Chemical Constituents of the Twigs of Paulownia coreana

오동나무 가지의 성분

Abstract

Three triterpenoids, one sterol glycoside and a phenylpropanoid glycoside were isolated from the n-BuOH soulble fraction of Paulownia coreana twigs. On the basis of spectral data, the structure of isolated compounds were identified as pomolic acid (1), euscaphic acid (2), arjunic acid (3), daucosterol (4), and syringin (5), respectively. All compounds are isolated from this plant for the first time.

재료 및 방법

실험재료 −연구에 사용한 오동나무(P. coreana)의 어린가지는 강원대학교 구내에 식재되어 있는 것을 2013년 8월 채취한 후 저자 중의 한 명인 권용수교수가 감정하여 음건하고 세절하여 사용하였으며, 확증표본(KNUPH-T-13-01)은 강원대학교 약학대학 표본실에 보관중이다.

Fig. 1.Chemical structures of compounds 1-5 isolated from P. koreana.

기기 및 시약 −1H-NMR 및 13C-NMR spectra는 Bruker 사의 AVANCE 600을 이용하여 측정하였다. Mass spectrum 은 AB Sciex 사의 API 3200 LC/MS/MS system과 JEOL 사의 JMS-700을 이용하여 negative 또는 positive mode로 측정하였다. UV/Vis spectrophotometer는 Jasco사의 V-530을 사용하였다. Flash column chromatograhpy는 Teledyne Isco사의 CombiFlash® RetrieveTM를 이용하였고 column은 RediSep을 이용하였다. 각 분획의 추출용매 및 column chromatography용 용매는 특급시약을 사용하였다. TLC plate 는 Merck사의 precoated Kieselgel 60 F254s(layer thickness 0.25 mm, 20×20 cm, Merck Art. No. 5715), RP-18 F254s를 사용하였으며, column chromatography의 충진제는 Merck사의 Kieselgel 60(63-200 μm 또는 40-63 μm) 및 YMC gel ODS-A(150 μm)를 사용하였다. TLC spot 발색은 254 nm UV 및 20% 황산용액을 사용하였다.

추출 및 분리 −채집하여 음건한 오동나무(P. coreana)의 어린가지 4.2 kg을 세절하여 MeOH 12 L에 넣은 후 실온에서 1주일간 추출한 후 여과하여 여액을 감압농축기를 이용하여 농축하여 MeOH 엑스(350g)를 얻었다. 얻어진 MeOH 추출물을 증류수에 현탁시켜 n-hexane으로 분획하여 n-hexane 분획 14.6 g을 얻었고, 남은 물층에 chloroform을 가하고 분획하여 chloroform 가용성 분획 11.6 g을 얻었으며, 다시 남은 물층에 n-BuOH을 가하고 분획하여 n-BuOH 가용성 분획 51.6 g을 얻었으며, 남은 물층은 제거하였다. 얻어진 이들 분획 중 양이 가장 많은 n-BuOH 가용성 분획으로부터 화합물을 분리하기 위하여 연구에 착수하였다. n-BuOH 가용성 분획(50 g)을 silica gel(Merck, 63-200 μm, 1kg) column(15×50 cm)에 걸어 CHCl3:MeOH:H2O=30:40:1을 용매로 용출시켜 7 개의 소분획(Fr. A~Fr. G)을 얻었다. 소분획 Fr. A(1.1 g)을 대상으로 silica gel (Merck, 63-200 μm,100 g) column(5×50 cm)에 걸고 n-hexane:EtOAc=4:1을 용매로 용출시켜 5 개의 소분획(Fr.A-1~Fr.A-5)으로 나누었다. 이 중 소분획 Fr.A-3을 다시 n-hexane:EtOAc=5:1 을 용매로 silica gel column(Merck, 40-63 μm,40g, 3×20 cm) 을 실시하여 화합물 1(32.1 mg)을 얻었다. 소분획 Fr. B(3.8 g) 을 silica gel column(Merck, 63-200 μm,100 g, 5×50 cm)에 걸고 CHCl3:MeOH=19:1을 용매로 용출시켜 10 개의 소분획(Fr. B-1~Fr. B-10)으로 나누었다. 이들 소분획 중 Fr. B-7을 MeOH로 재결정을 실시하여 화합물 2(88.4 mg)를 얻었다. 또한, Fr. B-3(0.6 g)을 대상으로 n-hexane:EtOAc=15:1을 용매로 flash column chromatography(CombiFlash® RetrieveTM, RediSep flash column 40 g)를 실시하여 8 개의 소분획(Fr. B-3-1~Fr. B-3-8)으로 나누었고, 이들 소분획 중 Fr. B-3-5 (0.07 g)을 대상으로 MeOH:H2O=90:10을 용매로 flash column chromatography(CombiFlash® RetrieveTM, RediSep ODS flash column(40 g)를 실시하여 화합물 3(21 mg)과 4(11.6 mg)를 각각 얻었다. Fr. D(6.1 g)을 silica gel column(Merck, 63-200 μm, 500 g, 10×50 cm)에 걸고 CHCl3:MeOH=4:1을 용매로 용출시켜 7개의 소분획(Fr. D-1~Fr. D-7)으로 나누었다. 소분획 Fr. D-4(2.6 g)을 대상으로 MeOH:H2O=40:60을 용매로 flash column chromatography (CombiFlash® RetrieveTM, RediSep ODS flash column 130 g)를 실시하여 화합물 5(840 mg)을 얻었다.

화합물 1 −White powder; 1H-NMR (600 MHz, pyridine-d5) δ: 0.92 (3H, s, 25-CH3), 1.00 (3H, s, 23-CH3), 1.08 (3H, s, 26-CH3), 1.11 (3H, d, J=6.5 Hz, 30-CH3), 1.22 (3H, s, 24-CH3), 1.43 (3H, s, 29-CH3), 1.69 (3H, s, 27-CH3), 2.13 (1H, ddd, J=4.4, 11.6, 10.9 Hz, H-16β), 2.30 (1H, ddd, J=4.4, 13.5, 13.5 Hz, H-15β), 3.02 (1H, br s, H-18), 3.09 (1H, ddd, J=4.4,13.2,13.2 Hz, H-16α), 3.42 (1H, dd, J=5.0,11.1 Hz, H-3), 5.59 (1H, t-like, H-12); 13C-NMR (150 MHz, pyridine-d5) δ: 181.22 (C-28), 140.41 (C-13), 28.54 (C-12), 78.71 (C-3), 73.18 (C-19), 56.36 (C-5), 55.08 (C-18), 8.77 (C-17), 48.26 (C-9), 42.85 (C-20), 42.58 (C-14), 40.85 (C-8), 39.88 (C-4), 39.51 (C-1), 38.96 (C-22), 37.86 (C-10), 34.07 (C-7), 9.77 (C-15), 29.28 (C-23), 28.56 (C-2), 27.63 (C-21), 27.42 (C-29), 26.86 (C-16), 25.18 (C-27), 24.52 (C-11), 19.44 (C-6), 17.69 (C-26), 17.28 (C-24), 17.00 (C-30), 16.09 (C-25); ESI-MS (negative mode), m/z 471 [M-H]-

화합물 2 −Amorphous white powder; 1H-NMR (600 MHz, pyridine-d5) δ: 0.91 (3H, s, 23-CH3), 0.99 (3H, s, 25-CH3), 1.12 (3H, s, 26-CH3), 1.13 (3H, d, J=6.2 Hz, 30-CH3), 1.27 (3H, s, 24-CH3), 1.42 (3H, s, 29-CH3), 1.65 (3H, s, 27-CH3), 1.76 (1H, t, J=11.9 Hz, H-1α), 1.90 (1H, dd, J=4.2,12.0 Hz, H-1β), 2.34 (1H, ddd, J=4.2,13.6,13.6 Hz, H-15β), 3.05 (1H, s, H-18), 3.12 (1H, ddd, J=4.6, 12.9, 13.2 Hz, H-16α), 3.76 (1H, d, J=2.5 Hz, H-3β), 4.31 (1H, ddd, J=2.8,4.1,11.4 Hz, H-2β), 5.59 (1H, s, H-12); 13C-NMR (150 MHz, pyridine-d5) δ: 180.67 (C-28), 139.95 (C-13), 127.99 (C-12), 79.35 (C-3), 72.68 (C-19), 66.11 (C-2), 54.59 (C-18), 48.76 (C-5), 48.28 (C-17), 47.64 (C-9), 42.88 (C-14), 42.37 (C-1), 42.18 (C-20), 40.59 (C-8), 38.80 (C-10), 38.50 (C-22), 33.52 (C-7), 29.46(C-23), 29.25(C-15), 27.07(C-29), 26.94(C-21), 26.38(C-16), 24.64 (C-27), 24.08 (C-11), 22.28 (C-24), 18.60 (C-6), 17.27 (C-26), 16.79 (C-25), 16.63 (C-30); EIMS, m/z (rel. int.) 488 [M]+ (7.7), 470 [M-H2O]+ (5.7), 442 [M-(COOH+H)]+ (36.8), 424 (18.1), 409 (7.3), 370 (12.2), 264 [D/E ring (a)]+ (12.5), 246 (31.7), 218 (32.7), 201 (37.2), 146 (100).

화합물 3 −Amorphous white powder; 1H-NMR, (600 MHz, pyridine-d5) δ: 0.99 (3H, s, 26-CH3), 1.04 (3H, s, 25-CH3), 1.05 (3H, s, 24-CH3), 1.08 (3H, s, 30-CH3), 1.15 (3H, s, 29-CH3), 1.24 (3H, s, 23-CH3), 1.60 (3H, s, 27-CH3), 2.22 (1H, ddd, J=4.4,12.4,12.4 Hz, H-1α), 2.80 (1H, ddd, J=4.3, 14.1,12.4 Hz, H-16α), 3.35 (1H, d, J=9.5Hz, H-3α), 3.57 (1H, br d, J=4.3 Hz, H-19β), 3.59 (1H, br s, H-18β), 4.07 (1H, ddd, J=4.4,9.4,11.0 Hz, H-2β), 5.52 (1H, t-like, H-12); 13C-NMR (150 MHz, pyridine-d5) δ: 180.91 (C-28), 144.93 (C-13), 123.15 (C-12), 83.87 (C-3), 81.23 (C-19), 68.61 (C-2), 56.05 (C-5), 48.44 (C-9), 42.21 (C-14), 40.09 (C-8), 39.88 (C-4), 38.71 (C-10), 35.73 (C-20), 33.66 (C-22), 33.33 (C-7), 29.34 (C-29), 29.15 (C-15, C-21), 28.85 (C-23), 28.39 (C-16), 24.86 (C-27), 24.81 (C-30), 24.29 (C-11), 19.03 (C-6), 17.59 (C-25, C-26), 16.80 (C-24); EIMS, m/z (rel. int.) 488[M]+ (7.6), 470 (M-H2O)+ (16.3), 452 (M-2H2O)+ (3.2), 442 [M-(COOH-H)]+ (8.4), 424 [M-(COOH-H+H2O)]+(7.5), 264 [D/E ring(a)]+ (73.7), 246 (a-H2O)+ (96.1), 231 (a-H2O-CH3)+ (51.1), 219 (a-COOH)+ (16.9), 201 [a-(COOH+H2O)]+ (100)

화합물 4 −Amorphous white powder; 1H-NMR (600 MHz, pyridine-d5) δ: 0.67 (3H, s, 18-CH3), 0.88 (3H, d, J=6.8 Hz, 26-CH3), 0.89 (3H, d, J=6.8 Hz, 27-CH3), 0.91 (3H, t, J=7.3 Hz, 29-CH3), 0.95 (3H, s, 19-CH3), 1.00 (3H, d, J=6.4 Hz, 21-CH3), 2.49 (1H, br t, J=11.2 Hz, H-4a), 2.74 (1H, dd, J=13.2, 2.1Hz, H-4b), 3.96 (1H, m, H-5'), 3.99 (1H, m, H-3), 4.07 (1H, t, J=8.0 Hz, H-2'), 4.29 (1H, t, J= 8.9Hz, H-3'), 4.31 (1H, t, J=8.8 Hz, H-4'), 4.43 (1H, dd, J=11.8, 5.3 Hz, H-6'a), 4.58 (1H, dd, J=11.8, 2.0 Hz, H-6'b), 5.07 (1H, d, J=7.7 Hz, H-1'), 5.36 (1H, br t, J=2.4 Hz, H-6); 13C-NMR (150 MHz, pyridine-d5) δ: 140.94 (C-5), 121.94 (C-6), 102.60 (C-1'), 78.63 (C-5'), 78.50 (C-3), 78.13 (C-3'), 75.36 (C-2'), 71.72 (C-4'), 62.87 (C-6'), 56.86 (C-14), 56.28 (C-17), 50.37 (C-9), 46.07 (C-24), 42.51 (C-13), 39.98 (C-4), 39.36 (C-12), 37.51 (C-1), 36.95 (C-10), 36.42 (C-20), 34.24 (C-22), 32.20 (C-7), 32.09 (C-8), 30.28 (C-2), 30.04 (C-25), 29.50 (C-16), 28.57 (C-23), 26.42 (C-15), 24.54 (C-15), 23.42 (C-28), 21.31 (C-11), 20.00 (C-26), 19.45 (C-19), 19.24 (C-21), 19.04 (C-27), 12.18 (C-29), 12.01 (C-18); ESI-MS (positive mode), m/z 599 [M+Na]+.

화합물 5 −Amorphous white powder; 1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ: 6.73 (2H, s, H-2, H-6), 6.47 (1H, d, J=15.9 Hz, H-7), 6.34 (1H, dt, J=5.2, 15.9 Hz, H-8), 4.91 (1H, d, J=7.2 Hz, H-1'), 4.11 (2H, t-like, J=4.0 Hz, H-9), 3.77 (6H, s, OCH3×2); 13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6) δ: 135.18 (C-3, C-5), 134.35 (C-4), 133.08 (C-7), 130.64 (C-1), 128.92 (C-8), 104.95 (C-2, C-6), 103.05 (C-1'), 77.67 (C-5'), 77.02 (C-3'), 74.66 (C-2'), 70.42 (C-4'), 61.93 (C-9), 61.38 (C-6'), 56.83 (OCH3×2); ESI-MS (negative mode), m/z 371 [M-H]-

 

결과 및 고찰

화합물 1의 1H-NMR spectrum을 보면 δ0.92, 1.00, 1.08, 1.22, 1.43 및 1.69에서 6개의 methyl기에 의한 singlet signal 을 확인할 수 있고, δ1.11에서 또 다른 하나의 methyl기가 J=6.5 Hz의 doublet으로 나타나는 것을 확인할 수 있어 이 화합물을 ursane계 triterpenoid계열의 화합물로 추정할 수 있었으며, δ3.02에서 나타나는 H-18의 signal이 broad singlet 으로 나타나고, δ3.09에서 16번의 α proton이 J=4.4,13.2, 13.2 Hz의 double triplet으로 나며 13C-NMR spectrum의 δ73.18에서 C-19의 signal이 나타나 ursolic acid의 signal보다 약 43 ppm 저자장 shift하므로 이 화합물은 ursane계열의 19번 위치에 hydroxyl기가 치환되어 있는 화합물임을 알수 있었다.12,13) 또한, LC-ESI MS로 측정한 분자량의 값이 m/z 471 [M-H]+에서 나타나는 것을 확인하였다. 이러한 결과와 문헌14)을 비교하여 화합물 1은 pomolic acid로 그 구조를 동정하였다. Pomolic acid는 다양한 식물에 함유되어 있기 때문에 활성에 관한 연구도 매우 다양하게 이루어지고 있지만 cytotoxicity,15-17) foam cell 형성 억제활성18,19)과 관련된 연구의 결과들이 주로 발표되었으며, nematicidal acitiity20)나 anti-HIV acitivity21)에 관한 연구 결과도 발표되었다.

화합물 2의 1H-NMR spectrum에서도 δ0.91, 0.99, 1.12, 1.27, 1.42 및 1.65에서 6개의 methyl기에 의한 singlet signal 을 확인 할 수 있었을 뿐 아니라 δ1.13에서 J=6.2 Hz의 doublet으로 나타나는 methyl기의 signal을 확인할 수 있었고, δ3.05에서 H-18의 signal이 singlet으로 나타나고 δ3.12 에서 H-16α signal이 J=4.6, 12.9, 13.2Hz의 double doublet 으로 나타타므로 이 화합물도 화합물 1과 동일하게 C-19 위치에 치환기가 존재하는 물질임을 알 수 있었다. 그러나 화합물 2는 화합물 1과 다르게 1번의 proton들이 δ1.76에서 J=11.9 Hz의 triplet, δ1.90에서 J=4.2, 12.0 Hz의 double triplet으로 나타나고, 2번의 proton이 δ4.31에서 2.8, 4.1, 11.4 Hz의 double doublet으로 나타났다. 또한, δ3.76에서 3번의 proton이 J=2.5 Hz의 doublet으로 나타나는 것을 확인 할 수 있었다. 13C-NMR spectrum의 δ22.28에서 C-24 methyl기가 나타나는데 반하여 화합물 1의 C-1 signal은 δ17.28에서 나타나므로 5 ppm 저자장 이동되었음을 알 수 있었으며 이는 화합물 2의 3번에 치환된 hydroxyl기는 α(axial)로 결합되어 있음을 알 수 있었다. C-2의 signal이 δ66.11에서 나타나 화합물 1의 2번 탄소의 signal보다 37.55 ppm 저자장 이동된 것으로부터 화합물 2는 2번 탄소에도 hydroxyl기가 치환되어 있음을 알 수 있었으며 3번 proton 이 1H-NMR specturm의 δ3.76에서 J=2.5 Hz의 비교적 적은 값의 doublet으로 나타나므로 2번 탄소에 치환된 hydroxyl 기도 α(axial)로 결합되어 있음을 알 수 있었다.12,13) EI-MS 로 측정한 MS spectrum에서 분자량이 m/z 488에서 나타나화합물 1의 분자량보다 한 개의 hydroxyl기만큼 많음을 알 수 있었으므로 위의 사실과 일치함을 알 수 있었다. 이들 결과와 문헌22)을 비교하여 화합물 2는 euscaphic acid로 동정하였다. 이 화합물도 pomolic acid와 마찬가지로 다양한 식물에 함유되어 있어 항염증활성,23,24) 동맥경화억제활성,25) 항암활성 증강작용26) 등의 활성이 보고되었다. 화합물 3은 1H-NMR spectrum의 δ0.99, 1.04, 1.05, 1.08, 1.15, 1.24 및 1.60에서 angular methyl기에 의한 singlet들이 나타나므로 화합물 1과 2와는 다른 oleanane계열의 triterpenoid 화합물임을 알 수 있었다. 또한, EI-MS로 측정한 분자량이 m/z 488[M]+에서 나타나 화합물 2와 동일한 분자량을 가지고 있음을 알 수 있었다. 1H-NMR spectrum의 δ3.35에서 H-3가 J=9.5Hz의 doublet으로 나타나고, δ3.57에서 H-19가 J=4.3 Hz의 doublet으로 나타나며, δ4.07에서 H-2가 J=4.4,11.0, 9.4Hz의 double triplet으로 나타났다. 또한, 13C-NMR spectrum의 δ83.87에서 C-3, δ81.23에서 C-19 그리고 δ68.61 에서 C-2의 signal들이 나타나므로 이 화합물도 2, 3 및 19번 위치에 OH가 결합되어 있음을 알 수 있었다. 13C-NMR spectrum의 δ16.80에서 24번의 methyl기의 signal이 나타나는 것으로부터 3번의 OH는 β로 결합하고 있음을 알 수 있었으며 3번의 proton이 1H-NMR의 δ3.35에서 J=9.5 Hz의 doublet으로 나타나 비교적 큰 값의 coupling constant를 가지므로 2번 탄소의 OH는 α로 결합하고 있음을 알 수 있었다. EI-MS spectrum의 분자량이 m/z 488에서 나타나고 retro Diels-Alder반응에 의하여 생성된 fragmentation ion 중 D/E ring에 의한 fragmentation ion이 m/z 264에서 나타나난 것으로부터도 위의 사실을 확인할 수 있었다. 또한, HSQC, HMBC 및 NOESY 등의 분석을 통하여 구조를 확인하였다. 이러한 사실과 문헌14,27)을 비교하여 화합물 3은 arjunic acid로 동정하였다. Arjunic acid의 활성으로는 항염증,28,29) 세포독성,29,30) 및 항산화31)활성이 보고되었다. 화합물 4는 1H- 및 13C-NMR spectrum과 MS spectrum의 data를 문헌32) 과 비교하여 daucosterol로 동정하였으며 이 화합물은 박 등이 참오동나무(Paulownia tomentosa)의 줄기로부터 분리, 보고한 바 있다.33) 화합물 5의 1H-NMR spectrum을 보면 δ6.73에서 proton 2개에 해당하는 singlet이 나타나고, δ6.47 에서 나타나는 J=15.9Hz의 doublet, δ6.34에서 나타나는 J=15.9, 5.2의 doublet-triplet 및 δ4.11에서 나타나는 J=4.0 Hz의 triplet 모양의 signal과 더불어 δ3.77에서 두 개의 methoxyl기에 의한 signal이 나타났다. 이 결과로부터 이 화합물은 3,4,5번에 치환기가 존재하는 trisubstituted phenylpropanoid계열의 화합물임을 알 수 있었으며 2번과 6번의 치환기는 methoxyl기임을 알 수 있었다. 또한, 1H-NMR spectrum의 δ4.91에서 나타나는 J=7.2 Hz의 doublet으로부터 이 화합물에는 한 개의 당이 β로 결합하고 있음을 알 수 있었으며, 결합된 당의 종류는 가수분해 후 TLC분석을 통하여 D-glucose임을 알 수 있었다. 당의 결합위치는 4번 또는 9번에 결합되어 있으므로 이들 두 탄소의 13C-NMR shift 를 비교한 결과 C-4는 δ134.35에서 나타나고, C-9는 δ61.93 에서 나타났다. 이 chemical shift를 문헌34)과 비교한 결과 당은 4번 위치에 결합되어 있음을 알 수 있었다. 위의 사실을 문헌35)과 비교하여 화합물 5는 syringin으로 동정할 수 있었으며, 이 화합물은 참오동나무(P. tomentosa)의 수피로 부터 분리, 보고된바 있다.36) Syringin의 활성으로는 세포독성,37) 수면유도,38) 신경보호39) 및 항염증40) 등이 보고되어 졌다.

 

결 론

오동나무 가지의 함유 성분을 밝히고 이들의 구조를 동정하여 자원화 가능성을 알아보기 위하여 연구에 착수하고 MeOH 추출물의 n-BuOH 가용성 분획으로부터 5종의 화합물을 분리하였으며, 각종 기기분석을 통하여 분리된 화합물의 구조를 동정한 결과 분리된 화합물의 구조는 각각 pomolic acid (1), euscaphic acid (2), arjunic acid (3), daucostero (4) 및 syringin (5)임을 알 수 있었으며 이들 성분은 이 식물로부터는 처음으로 분리된 것이었다. 또한, 본 연구를 통해 분리된 화합물들이 다양한 활성을 가지므로 오동나무 가지는 약용 자원화를 위한 자원으로서 사용할 가치가 있는 것으로 생각된다.