Relationship between the Regulator of Calcineurin 1-4 Isoform and In Vitro Osteoclast Differentiation

Regulator of calcineurin 1-4과 파골세포 분화의 관련성

Abstract

Regulator of calcineurin 1 (RCAN1) is an endogenous calcineurin inhibitor that plays an important role in the pathogenesis of diseases related to the calcineurin-NFATc1 signaling pathway. The RCAN1-4 isoform is subject to NFATc1-dependent regulation. During receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand (RANKL)-stimulated osteoclastogenesis, the calcineurin-NFATc1 pathway is critical. Because there is little information available on the role of RCAN1 in osteoclast differentiation, this study investigated whether changes in RCAN1 expression are related to the calcineurin-NFATc1 pathway and osteoclast differentiation. Mouse bone marrow monocytes (BMMs) were treated with 50 ng/ml of RANKL and M-CSF. Expression levels of NFATc1, calcineurin, and RCAN1 isoforms were determined using RT-PCR and Western blotting. Osteoclast differentiation was examined using tartrate-resistent acid phosphatase (TRAP) staining. To evaluate the effect of RCAN1 overexpression on osteoclastogenesis, cells were transfected with a mouse RCAN1-4 cDNA plasmid. After RANKL stimulation of BMMs, expression of NFATc1 and RCAN1 was increased at the mRNA and protein level, while calcineurin expression was unchanged. When the RCAN1-4 gene construct was transfected, the expression of RCAN1 protein was not increased despite several-fold increases in RCAN1-4 mRNA expression. Regardless of RANKL stimulation, over-expression of RCAN1-4 tended to reduce NFATc1 expression and knock-down of RCAN1 increase it. While BMMs transfected with the RCAN1-4 vector were differentiated into distinct osteoclasts, their phenotypes did not vary from those of mock controls. These results suggest that RCAN1 has a limited effect on the calcineurin-NFATc1 pathway during RANKL-stimulated osteoclast differentiation.

RCAN1은 calcineurin을 억제하는 내인성 단백질로 calcineurin-NFATc1 신호전달 경로와 관련된 질환의 병인에 중요한 역할을 담당한다. 특히 RCAN1-4 아형 유전자의 경우 NFATc1 전사인자에 의해 조절된다. RANKL 자극은 calcineurin-NFATc1 경로로 파골세포 분화를 유도하는데, RCAN1과 파골세포의 분화에 관련된 연구는 보고 된 바 없다. 따라서 본 연구는 RANKL 처리에 의해 파골세포 분화가 유도될 때 RCAN1이 calcineurin-NFATc1 경로에 미치는 영향을 in vitro에서 조사했다. 마우스로부터 분리한 골수단핵세포에 RANKL을 처리하여 파골세포 분화를 유도했다. RANKL 처리 후 조사 대상 유전자의 mRNA 발현과 단백질 발현을 각각 RT-PCR과 Western blot로써 측정했다. 마우스 RCAN1-4 vector를 파골전구세포인 RAW 264.7 단핵세포주와 골수단핵세포에 형질도입(transfection)시켜 RCAN1-4 유전자의 과발현을 유도했다. 형질도입 후 파골세포 분화의 형태적 변화는 TRAP 염색을 통해 관찰했다. RANKL 처리 후 NFATc1, calcineurin, RCAN1-4 mRNA 발현은 크게 증가했다. 단백질 발현의 경우 NFATc1과 RCAN1은 증가했으나 calcineurin은 대조군과 차이가 없었다. RCAN1-4 유전자의 과발현 유도 시 RCAN1-4 mRNA는 크게 증가되었으나 RCAN1 단백질 발현은 증가되지 않았다. 특히 RANKL 존재 시 RCAN1 유전자를 knock-down시켜도 RCAN1 발현은 정상적으로 유지되었다. 한편, NFATc1 발현은 과발현 유도시 감소했고 knock-down 유도 시 증가하는 경향을 보였다. RCAN1-4 유전자 과발현을 유도한 골수단핵세포에서 배양 5일 후 파골세포 분화는 대조군과 차이가 없었다. 이러한 결과는 RANKL에 의한 파골세포 분화 시 RCAN1이 calcineurin-NFATc1 경로를 통해 파골세포 분화에 미치는 영향은 제한적일 것으로 사료된다.

서 론

뼈의 항상성 유지는 파골세포(osteoclast)와 조골세포(osteoblast)의 상호 지속적인 조절작용에 의해 이루어진다. 조골세포는 뼈 기질을 구성하는 단백질을 생성하고 칼슘이온대사를 조절하여 뼈 기질을 석회화시킴으로써 골 형성을 유도하며, 파골세포는 뼈의 표면으로 cathepsin K, metalloproteinase 같은 단백질 분해 효소를 분비하여 뼈의 기질 성분을 분해하여 골 흡수를 일으킨다[2, 13, 24]. 파골세포는 골수의 조혈모세포(hematopoietic stem cell)로부터 골수단핵세포(bone marrow monocyte, BMM)를 거쳐 파골세포로 분화되는데, 이 때 macrophage colony-stimulating factor (M-CSF)와 receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand (RANKL)이 필수적이다. 파골세포가 성숙되면 최종적으로 거대한 다핵세포(multi-nuclear cells)의 형태를 갖는다. 특히 RANKL은 T-세포나 조골세포 세포막에서 발현하여 골수단핵세포의 세포막에 존재하는 receptor activator of NF-kB (RANK) 수용체와 상호작용함으로써 파골세포의 분화를 촉진시키는 핵심 물질이다[7, 16]. RANK의 신호에 따라 세포질에 존재하는 TNF receptor associated factor 6 (TRAF6)가 활성화되고 세포 내 Ca2+ 농도의 증가로 calcineurin 활성화가 일어난다. Calcineurin은 탈인산효소(phosphatase)로서 이것에 의해 세포질 내 nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic 1 (NFATc1)의 탈인산화가 일어나면, NFATc1 는 핵 안으로 이동하여 표적유 전자 promoter의 NFAT 결합부위(NFAT binding site)에 결속함으로써 NFATc1-의존성(NFATc1-dependent) 유전자인 NFATc1자체와 tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP), calcitonin receptor, cathepsin K, regulator of calcineurin 1 (RCAN1) 등의 발현을 촉진한다[26, 28].

RCAN1 유전자는 사람 염색체 21번 Down syndrome critical region 1 (DSCR1)에 위치하여 DSCR1이라고도 불린다. 21번 염색체가 3염색체성(trisomy)이 되면 정신지체 증상 중 하나인 다운 증후군(Down syndrome)이 나타나는데 주된 요인 중의 하나가 RCAN1인 것으로 알려져 있다[9, 11]. RCAN1 유전자는 7개 엑손으로 구성되어 있으며, RCAN1-1은 엑손 1번과 엑손 5, 6, 7번이, RCAN1-4는 엑손 4번과 엑손 5, 6, 7번까지 암호화되어 만들어진다[6]. 두 아형 모두 N-말단과 C-말단에 calcineurin과 결합하여 calcineurin 작용을 억제할 수 있는 공통점을 갖고 있다 [8, 18, 21]. 한편 RCAN1-1 유전자는 뇌, 신경조직, 심근, 골격근 등에서 발현이 높으며 반면, RCAN1-4 유전자의 경우 조직 간 분포가 RCAN1-1와 유사하나 뇌에는 약하게 분포하는 것으로 알려져 있다[9]. 유전자 조절 측면에서 RCAN1-1은 고혈당, glucocorticoid 등의 자극에 의해 활성화되고 Notch 신호전달 경로에 의해 하향조절되지만[12, 17, 19], RCAN1-4의 경우 대부분 칼슘 신호 자극에 의해 활성화되어 calcineurin-NFATc 경로를 통해 유전자 발현이 변화되는 차이점도 있다[4, 6, 25]. RCAN1-1 유전자와 RCAN1-4 유전자가 calcineurin 억제하는 공통적인 작용이 있음에도 불구하고 RCAN1-4가 calcineurin-NFATc 경로에 더욱 민감하게 반응하는 이유는 이것의 인트론 3번에 위치하는 promotor에 다수의 NFAT 결합부위가 존재하는 것과 관련이 있을 것으로 추측된다. 일례로 Cano 등에 따르면 신경세포의 탈분극에 의해 세포 내 칼슘 농도가 증가하면 RCAN1-4 mRNA 발현이 증가하며, 이러한 전사 증가는 calcineurin 억제제인 cyclosporin A에 의해 억제된다[4]. 뿐만 아니라 RCAN1-4 전사가NFAT 신호전달 과정을 통해 이루어짐이 확인되었다[4].

지금까지 RCAN1에 관한 연구들은 주로 심장근, 뇌 신경세포 등에 집중되었으며 파골세포 분화 과정에서 RCAN1과 그아형의 직, 간접적인 역할과 calcineurin, NFATc1과의 상호관련성에 대한 연구는 시행되지 않았다. 따라서 연구자는 RANKL 처리에 의한 파골세포 분화 시 RCAN1 아형의 발현 변화와 calcineurin-NFATc1 경로와의 관련성 그리고 RCAN1-4 유전자의 형질도입이 파골세포의 분화에 미치는 영향을 조사했다.

 

재료 및 방법

골수단핵세포의 분리

본 실험은 동물실험윤리위원회의 승인(고신 13-14)을 받은 후 시행했다. C57BL/6 마우스(12∼19 주령)로부터 골수단핵세포 분리는 Weischenfeldt 등의 방법을 사용했다[27]. 간략히 서술하면, 대퇴골과 경골로부터 골수세포를 채취한 후 α-MEM 배지에 M-CSF (R&D system, Minneapolis, MN, USA)를 10 ng/ml로 첨가하여 37℃, 5% CO2 세포배양기에서 24시간 배양했다. 24시간 후, 배지 상등액에 존재하는 세포만 모아 다시 48시간 동안 배양했는데, 이 때 M-CSF 농도는 50 ng/ml으로 유지했다. 이후, 바닥에 착상한 골수단핵세포(bone marrow monocyte, BMM)를 본 실험에 사용했다. 골수단핵세포에서 파골세포로의 분화를 위해 10% FBS가 포함된 α-MEM 완전배지에 M-CSF과 RANKL (R&D system)을 각각 50 ng/ml을 동시에 처리하고 하루 간격으로 신선한 배지 교환과 약물처리를 했다. 마우스에서 유도된 단핵/파골세포주인 Raw264.7세포 또한 α-MEM 완전배지에 배양했다.

통상적(conventional) 및 정량적(quantitative) RT-PCR

TRIzol 용액(Invitrogen)을 사용하여 RNA를 추출하고, 총 RNA 1 μg으로부터 cDNA를 합성하여 PCR을 시행했다. 통상적 PCR 과정은 pre-denaturation; 94℃, 5분, denaturation; 95℃, 30초, primer annealing; 55℃, 30초, extension; 72℃, 30초, final extension; 72℃, 5분으로 시행했다. β-actin은 25주기로 설정했고 그 외 나머지 primer는 32주기로 설정했다. 정량적 PCR은 상기 cDNA를 SYBR green I master mix (Takara, Shiga, Japan)에 섞은 후 ABI prism 7300 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 사용하여 시행했다. 증폭은 95℃ 10초 일회, 95℃ 5초 및 60℃ 1분의 과정이 40회 시행되었으며, 결과 분석은 delta-delta 방법(user Bulletein #2, Applied Biosystems)을 이용하여 상대적 발현의 크기를 구했다. 위의 두 종류의 실험 방법에 이용한 primer의 염기서열은 동일했으며 다음과 같다. NFATc1: forward TCC ACC CAC TTC TGA CTT CC, reverse GCG TGA GAG GTT CAT TCT CC, RCAN1-1: forward AGC TTC ATC GAC TGC GAG AT, reverse GGG GGT GGC ATC TTC TAC TT, RCAN1-4: forward GTG TGG CAA ACG ATG ATG TC, reverse GGG GGT GGC ATC TTC TAC TT, calcineurin: forward GT CGT CAA AGC TGT TCC TT, reverse GCA GGT GAT CCT CCT ACT TCA, β-actin: forward GAC GGC CAG GTC ATC ACT AT, reverse CTT CTG CAT CCT GTC AGC AA.

Western blot

6-well plate에서 배양한 골수단핵세포에서 단백질 추출은 다음과 같이 시행했다. 단백효소(protease) 억제제가 포함된 용액(iNtRON biotechnology, Daejeon, Korea)에 세포를 모은 후 초음파분산기(ultrasonicator)로 세포를 파쇄하여 세포 균등액을 만들었다. 10 μg의 단백질을 SDS-PAGE하여 PVDF막으로 단백질을 전이시켰다. 1% Tris-buffered saline (TBS-T)용액에 5% skim milk를 첨가하여 상온에서 1시간 blocking했다. 1차 항체는 rabbit polyclonal calcineurin 항체(Santa Cruz biotechnology, Dallas, TX, USA)과 mouse monoclonal NFATc1 항체(Santa Cruz), rabbit polyclonal RCAN1 항체(NOVUS biologicals, Littleton, CO, USA), rabbit monoclonal β-actin 항체(Cell signaling, Danvers, MA, USA)를 사용했다. 1차 항체를 4℃에서 24시간 동안 반응시킨 후 세척하고 HRP (horseradish peroxidase conjugated)가 결합된 2차 항체를 반응시킨 후 ECL (Advansta, Menlo Park, CA, USA)을 사용하여 단백질 발현을 측정했다.

RCAN1-4 유전자의 과발현과 RCAN1 유전자의 knock-down

마우스 RCAN1-4 cDNA plasmid (TrueCloneTM, Origene, Rockville, MD, USA)와 pcDNA3.1+ plasmid (mock control로 사용)를 competent E. coli에 형질도입(transfection)시킨 다음, plasmid DNA를 추출하여 260 nm에서 흡광도를 측정하여 순수하게 분리되었음을 확인했다. 골수단핵세포 또는 Raw264.7 세포를 6-well plate에 well 당 8×104개의 세포를 심은 후 24시간 배양했다. TurboFECT (Thermo Scientific Inc., Waltham, MA, USA)시약을 사용하여 혈청과 항생제가 포함되지 않은 α-MEM 배지에 TurboFECT reagent와 RCAN1-4 plasmid DNA의 비율을 정확하게 3:1로 준비하여 혼합물을 만든 후 상온에서 25분 반응시켰다. 이 혼합물을 α-MEM 완전배지에 넣어 24시간 또는 72시간 처리하여 RCAN1-4 유전자의 과발현을 유도시켰다.

siRNA 실험은 Raw264.7 세포를 6-well plate에 70~80% confluency가 이루어지도록 파종한 후 Dhamacon의 RCAN1 siRNA SMARTpool와 대조 siRNA을 DharmaFECT-4 (Thermo Scientific Inc.) 시약을 사용하여 100 nM의 농도로 첨가한 후 항생제가 포함되지 않은 α-MEM 완전배지에서 24시간 배양했다. 24시간 배양 후 RANKL 또는 vehicle을 넣고 다시 24시간 더 배양했다.

파골세포 염색

RCAN1-4 유전자의 과발현 유도 후 파골세포 분화를 관찰하기 위해 TRAP 염색을 시행했다. 세포를 10% formaldehyde 용액으로 고정한 다음 acid phosphatase leukocyte TRAP kit(Sigma-Aldrich)를 사용하여37℃에서 1시간 반응시켜 파골세포의 염색을 관찰했다. 세포 내 핵이 3개 이상 포함된 것을 파골세포로 간주했다.

통계처리

자료는 평균±표준편차로 표시했으며 통계 처리는 unpaired Student′s t-검정을 시행했다. p<0.05인 경우 통계적으로 유의한 것으로 판정했다.

 

결 과

RANKL 처리 후 골수단핵세포에서 RCAN1아형의 발현 변화

RANKL 자극은 파골세포 분화의 핵심 전사인자인 NFATc1 발현을 증가시키기 때문에 NFATc1발현을 양성대조군(positive control)으로 이용했다. Fig. 1에서 보듯이 RANKL 처리 72시간 후 NFATc1 mRNA와 단백질의 발현이 크게 증가했다. Calcineurin의 경우 mRNA 발현은 증가하는 경향을 보였으나 단백질 발현은 차이가 없었다, RCAN1은 RCAN1-1과 RCAN1-4 두 가지 아형으로 발현된다. RANKL 처리 후 RCAN1-1 mRNA 발현은 증가하지 않았지만 RCAN1-4 mRNA 발현은 증가했다. 이는 외부 자극 시 RCAN1-4 mRNA만 증가한다는 기존의 보고와 일치한다. 단백질의 경우 RCAN1 발현은 증가했다. 현재 RCAN1-1과 RCAN1-4 단백질에 특이적으로 결합하는 항체는 시판되지 않으므로 RCAN1 전체와 결합하는 항체를 이용했는데, RCAN1 단백질의 증가는 mRNA 발현으로 미루어 RCAN1-4 단백질의 발현이 증가된 결과일 것으로 추정된다.

Fig. 1.Effect of RANKL stimulation on the expression of mRNA and protein in BMMs. BMMs were treated with RANKL (50 ng/ml) for 72 hr. (A and C) The expression of NFATc1, RCAN1, and calcineurin mRNA and protein was analyzed. β-Actin was used as the loading control. (B) For comparision of the relative expression of RCAN1-1 and RCAN1-4 mRNA, quantitative real-time RT-PCR was performed in triplicate. Data are expressed with mean ± SD. * p<0.05 vs. RCAN1-1 mRNA in the presence of RANKL.

RCAN1-4유전자의 형질도입

마우스 RCAN1-4 plasmid를 Raw264.7세포와 골수단핵세포에 형질도입시키고 RANKL을 처리하지 않은 상태에서 배양 24시간 후 RCAN1-4 유전자의 발현을 mRNA와 단백질 수준에서 확인했다. Fig. 2에서 보듯이 두 종류의 세포 모두 형질 도입 후 RCAN1-1 mRNA 발현은 변화가 없고 RCAN1-4 mRNA가 과발현됨을 확인했다. 전체적으로 골수단핵세포에 비해 Raw264.7세포에서 RCAN1-4 mRNA 발현이 많았다. 그러나 RCAN1-4 mRNA 발현 증가에도 불구하고 RCAN1 발현은 증가하지 않았다.

Fig. 2.Expression of RCAN1 mRNA and its protein after RCAN1-4 transfection in RAW 264.7 cells and BMMs. Cells were transfected with 1 μg of RCAN1-4 vector for 24 hr in the absence of RANKL, and expression of RCAN1 mRNA and protein was analyzed.

RCAN1 과발현과 knock-down 후 NFATc1의 발현 변화

RCAN1 발현의 변화에 의해 calcineurin-NFATc1 경로가 영향을 받는지 조사하기 위해 Raw 264.7세포에서 RCAN1-4 유전자의 과발현과 RCAN1 유전자의 knock-down 조건에서 NFATc1 발현을 조사했다. Fig. 3에서 보듯이 과발현 유도시 RCAN1-4 vector의 양이 많은 경우에만(4 ug) RCAN1 발현이 미약하게 증가되었고 NFATc1 발현은 현저히 감소했다. 이러한 현상은 RANKL의 존재 유무와 관계없이 비슷하게 관찰되었다. 그러나 siRNA 실험을 통해 RCAN1을 knock-down시킨 경우 RANKL 부재 시 RCAN1 발현이 상당히 감소되었으나 RANKL 존재 시 RCAN1 발현은 대조군과 차이가 없었다. 이는 RANKL이 존재하여 siRNA 효율이 저하되었거나 아니면 RANKL에 의해 RCAN1 발현이 보상적으로 증가되었기 때문으로 추측된다. RCAN1 knock-down이 수행된 경우 RANKL의 존재 유무와 관계없이 NFATc1 발현은 증가되는 경향을 보였다.

Fig. 3.Changes in NFATc1 expression after RCAN1-4 transfection or siRNA against RCAN1 gene in RAW 264.7 cells. (A) Transfection to achieve transient over-expression was performed with two different doses of the RCAN1-4 construct for 24 hr, and then was followed by 24 hr incubation in the presence or absence of RANKL. (B) Transfection to achieve transient knock-down was conducted with 100 nM of RCAN1 siRNA for 24 hr, and then was followed by 24 hr incubation in the presence or absence of RANKL.

RCAN1-4형질도입 후 파골세포 분화의 효과

골수단핵세포에서 RCAN1-4 유전자의 과발현 시 파골세포의 분화가 영향을 받는지 알아보기 위해 TRAP 염색을 시행했다(Fig. 4). 골수단핵세포는 파골세포로 분화되면 세포와 세포간의 융합이 발생하여 커다란 다핵세포가 형성된다. 형질도입을 24시간과 72시간 동안 시행한 후 RANKL을 5일간 처리하여 파골세포 분화를 유도했을 때 RCAN1-4 유전자 형질도입군과 공백터(empty vector)를 처리한 대조군 사이에 파골세포 분화의 차이는 발견되지 않았다. 72시간 형질도입시킨 경우 transfection 용액의 독성 작용으로 인해 골수단핵세포의 수가 급격히 감소되었으나 파골세포 분화 양상은 24시간 처리군과 비교하여 차이가 없었다.

Fig. 4.Effect of transient over-expression of RCAN1-4 on osteoclast differentiation in BMMs. After BMMs were transfected for 24 hr and 72 hr, they were stimulated with RANKL for an additional 5 days. There was no significant difference in osteoclast differentiation between the mock control and RCAN1-4 transfection. Magnification: ×40.

 

고 찰

뇌세포에서 RCAN1은 음성 되먹임(negative feedback)을 통해 calcineurin 작용을 억제함으로써 세포내 RCAN1과 calcineurin 간의 균형을 조절하는 것으로 알려져 있다[20, 28]. 본 연구에서는 RANKL 자극에 의한 파골세포 분화 시 RCAN1 발현의 변화와 calcineurin-NFATc1 경로와의 관련성을 조사했다. RANKL 자극 후 파골세포 분화의 필수 전사인자인 NFATc1 발현이 증가했는데 이는 파골세포 분화가 진행됨을 반영한다. 이 때 RCAN1 유전자의 alternative splicing에 의해 형성되는 RCAN1-1 mRNA 발현은 차이가 없었고 RCAN1-4 mRNA 발현만 증가했는데, 이는 RCAN1-4 mRNA 발현이 외부 자극에 의해 영향을 받는다는 종래의 보고와 일치한다[1, 3]. 결과에서 언급했듯이 RCAN1-4 단백질과 특이적으로 결합하는 항체는 아직 시판되지 않기 때문에 RCAN1-4 발현이 증가했는지 알 수 없다. 그러나 Fig. 1에서 보듯 RCAN1 발현이 뚜렷하게 증가되지 않았지만, 증가하는 경향을 보였기 때문에 RCAN1-4 mRNA 발현 증가가 RCAN1-4 발현 증가를 일부 반영했을 것으로 추정된다. 이와 달리 calcineurin 발현은 대조군과 차이가 없었는데, 이는 파골세포 분화에 있어서 RCAN1 발현과 calcineurin 발현이 적어도 서로 독립적임을 시사한다. 왜냐하면 RCAN1이 calcineurin 작용을 억제하여 NFATc1의 탈인산화가 이루어지지 않으면 NFATc1의 핵 내 유입이 억제되므로 NFATc1은 자가증폭(autoamplification) 과정이 일어나지 않게 되어 NFATc1 발현은 증가될 수 없다. Fig. 3에서 보듯 RCAN1 발현을 강제적으로 증가시킬 경우 NFATc1 발현이 감소하며, knock-down에 의해 억제시킬 경우 NFATc1 발현이 증가한다. 이에 따라 calcineurin의 발현이나 활성이 억제 혹은 촉진되었을 것으로 예상된다. 그러나 Ryeom 등은 RCAN1 넉아웃(knock out) 마우스에서 분리한 CD4+ 임파구에서 calcineurin 발현이 대조군(wild type)과 차이가 없음을 보여준 바 있다[22]. 만일 RCAN1 발현과 calcineurin 발현이 서로 독립적이라 하더라도 RCAN1 증가에 의해 clacineurin 작용이 억제될 가능성은 충분히 존재한다. 이 경우 calcineurin-NFATc1 경로가 저해되어 파골세포 분화에 영향을 줄 수 있다. 그러나 RANKL 처리 4일과 5일 후에도 파골세포 분화 현상이 더욱 확연하게 진행되는 결과로 미루어(자료는 표시하지 않음), 증가된 RCAN1에 의해 calcineurin의 되먹임 억제(feedback inhibiton)가 효과적으로 이루어지지 않았음을 의미한다. 그 이유로 첫째, calcineurin 작용과 무관한 파골세포 형성 경로가 존재할 가능성이 있다. Kuroda 등은 세포질에는 Ca2+/calcineurin의 작용과 관련된 NFATc1경로와 Ca2+/calcineurin의 작용과 관련되지 않은 NFATc1 경로가 공존하며, 이 두 가지 경로 모두 파골세포 형성에 영향을 준다고 설명했다[15]. 둘째, RANKL 처리 후 calcineurin 단백질 양은 동일하더라도 이 효소의 활성이 도리어 증가되었을 가능성이다. Hasegawa 등은 파골세포 전구세포인 RAW264.7 세포에 RANKL을 처리하면 calcineurin 활성도가 1.5배 정도 증가함을 관찰한 바 있다[10]. 셋째, calcineurin 작용을 억제할 만큼 충분한 RCAN1 발현이 이루어지지 않았을 가능성이다. 현재까지 calcineurin과 RCAN1의 반응 관계에 관한 stoichiometry에 대해 알려진 바는 없다. 다만 RCAN1이 과발현되면 calcineurin의 작용이 억제되고[10], RCAN1이 제거(knock out) 되면 calcineurin 작용이 증가된다는[23] 것이 현재의 유력한 가설이다. 따라서 연구자는 RCAN1 발현이 calcineurin 작용을 조절한다는 기존 연구결과를 근거로, RCAN1이 과발현되면 calcineurin 작용이 억제되어 calcineurin-NFATc1 경로가 저해되므로 파골세포의 분화가 감소될 것으로 가정했다. 이를 증명하기 위해 RANKL과 같은 외부 자극에 의해 발현이 조절되는 RCAN1-4 유전자의 과발현 실험을 시행했다. Fig. 2에서 보듯 골수단핵세포와 RAW 264.7 세포에 마우스 RCAN1-4 유전자를 형질도입시킨 결과 RCAN1-4 mRNA가 과발현됨을 확인했다. 그리고 mRNA 발현의 상대적 크기로 미루어 골수단핵세포가 RAW 264.7 세포에 비해 mRNA 과발현 효율이 낮을 것으로 예상된다. 하지만 어느 경우이든 RCAN1-4 mRNA의 발현 증가에도 불구하고 RCAN1은 과발현이 유도되지 않아 대조군과 차이는 없었다. 이러한 결과는 RCAN1-4 mRNA 과발현 유도가 세포 내 생존에 불합리한 환경으로 작용하여 RCAN1 과발현이 제한적이거나, RCAN1-4 mRNA로 부터 만들어지는 RCAN1 단백질의 분해가 빨리 일어났거나 혹은 새로 생성되는 RCAN1-4 mRNA의 반감기가 변하여 RCAN1 생성이 정상적으로 이루어지지 않음으로써 생길 수 있다. 본 연구에서 이 점에 관한 연구는 진행시키지 못했다. Fig. 4에서 보듯이 RCAN1-4 유전자를 과발현시키더라도 파골세포 분화는 대조군과 차이는 없었다. 생리학적 관점에서RANKL 자극에 의한 골수단핵세포의 파골세포로의 분화 과정이 정상적으로 이루어지기 위해서는 calcineurin-NFATc1 경로가 효과적으로 진행되어야 한다. RCAN1 유전자의 프로모터에는 NFATc1와 결합하는 부위가 여러 군데 존재하기 때문에 RCAN1은 NFATc1-의존적으로 발현되는 것으로 알려져 있다. 따라서 RANKL 자극에 의해 calcineurin 작용이 촉진되면 NFATc1 발현이 증가하고 동시에 핵 내로 들어가는 NFATc1이 증가하여 NFATc1-의존적인 파골세포 특이(osteoclast-specific) 유전자들의 발현이 증가하여 파골세포 분화가 촉진된다. 이와 동시에 NFATc1-의존적인 RCAN1 발현도 증가한다. 만일 RCAN1 증가로 인해 calcinuerin 작용이 억제되는 음성되먹임 현상이 진행되면 NFATc1의 핵 내 유입이 감소하게 될 것이며 이에 따라 파골세포 분화가 중단될 것이다. 따라서 RCAN1 과발현은 필연적으로 calcineurin 작용을 억제시킴으로써 calcineurin-NFATc1 경로를 억제하게 된다[18]. 이는 파골세포 분화에 절대적으로 불리한 여건으로 작용할 수밖에 없다. 그러므로 파골세포 분화가 정상적으로 지속되기 위해서 RCAN1의 농도, 즉 RCAN1 단백질의 양을 적절히 조절할 필요가 있다. 이처럼 세포내 RCAN1의 자가조절 기능은 RCAN1-4 유전자를 지속적으로 과발현시킨(stablely transfected) Mes-13 mesangial 세포에서 calcineurin 억제 작용이 나타나지 않았다는 보고와[14], 세포 내 RCAN1이 저농도 내지 중간 정도의 농도로 존재할 경우 calcineurin 작용이 촉진되며, 과발현처럼 고농도로 존재하면 calcineurin 작용이 억제된다는 보고에서 발견된다[5]. 따라서 RANKL 자극에 의한 파골세포 분화는 RCAN1 발현을 일정부분 촉진시키더라도 calcineurin에 대해서는 영향을 거의 미치지 않으므로 calcineurin-NFATc1 경로가 정상적으로 작동할 것으로 사료된다. 결론적으로 골수단핵세포를 사용하여 RANKL 처리에 의한 파골세포 분화 유도 시 RCAN1 발현이 약간 증가한다. 그러나RCAN1 발현이 과도하게 높지 않을 경우 calcinuerin 작용을 충분히 억제하지 못하기 때문에 calcineurin-NFATc1 경로가 유지되어 파골세포 분화가 영향을 받지 않는 것으로 사료된다.