Isolation and Characteristics of Lactic Acid Bacteria Producing Casein Phosphopeptides from Kimchi

Casein phosphopeptide를 생산하는 김치 유래 유산균의 분리 및 특성 연구

Abstract

Lactic acid bacteria showing both protease activity and the capacity to produce casein phosphopeptide (CPP) were isolated from Korean kimchi, a traditional food made from fermented vegetables. Among the 450 strains of isolated lactic acid bacteria, the strain MG-379 showed high protease activity and the highest ability to produce CPP. Characterization results showed that MG-379 was gram-positive and measured $0.6-0.8{\mu}m$ in diameter. DNA sequencing of MG-379 and comparison with other sequences using BLAST revealed a 100% identity with the sequence of Enterococcus faecalis. However, MG-379 showed a higher CPP-producing ability than E. faecalis KCCM 40450. Accordingly, MG-379 was newly named as E. faecalis MG-379. Amount of free calcium liberated by CPPs was 2227.5 and 1151.6 mg/kg for E. faecalis MG-379 and E. faecalis KCCM (control), respectively.

본 연구에서는 전국 가정집에서 제조한 김치로부터 분리한 유산균들 중에서 protease 활성 및 CPP 생산 능력이 가장 높은 균주인 strain 0301을 동정하였고 해당 균주의 특성과 CPP 생산 최적 조건을 조사하였다. 0301은 $0.6-0.8{\mu}m$ 크기의 gram 양성 구균이며, 16s rDNA 염기서열 분석 결과 Enterococcus faecalis MG-379로 동정 명명하였다. E. faecalis MG-379 균주를 2% fructose를 첨가하고 pH 6.0인 배지에서 37oC에서 36시간 배양하였을 때 CPP 생산 능력이 최대였으며, ICP를 이용하여 측정한 결과 2227.5 mg/kg으로, 비교 균주인 Enterococcus faecalis KCCM 40450에 비해 약 2배 가량 높은 CPP 생산 능력을 갖는 것으로 나타내었다.

서 론

과거와 비교하여 현대인은 많은 영양 섭취를 하고 있으며, 이에 따라 과잉 복용에 따른 부작용이 나타나고 있다. 하지만 인체를 구성하는 무기물질 중에서 많은 함량의 차지하고 있는 칼슘(calcium)의 경우, 섭취량은 증가하였으나 체내 이용률이 낮아 다양한 결핍 질환이 유발되고 있다.

칼슘 부족은 뼈 성장 부진, 골절, 골다공증[13], 고 콜레스테롤증, 동맥경화, 고혈압, 고지혈증[29] 등 다양한 질병의 원인이지만 2012년도 국민 건강조사에 따르면 한국인들의 칼슘 섭취량은 평균의 70.1%로 매우 낮은 것으로 조사되었다[3]. 또한 인간의 평균 수명이 연장되어 고령화 사회가 이루어지고 폐경에 의한 골다공증의 심각성 등으로 인하여 칼슘 섭취의 중요성이 강조되고 있다[23].

우리나라 전통발효식품인 김치는 저열량 식품으로서 특유의 독특한 맛과 풍미를 갖고 있으며[5, 23], 여러 가지 유기산과 젖산균이 풍부하고 식이 섬유와 비타민 및 무기질 등의 공급원이다[20]. 김치 재료 속의 각종 탄수화물과 단백질 등은 효소에 의해 당류 및 아미노산 등의 저분자 물질을 생산하게 된다[19]. 김치는 2001년에 Codex 국제식품규격에 채택[20]되었으며, 2006년에는 미국의 건강잡지 ‘Health’에서 세계 5대 건강식품으로 선정[27]되는 등 세계적으로 그 가치를 인정받고 있는 추세이다. 최근 김치에서 분리 동정되어 보고된 미생물은 Leuconostoc spp., Lactobacillus spp.[19], Streptococcus spp.[23], Pediococcus spp.[25], Weissella spp.[13] 등이 있다. 또한 김치에서 분리된 미생물을 이용하여 유산균에 대한 정장작용[14], 면역기능 강화[18], 항암작 용[24], 항산화활성[27], 혈장 지질 저하[25], 혈중 콜레스테롤 저하[11] 등의 다양한 건강기능성의 연구뿐만 아니라 동물 사료, 의약품 및 화장품 연구에 까지 그 이용 범위가 넓어지고 있다.

칼슘 섭취량을 높이기 위해서는 많은 양을 먹는 것보다 칼슘의 체내 이용도가 높아야 한다[9]. Casein phosphopeptide (CPP)는 칼슘 흡수를 촉진하는 물질로서 칼슘의 체내 이용률을 높인다고 알려져 있다[22]. Casein의 가수분해 반응에 의해 생성된 CPP는 체내 소화 효소 등에 의해 쉽게 반응하지 않는다고 알려져 있으며[24], 칼슘 이온이 침전되기 전에 이와 결합하여 가용화 상태를 유지시켜 칼슘이 소장에서 체내로 흡수되는 것을 촉진시킨다. 즉, peptide의 인산화는 칼슘의 체내 흡수를 촉진시키는 것으로 알려져 있으며[22], 이에 관련된 연구도 이루어지고 있다. CPP는 식품 가공 과정에 첨가하여도 거의 분해되지 않는 안정한 물질로서 다양한 상품으로 가공이 용이하며, 이를 통해 체내 칼슘 결핍에 관련된 여러 문제들을 해결하는데 많은 도움이 되는 것으로 알려져 있다[15, 19].

본 연구에서는 김치로부터 protease 및 CPP의 생산 능력이 높은 유산균을 분리 동정하였고 CPP의 생산 조건과 특성을 조사하였다.

 

실험 재료 및 방법

유산균의 분리

김치 시료 10.0 g을 현탁한 멸균 증류수 100 ml를 십진 희석한 후에 Lactobacilli MRS(deMan, Rogasa and Sharpe) 배지에 도말하였다. 혐기 배양을 위해 anaerobic system gas pak(BBL, Becton Dickinson, USA)를 사용하였고 37℃에서 배양하여 균주를 1차로 선별하였다.

Protease 활성 측정

1차 선별 균주에 대해서 2.0% skim milk가 첨가된 MRS 배지에서 protease 활성을 지녀 clear zone을 형성하는 균주를 2차로 선별한 후, azocasein(Sigma-Aldrich, St. Louis MO, USA)을 사용하여 단백질 분해 효소 활성을 측정하였다[2]. 2차 선별 균주를 MRS broth에 접종하여 37℃에서 48시간 정치 배양한 다음 원심 분리하여 그 상등액을 조효소액으로 사용하였다. 기질 용액은 azocasein 2.0 g을 100 mM sodium phosphate buffer(pH 7.0) 200 ml에 현탁하여 사용하였다. 기질 용액 500 μl에 조효소액 100 μl를 혼합하여 37℃에서 30분간 반응시키고 20% trichloroacetic acid (TCA) 900 μl를 첨가하여 반응하지 않은 azocasein을 침전시켜 반응을 정지시키고 9000 × g에서 10분 동안 원심분리하였다. 이후 상등액 600 μl에 1N NaOH 600 μl를 혼합한 후 440 nm에서 흡광도를 측정하였다[19, 15].

Casein phosphopeptide(CPP)의 제조

2.0% sodium caseinate 용액 300 ml에 분리한 균주의 상등액 6.0 ml를 첨가하고 천천히 교반하면서 반응시킨 다음, 80℃에서 반응을 정지시켜 sodium caseinate 분해물을 제조하였다.

제조된 sodium caseinate 분해물에 HCl을 이용하여 pH 4.6으로 조정하고 원심분리(8,000 × g, 20 min, 4℃)하였다. 상등액을 취하여 NaOH로 pH 7.0으로 조정하고 최종 volume 2%의 calcium chloride를 넣고 30분간 교반하였다. 최종 volume 50%만큼 ethanol을 넣고 혼합하여 원심분리(7,000 × g, 10 min, 4℃)한 다음 침전물을 회수하여 동결 건조하여 시료로 사용하였다[19, 24].

유리 칼슘함량 측정

동결건조 된 CPP의 칼슘 유리화 능력 확인을 위해 식품공전[17]에 준하는 과망간산칼륨(potassium permanganate, KMnO4) 적정법을 통해 칼슘 함량을 측정하였다. 증류수 25 ml에 동결건조된 CPP를 녹인 후 10 mM calcium chloride solution 25 ml와 20 mM sodium-phosphate buffer(pH 7.0) 50 ml를 첨가하고 25℃에서 6시간 방치하였다. 이후 원심분리(5,000 × g, 10 min, 4℃)하여 상등액에 HCl을 첨가하여 시험 용액으로 사용하였다.

시험 용액 40 ml를 250 ml 플라스크에 취하여 methyl red 지시약 수 방울과 수산암모늄 용액 10 ml를 가한 다음 요소 2.0 g을 가해 녹였다. 플라스크 입구를 시계접시로 덮고 methyl red 지시약이 적색에서 등황색이 될 때까지 약하게 가열한 후 실온에서 하룻밤 방치하였다. 침전을 형성 시킨 후 석출전 수산 칼슘 결정을 여과지(WhatmanTM Filter Paper No.1)로 여과하고 세척용 암모니아수 30–40 ml로 침전과 여과지를 잘 씻는다. 여과기를 새로운 삼각 플라스크에 놓고 미리 70℃ 이상으로 가온한 황산 용액 약 20 ml를 여과지 위에 주입하여 수산 칼슘을 용해시켜 여과하였다. 여과된 용액을 60–80℃로 가열하여 0.02 N 과망간산칼륨 용액으로 색이 무색에서 적색이 될 때까지 적정하였다. 칼슘 함량(mg/100 g)은 다음의 식으로 계산하였다.

a: 공시험에 대한 0.02 N 과망간산칼륨용액의 소비 ml 수

b: 시험용액에 대한 0.02 N 과망간산칼륨용액의 소비 ml 수

F: 0.02 N 과망간산칼륨용액의 역가

V: 시험용액의 희석배수

S: 검체의 채취량(g)

형태학적 및 생화학적 특성 분석

주사전자현미경(Scanning Electron Microscope, SEM) [S-4300, Hitachi Ltd., Tokyo, Japan)하에서 형태학적 특성을 관찰하였다. 또한 Gram 염색, 3% KOH 실험, catalase 실험 및 API CHL 50 kit와 API 20 strep kit(bioMerieux Ltd, France)를 이용하여 균주의 생화학적 특성을 분석하였다.

16S rDNA 유전자 염기서열 분석

분리 균주의 분자생물학적인 동정을 위하여 16S rDNA 염기서열 분석을 실시하였다. 균주의 염색체 DNA를 추출한 후 7F(5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'), 1492R(5'-GGATACCTTGTTACGACTT-3') primer를 사용하여 polymerase chain reaction(PCR)을 수행하였다[18]. 증폭된 DNA 염기서열은 DNA Analyzer(ABI PRISM 3730, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)로 분석하였다. 분석한 염기서열은 BLAST 프로그램을 통해서 GENEBANK의 ribosomal DNA sequence와 비교하였다[26].

CPP 생산의 최적화

여러 배양조건을 달리하여 CPP 생산의 최적 조건을 확인하였다. 시간은 0–60시간, 온도는 25–50℃, 초기 pH는 3.0–9.0에서 배양 조건을 확인하였다. 또한 탄소원 및 질소원 종류에 따른 CPP 생산 최적 조건을 확인하였다. 탄소원으로는 maltose, lactose, sucrose, fructose, xylose, galactose를 각각 2% 첨가하였으며, 질소원으로는 proteose peptone, beef extract, yeast extract를 각각 2% 첨가하였다.

ICP(Inductively Coupled Plasma)을 이용한 칼슘 함량 분석

고주파 유도 결함 플라스마(Inductively Coupled Plasma, ICP)를 이용한 발광 분석법을 이용해 동결 건조된 CPP의 칼슘 유리화 능력을 확인하였다.

20mM calcium chloride solution(CaCl2) 5.0 ml와 20 mM sodium phosphate dibasic[Na2HPO4) 20 ml에 동결 건조된 CPP를 첨가한 후 25℃에서 6시간 방치하였다. 이후 원심분리(10,000 × g, 10 min, 4℃)하여 상등액 10 ml를 ICP(Optima 8300 ICO-OES Spectrometer, PerkinElmer, USA)로 2회 반복 측정하여 칼슘 함량의 평균값을 구하였다.

 

결과 및 고찰

protease 생산 균주의 분리

전국 가정집에서 제조되는 각종 김치로부터 450주의 유산균을 분리하였다. 분리된 균주들을 2% skim milk가 첨가된 MRS 배지에서 배양한 결과 250주의 colony 주변에서 clear zone을 나타내었다. Clear zone을 형성한 균주들을 각각 배양하여 그 상등액의 protease 활성을 측정한 결과, 활성이 상대적으로 높은 9 균주를 선별할 수 있었다.

Casein phosphopeptid(CPP) 생산 활성 비교

CPP와 칼슘의 결합 능력을 통해 칼슘 함량을 측정하여 CPP 함량을 간접적으로 보았으며, 과망간산칼륨을 이용한 적정법과 ICP를 사용한 분석법을 통해 이를 확인하였다. Protease 활성은 Lactobacillus casei KCCM 12452 균주와 CPP를 생산한다고 밝혀진 Enterococcus faecalis KCCM 40450 균주를 대조군으로 하여 비교하였다. 과망간산칼륨을 통한 적정법을 이용하여 유리 칼슘 함량을 측정한 결과, Fig. 1에서 보이는 것처럼 다른 균주들과 비교하였을 때 0301 균주가 유리 칼슘 함량이 약 2배 가량 높은 것으로 확인되었다. 또한 ICP를 이용해서 칼슘 함량을 비교한 결과, 대조군인 KCCM 40450 균주의 경우 칼슘 함량이 1151.6 mg/kg 인 것에 비해 0301 균주의 경우는 2227.5 mg/kg으로 측정된 것을 Fig. 2를 통해 확인할 수 있다.

Fig. 1.Specific casein phosphopeptide (CPP) production activity of the strain isolated from kimchi.

Fig. 2.Measurement results of the calcium content of CPP using ICP of Enterococcus faecalis MG-379.

최종선발균주의 계통학적 분류 및 형태학적, 생화학적 특성

CPP 생산 활성 테스트를 통해 0301 균주가 다른 균주들과 비교하여 CPP의 생산 능력이 뛰어난 것을 확인할 수 있었다. 따라서 0301 균주를 최종적으로 선별하여 형태학적 및 생화학적 특성을 분석하였다. 그 결과, 0301 균주는 Gram 양성 세균이며, KOH와 catalase test에서 각각 음성을 나타내었다. 주사전자현미경(SEM)을 이용해 세포를 관찰한 결과, 구균의 형태를 나타내며 크기는 0.6–0.8 μm로 측정되었다(Fig. 3). API kit를 통해 당 이용성을 분석한 결과, CHL 50 kit에서는 glycerol, ribose, galactose, glucose, mannose 등의 당을 이용하는 것으로 확인되었다. 또한 20 strep kit로 분석한 결과, sodium pyrubate, esculin ferric citrate, pyroglutamic acid β-naphtlylamide 등에 양성 반응을 나타냄으로써 Enterococcus sp.로 동정되었다. 보다 정확한 동정을 위해 16S rDNA sequence로 분석한 결과, Enterococcus faecails이 가장 유사성이 높은 것으로 확인되었다(Fig. 4). 따라서 분석 결과를 토대로 0301 균주를 Enterococcus faecails MG-379로 동정 명명하였다.

Fig. 3.Scannig electron microscopic photograph of strain MG-379.

Fig. 4.Dendrogram of the strain 0301 through 16S rDNA gene sequence homology.

CPP 생산의 최적화

최종적으로 선별된 Enterococcus faecails MG-379 균주의 CPP 생산 최적 조건을 설정하기 위해 배양 시간 및 온도, 배양 배지의 초기 pH, 탄소원 및 질소원 종류에 따른 균주의 생육도와 그에 따른 CPP 생산 능력을 알아보았다.

균체의 생육은 배양한 지 24시간이 지났을 때 최대 생육을 띄었으며, 배양 온도에 따른 생육 정도를 확인한 결과 25–40℃ 사이에서는 차이가 나타나지 않았으나 40℃ 이상의 온도에서는 생육이 급격히 감소하기 시작하였다. CPP는 배양 36시간에서 최대로 생산이 되었고 이후 시간부터는 급격히 감소하였으며, 배양 온도가 37℃일 때 최대 생산 능력을 나타내었다. 배양 배지의 초기 pH에 따른 영향을 확인한 결과, pH 5.0–9.0까지 pH가 높아짐에 따라 균체의 생육이 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, CPP의 생산은 pH 6.0에서 가장 높은 것으로 나타내었다. 탄소원으로 maltose를 첨가하였을때 생육이 가장 높은 것으로 보였으며 lacose나 xylose를 첨가하였을 때는 생육이 낮은 것으로 확인되었다. CPP 생산능력은 탄소원으로 fructose를 이용하였을 대 최대를 나타내었다(Fig. 5). 질소원에 따른 영향을 확인한 결과 beef extract를 첨가하였을 때 가장 높은 생육과 CPP 생산 능력을 나타내었다(Fig. 6).

Fig. 5.Effect of various carbon sources on growth and CPP producton of Enterococcus faecalis MG-379.

Fig. 6.Effect of various nitrogen sources on growth and CPP producton of Enterococcus faecalis MG-379.

이상의 결과로부터 Enterococcus faecails MG-379를 탄소원으로 2% fructose를 첨가한 배양 배지의 pH를 6.0으로 하여 37℃에서 36시간 동안 균주를 배양하였을 때 CPP 생산에 최적인 조건이 되는 것으로 확립하였다.