동정

선발된 미생물을 Gram 염색과 아포염색을 하여 현미경으로 관찰한 결과, 그람 음성 간균으로 관찰되었고 내생포자를 생성하지 않았다. 생화학적 동정을 위하여 API 20NE kit test를 실시한 결과, Aeromonas hydrophila / caviae와 99.9% identity를 보였다(data not shown). 유전학적 동정을 위하여 16S ribosomal DNA 염기서열 분석을 실시한 결과, Aeromonas hydrophila와 가장 가까운 유연관계를 보였다. 형태적 특징, 생화학적 특성과 16S ribosomal DNA 염기서열 분석 결과를 종합하여, 선발된 미생물을 Aeromonas hydrophila PL43으로 명명하였다(Fig. 2).

Fig. 2.Phylogenetic tree of isolate PL43 through 16S ribosomal DNA sequence homology.

선발된 미생물의 생장곡선 및 지질분해 효소 생산

선발된 미생물의 배양시간에 따른 균체의 생장 및 지질분해 활성을 측정한 결과, 균체의 생장은 접종 후 18시간부터 정지기로 접어들었으며, 지질분해 효소의 활성은 배양 24시간에 최대의 활성을 나타내었고 이후 활성이 지속되는 것으로 확인하였다(data not shown). 이후 지질분해 효소의 정제를 위한 미생물의 배양은 24시간 동안 배양한 배양액을 사용하였다.

지질분해 효소의 정제

LB 액체배지에서 30℃, 24시간 동안 배양한 A. hydrophila PL43의 배양상등액에 0−35%, 35−45%, 45−55%, 55−80%의 포화도로 ammonium sulfate 침전시켜 얻은 침전물의 지질분해 활성을 비교한 결과, 35−45% ammonium sulfate 침전물에서 지질분해 효소의 활성이 존재함을 확인하였다(data not shown).

35−45% ammonium sulfate 침전물을 10 mM Tris·HCl buffer (pH 7.2)로 투석하여 ammonium sulfate를 제거한 후, DEAE-sepharose fast flow에 흡착시키고 0−1 M NaCl solution을 linear gradient하게 용출시켜서 분획마다 지질분해 활성을 측정한 결과, 총 270개의 분획 중 지질분해 활성은 162−174번 분획에서 확인하였으며, 활성 분획을 모아 겔 크로마토그래피에 사용하였다. 효소 활성이 있는 분획을 겔 크로마토그래피로 정제한 결과, 총 120개의 분획 중 지질분해 활성은 53−64번 분획에서 나타났으며 활성 분획을 모아 다음 단계에 사용하였다(data not shown).

Ammonium sulfate에 의한 침전물의 총 지질분해 활성(total activity, U)은 pNPB를 기질로 사용했을 때 62,414 U이었고, pNPP를 기질로 사용했을 때 25,020 U으로 culture broth에 비해 각각 33.9배와 39.0배로 농축되었으며 회수율은 각각 44.7%와 51.3%이었다. 이온교환 크로마토그래피를 수행하였을 때 지질분해 효소의 총 활성은 pNPB를 기질로 사용했을 때 27,305 U이었고 pNPP를 기질로 사용했을 때 7,990 U으로 culture broth에 비해 각각 60.4배와 50.6배로 농축되었으며 회수율은 각각 19.6%와 16.4%이었다. 지질분해 효소를 최종 정제한 결과, culture broth에 비해 pNPB를 기질로 사용했을 때 5,115 U이었고 pNPP를 기질로 사용했을 때 1,196 U으로 culture broth에 비해 각각 84.5배와 56.6배로 농축되었으며 회수율은 각각 3.7%와 2.5%이었다(Table 1).

Table 1.A, using pNPB as substrate; B, using pNPP as substrate.

효소 단백질의 분자량 측정과 Zymography

정제한 지질분해 효소의 단일성 및 분자량을 측정하기 위하여 SDS-PAGE로 실험한 결과는 Fig. 3에 나타내었으며 이온교환 크로마토그래피와 겔 크로마토그래피의 활성 부분을 비교했을 때 단백질 band의 결과가 유사하였다. SDS-PAGE (Fig. 3A)와 동일한 gel을 이용하여 zymography를 수행한 결과(Fig. 3B), 73.8 kDa에서 활성을 보였다(Fig. 3C).

Fig. 3.Protein pattern and determination of molecular weight of the purified enzyme by SDS-PAGE. (A) coomassie brilliant blue staining, (B) zymography, (C) molecular weight, (M) protein molecular weight markers, (1) proteins precipitated by 35−45% ammonium sulfate, (2) proteins eluted by DEAE-sepharose FF ion exchange chromatography, (3) proteins eluted by Sephacryl S-300HR gel filtration. Molecular weight marker proteins: (A) 100 kDa, (B) 70 kDa, (C) 50 kDa, (D) 35 kDa.

Anguita 등에 의하면 A. hydrophila H3이 생산하는 lipase의 분자량은 67 kDa이라고 보고하였다[2]. Neelambari 등은 바다에서 분리한 A. hydrophila가 생산하는 lipase의 분자량은 34 kDa이라고 보고하였다[18]. Dharmsthiti 등은 Bacillus sp. THL027이 생산하는 thermophilic lipase의 분자량이 69 kDa이라고 보고하였으며[6], Jurgens 등은 미생물유래의 lipase의 분자량은 12−76 kDa으로 다양하다고 보고하였다[11]. Ingham 등은 A. hydrophila로부터 복제되어 E. coli에서 과발현되는 비교적 큰 크기의 lipase (H3, Apl1)는 약 70 kDa의 분자량이라고 보고하였다[10].

최적반응 pH 및 pH 안정성 측정

정제한 지질분해 효소의 최적 활성 pH를 조사하기 위하여 0.1M sodium acetate buffer (pH 4.0−6.0), 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 6.0−8.0), 0.1 M Tris·HCl buffer (pH 8.0−10.0), 0.1 M glycine-OH buffer (pH 10.0−12.0)로 지질분해 활성측정의 완충액을 제조하여 37℃에서 30분간 반응시킨 결과는 Fig. 4와 같다. pNPB와 pNPP를 기질로 이용해 각각 조사한 결과, pNPB와 pNPP에 대한 최적 pH는 8.0 이었으며, pH 6.0 이하에서는 효소활성이 소실되었다(Fig. 4A). pH 4.0−12.0의 조건에서 6시간 동안 방치 후 지질분해 효소의 잔존 활성을 측정한 결과, pH 7.0−10.0에서 안정하였다(Fig. 4B).

Fig. 4.Effect of pH on the lipolytic activity and stability of the purified enzyme from A. hydrophila PL43. (A) lipolytic activity of the purified enzyme, (B) stability of the purified enzyme. pNPB and pNPP were p-nitrophenyl butyrate and p-nitrophenyl palmitate, respectively. The enzyme activities were assayed in the pH range of 4.0−10.0, in 0.1 M sodium acetate buffer (pH 4.0−6.0), 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 6.0−8.0) and 0.1 M Tris·HCl buffer (pH 8.0−10.0) at 37℃. The enzyme stability was preincubated at various pH buffer for 6 h and remaining activity was measured.

Anguita 등은 A. hydrophila H3이 생산하는 lipase의 최적 pH는 7.2이고 pH 5 이하, pH 9 이상에서 효소 활성이 소실되었다고 보고하였다[2]. Neelambari 등은 바다에서 분리한 A. hydrophila가 생산하는 lipase의 최적 pH는 pH 7.5−9.5이고 pH 10 이상에서도 활성이 유지되며[18] S. grimisii, S. marcescens [1, 17], Pseudomonas [14]가 생산하는 lipase의 최적 pH 범위인 pH 8−9와 유사하고 pH에 의하여 효소 활성이 감소되는 것은 lipase 이온의 불활성화 보다는 지방산의 불완전한 이온화에 의한 것이라고 설명하였다.

본 연구에서 A. hydrophila PL43이 생산하는 지질분해 효소가 알칼리 조건에서 안정하고 최적 pH가 8.0−9.0인 것으로 보아 A. hydrophila H3의 lipase보다 marine A. hydrophila와 Pseudomonas sp.의 lipase와 유사함을 나타내었다.

최적반응 온도 및 온도 안정성 측정

정제한 지질분해 효소의 최적 온도와 온도 안정성에 대한 측정 결과를 Fig. 5에 나타내었다. 정제한 지질분해 효소는 기질이 pNPB일 때 50℃, pNPP일 때 60℃에서 최대 활성을 나타내었다(Fig. 5A). pNPB를 기질로 사용했을 때는 20−60℃의 온도 범위에서 70% 이상의 효소 활성을 유지했지만, pNPP를 기질로 사용했을 때는 50℃ 이하에서 효소 활성이 크게 감소하였는데, 이는 탄소수가 많은 pNPP가 낮은 온도에서 용해가 잘 되지 않기 때문에 효소의 반응이 상대적으로 낮아졌다고 사료된다. 효소의 온도 안정성은 pNPB를 기질로 사용했을 때 40℃에서 가장 안정했고 70℃에서 활성이 급격하게 감소하였으며, pNPP를 기질로 사용했을 때 50℃에서 가장 안정했고 70℃에서 활성이 급격하게 감소하였다(Fig. 5B).

Fig. 5.Effect of temperature on the lipolytic activity and stability of the purified enzyme from A. hydrophila PL43. (A) lipolytic activity of the purified enzyme, (B) stability of the purified enzyme. pNPB and pNPP were p-nitrophenyl butyrate and p-nitrophenyl palmitate, respectively. The enzyme activities were assayed at various temperatures of 20−80℃ and pH 8.0 in 10 mM Tris·HCl buffer. The enzyme stability was preincubated at various temperatures of 20−80℃ and pH 8.0 in 10 mM Tris·HCl buffer for 3 h and remaining activity was measured.

Anguita 등은 A. hydrophila H3이 생산하는 lipase의 최대 활성 온도는 37℃이고 55℃에서 30분 이상 방치하여도 90% 이상의 활성을 유지한다고 보고하였다[2]. Neelambari 등은 lipase가 40−50℃에서 최대 활성을 나타내었고[18] Kiran 등은 lipase가 37℃에서 최대 활성을 나타낸다고 보고하였으며[12], Kosugi 등은 60−80℃의 온도범위에서 lipase의 활성이 감소된다고 보고하였다[13]. Ingham 등은 lipase H3와 Apl1의 최적 온도가 50℃라고 보고하였다[10]. Lee 등은 psychrotrophic Aeromonas sp. LPB 4가 생산하는 저온활성 lipase가 4−50℃에서 안정하고 50℃ 이상의 온도에서 효소 활성이 급격하게 감소한다고 보고하였다[16]. 따라서 A. hydrophila PL43의 지질분해 효소는 기존의 연구결과들과 유사한 결과를 나타내었다.

금속이온 및 inhibitor에 대한 영향

금속이온이 지질분해 활성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 2 mM과 10 mM 농도의 다양한 금속이온과 지질분해 효소를 혼합하여 37℃에서 30분간 방치한 후, 지질분해 활성측정한 결과를 Table 2와 Table 3에 나타내었다.

Table 2.The enzyme was pre-incubated at various metal ions and EDTA in 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) for 1 h at 37℃ and remaining activity was measured.

Table 3.The enzyme was pre-incubated at various inhibitors in 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) for 1 h at 37℃ and remaining activity was measured.

정제한 지질분해 효소의 활성은 pNPB를 기질로 사용했을 때, 2 mM과 10 mM CoCl2, 10 mM CuCl2에 의해 크게 감소하였고 2 mM CuCl2과 10 mM FeCl2에 의해 약 50% 감소하였다. pNPB를 기질로 사용했을 때에는 2 mM CoCl2과 10 mM FeCl2에 의해 활성이 크게 감소하였고, 2 mM CuCl2, 2 mM과 10 mM FeCl2에 의해 약 50% 감소하였다. 금속이온과 EDTA를 혼합한 용액과 효소액을 반응시켰을 때에는 EDTA가 금속이온을 chelating하여 효소가 금속이온에 의해 영향을 덜 받는 것으로 사료된다. Anguita 등에 의하면 A. hydrophila H3이 생산하는 lipase는 Mg, Sr, Ba, Mn 등의 2가 양이온에 의해 효소 활성이 약 120% 증가하고 EDTA에 의해 영향을 받지 않으며, Cu2+, Hg2+, Sn2+ 등의 중금속에 의해서는 5 mM의 농도에서 효소 활성이 90% 이상 저해된다고 보고하였다[2]. Gibert 등은 P. aeruginosa EF2의 lipase는 금속이온과는 독립적인 지질분해 효소 활성을 갖기 때문에 metal chelating agent인 EDTA의 영향을 받지 않는다고 보고했다[8]. Saeed 등은 미생물 유래 lipase는 구조적으로 Ser-Asp-His을 가지고 있으며, Pseudomonas sp.가 생산하는 lipase I과 lipase II가 10 mM PMSF에 의해 각각의 활성이 15%와 41.84%로 저해되었다고 보고했다[21]. 지질분해 효소의 활성에 영향을 미치는 inhibitor를 조사하기 위해 금속이온을 chelating하는 ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 효소활성부위의 serine 잔기를 억제하는 phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF), 효소활성부위의 serine과 cysteine 잔기를 억제하는 antipain 그리고 효소활성부위의 aspartyl 잔기를 억제하는 pepstatin A을 사용하여 지질분해 활성을 측정한 결과, 정제한 효소는 PMSF에 의해 강하게 저해되었으며 antipain에 의한 영향은 없었고 2 mM pepstatin A는 효소활성을 증가시키는 반면, 10 mM pepstatin A는 활성을 크게 저해하였다(Table 3). 따라서 Saeed 등[21]이 보고한 것과 같이 정제한 지질분해 효소는 활성부위에 serine 잔기와 aspartyl 잔기가 존재하는 것으로 사료된다.

Km 및 Vmax 측정

정제한 지질분해 효소의 기질과의 친화도를 조사하기 위하여 다양한 농도의 기질(0.4−1.0 mM pNPB, 0.4−1.6 mM pNPP)을 이용해 Lineweaver-Burk 방법으로 plot하여 기질 별로 Km 값과 Vmax 값을 알아본 결과, pNPB를 기질로 사용했을 때 Km 값과 Vmax 값은 1.07 mM과 7.27 mM/min이고, 기질이 pNPP일 때 Km 값과 Vmax 값은 1.43 mM과 2.72 mM/min이었다(data not shown).

References

  1. Abdou AM. 2003. Purification and partial characterization of psychrotrophic Serratia marcescens lipase. J. Dairy Sci. 86: 127−132. https://doi.org/10.3168/jds.S0022-0302(03)73591-7
  2. Anguita J, Rodríguez Aparicio LB, Naharro G. 1993. Purification, gene cloning, amino acid sequence analysis, and expression of an extracellular lipase from an Aeromonas hydrophila human isolate. Appl. Environ. Microbiol. 59: 2411−2417.
  3. Carrière F, Thirstrup K, Hjorth S, Boel E. 1994. Cloning of the classical guinea pig pancreatic lipase and comparison with the lipase related protein 2. FEBS Lett. 338: 63−68. https://doi.org/10.1016/0014-5793(94)80117-7
  4. Chowdary GV, Ramesh MN, Prapulla SG. 2001. Enzymic synthesis of isoamyl isovalerate using immobilized lipase from Rhizomucor miehei: multivariate analysis. Process Biochem. 36: 331−339.
  5. Cygle M, Schrag JD, Sussman JL, Harel M, Silman I, Gentry MK, et al. 1993. Relationship between sequence conservation and three-dimensional structure in a large family of esterases, lipases, and related proteins. Protein Sci. 2: 366−382.
  6. Dharmsthiti S, Luchai S. 1999. Production purification and characterization of thermophilic lipase from Bacillus sp. THL027. FEMS Microbiol. Lett. 197: 241−246.
  7. Edwards CA, Fletcher KE. 1988. Interactions between earthworms and microorganism in organic-matter breakdown. Agric. Ecosyst. Environ. 24: 235−247. https://doi.org/10.1016/0167-8809(88)90069-2
  8. Gilbert EJ, Cornish A, Jones CW. 1991. Physiological regulation and optimization of lipase activity in Pseudomonas aeruginosa EF2. J. Gen. Microbiol. 137: 2223−2229. https://doi.org/10.1099/00221287-137-9-2223
  9. Gupta N, Rathi P, Gupta R. 2002. Simplified para-nitrophenyl palmitate assay for lipases and esterases. Anal. Biochem. 311: 98−99. https://doi.org/10.1016/S0003-2697(02)00379-2
  10. Ingham AB, Pemberton JM. 1995. A lipase of Aeromonas hydrophila showing nonhemolytic phospholipase C activity. Curr. Microbiol. 31: 28−33. https://doi.org/10.1007/BF00294630
  11. Jurgens D, Huser H, Brunner H, Fehrenbach FJ. 1981. Purification and characterization of Staphylococcus aureus lipase. FEMS Microbiol. Lett. 12: 195−199. https://doi.org/10.1111/j.1574-6968.1981.tb07641.x
  12. Kiran KR, Divakar S. 2001. Lipase catalyzed synthesis of organic acid esters of lactic acid in non-aqueous media. J. Biotechnol. 87: 109−121. https://doi.org/10.1016/S0168-1656(01)00242-5
  13. Kosugi Y, Kamibayashi A. 1971. Thermostable lipase from Pseudomonas sp. cultural conditions and properties of the crude enzyme. J. Ferm. Technol. 49: 986.
  14. Ladass A, Solberg P. 1978. Purification and characterization of lipase from a fluorescent pseudomonas. 20th Int. Dairy Congr., Paris E: 304−305.
  15. Laemmli UK. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature (London). 227: 680−685. https://doi.org/10.1038/227680a0
  16. Lee HK, Ahn MJ, Kwak SH, Song WH, Jeong BC. 2003. Purification and characterization of cold active lipase from psychrotrophic Aeromonas sp. LPB 4. J. Microbiol. 41: 22−27.
  17. Matsumae H, Shibatani T. 1994. Purification and characterization of the lipase from Serratia marcescens Sr418000 responsible for asymmetric hydrolysis of 3-phenylglycidic acid esters. J. Ferment. 77: 152−158. https://doi.org/10.1016/0922-338X(94)90315-8
  18. Neelambari V, Vasanthabharathi V, Balasubramanian R, Jayalakshmi S. 2011. Lipase from marine Aeromonas hydrophila. Research J. Microbiol. 6: 658−668. https://doi.org/10.3923/jm.2011.658.668
  19. Ohnishi TS, Barr JK. 1978. A simplified method of quantitating protein using the biuret and phenol reagents. Anal. Biochem. 86: 193−200. https://doi.org/10.1016/0003-2697(78)90334-2
  20. Ollis D, Cheah E, Cygler M, Dijkstra B, Frolow F, Franken S, et al. 1992. The α/β hydrolase fold. Prot. Eng. 5: 197−211. https://doi.org/10.1093/protein/5.3.197
  21. Saeed HM, Zaghloul TI, Khalil AI, Abdelbaeth MT. 2005. Purification and characterization of two extracellular lipases from Pseudomonas aeruginosa Ps-x. Pol. J. Microbiol. 54: 233−240.
  22. Saxena RK, Sheoran A, Giri B, Davidson WS. 2003. Purification strategies for microbial lipases. J. Microbiol. Methods Rev. 52: 1−18. https://doi.org/10.1016/S0167-7012(02)00161-6
  23. Singh R, Gupta N, Goswami VK, Gupta R. 2006. A simple activity staining protocol for lipases and esterases. Appl. Microbiol. Biotechnol. 70: 679−682. https://doi.org/10.1007/s00253-005-0138-z
  24. Sommer P, Bormann C, Götz F. 1997. Genetic and biochemical characterization of a new extracellular lipase from Streptomyces cinnamomeus. Appl. Environ. Microbiol. 63: 3553−3560.
  25. Starr MP. 1941. Spirit blue agar: a medium for the detection of lipolytic microorganisms. Science 93: 333−334. https://doi.org/10.1126/science.93.2414.333
  26. Svendsen A. 1994. Sequence comparisons within the lipase family. In Woolley P, Petersen SB. (eds.), Lipases: Their Structure, Biochemistry and Applications. Cambridge Univ. Press, Cambridge 1−21.
  27. Winkler UK, Stuckmann M. 1978. Glycogen, hyaluronate, and some other polysaccharides greatly enhance the formation of exolipase by Serratia marcescens. J. Bacteriol. 138: 663−670.