A Frequency-dependent Single Cell Impedance Analysis Chip for Applications to Cancer Cell and Normal Cell Discrimination

주파수에 따른 단일세포의 임피던스 분석칩 및 암세포와 정상세포의 구별에의 적용

Abstract

This paper presents a frequency-dependent cell impedance analysis chip for use in cancer and normal cell discrimination. The previous cell impedance analysis chips for flowing cells cannot allow enough time for cell-to-electrode contact to monitor frequency-dependent impedance response. Another type of the previous cell impedance analysis chips for the cells clamped by membranes need complex sample control for making stable cell-to-electrode contact. We present a new impedance analysis chip using the microchamber array, on which a PDMS cover is placed to make stable cell-to-electrode contact for the individual cell trapped in each microchamber; thus achieving frequency-dependent single-cell impedance analysis without complex sample control. Compared to the normal cells, the magnitude of NHBE cells is $60.07{\sim}97.41k{\Omega}$ higher than A549 cells in the frequency range of 95.6 kHz~2MHz and the phase of NHBE is $3.96^{\circ}{\sim}20.8^{\circ}$ higher than A549 cells in the frequency range of 4.37 kHz~2MHz, respectively. It is demonstrated experimentally that the impedance analysis chip performs frequency-dependent cell impedance analysis by making stable cell-to-electrode contact with simple sample control; thereby applicable to the normal cell and cancer cell discrimination.

1. 서 론

단일세포 분석기술은 생물학, 의학적 분석을 위한 효과적인 접근법(1)으로 알려져 왔다. 이러한 단일세포 분석기술들 중 암세포와 정상세포의 구별을 위한 암세포의 특성분석 연구(2-12)가 최근에 활발히 진행되고 있다. 특히, 임피던스를 이용한 세포 분석기술은 화학적 라벨링이 필요 없고 비침습적인 방법으로 살아있는 세포를 실시간 분석 가능하며, 세포의 전기포텐셜, 시토졸 등 내인적인 특성 차이로 세포간 구별이 가능하여 많은 연구(2-6, 9-12) 가 진행되어 오고 있다. 기존의 임피던스 특성 분석칩은 세포가 전극에 머무는 시간이 짧아 주파수에 따른 임피던스 분석이 어렵거나, 세포를 전극에 위치시키기 위해 박막제어, DEP를 이용한 세포의 제어, 유체의 속도조절 등이 요구되어 정교한 시료제어를 위한 구조와 과정이 복잡하다는 단점이 있다. 따라서 본 연구에서는 단일 세포가 위치할 수 있도록 설계된 챔버에 세포를 붓고 PDMS 커버를 덮어 세포를 전극에 접촉/고정하여 정교한 샘플 제어 없이 주파수에 따른 임피던스 분석칩을 개발하고 이를 정상세포와 암세포의 구별에 적용하였다.

 

2. 구조 및 원리

제안된 임피던스 분석 칩 (Fig. 1)은 단일세포가 위치하는 24개의 챔버와 세포와 전극 접촉을 위한 PDMS 커버로 구성되어 있으며 단일 챔버의 설계는 Fig. 2와 같다. 먼저, 임피던스 분석칩에 세포 혼합액을 부으면 중력에 의해 각 챔버에 단일 세포가 위치한다(Fig. 3a). 이때, 해당 챔버의 높이를 세포가 파손되지 않는 범위 내에서(2) 세포의 직경보다 낮게 설계하였고, 이때의 직경 변화를 고려하여(13) PDMS 커버를 덮을 시, Fig. 3b와 같이 세포가 전극에 압착되도록 Table 1 과 같이 설계하였다.

Fig. 1Impedance analysis chip: (a) Top view of microchamber array; (b) perspective view of unit microchamber

Fig. 2A unit microchamber of the impedance analysis chip in Fig. 1: (a) top view; (b) cross sectional view along A-A’ in (a).

Fig. 3Cell loading and clamping in the chip: (a) cell loading; (b) cell clamping

Table 1Designed and fabricated dimensions of the impedance analysis chip

 

3. 제작공정

Fig. 4은 임피던스 분석칩의 공정 순서도이다. 공정은 유리기판 위의 전극 패터닝 공정과 Polydimethylsiloxane (PDMS) 몰딩공정으로 구성된다. 유리기판에 15/150nm두께의 Cr/Au를 증착 (Fig. 4b) 한 다음, PR로 패터닝 하여 (Fig. 4c) 식각 공정을 통해 전극을 (Fig. 4c, 4d) 형성한다. 그 상부에 챔버 형성을 위하여 12𝜇m 두께의 SU8을 패터닝하여 (Fig. 4e) 단일세포가 위치할 챔버를 제작한다. 세포고정을 위해 몰딩공정으로 제작된 PDMS 커버와 칩을 지그로 조립하여 고정한다. Fig. 5는 제작된 소자의 사진이다.

Fig. 4Fabrication procedure of the impedance analysis chip: (a) Pyrex glass substrate; (b) Cr/Au deposition(150Å/1500Å); (c) PR patterning (1.2μm); (d) Cr/Au etching & PR removal; (e) SU8 chamber patterning (12μm); (f) PDMS cover(1mm) on the chamber

Fig 5Fabricated impedance analysis chip: (a) overall view; (b) top view of a unit chamber with a single cell

 

4. 실험결과 및 토의

본 연구에서는 1종의 정상적인폐 상피세포(NHBE)와 2종의 폐암 비소세포(A549, H358)를 이용하여, 제안된 임피던스 분석칩의 성능을 분석하였다. 사용된 3종의 세포는 모두37℃, 5%의 CO2 농도가 유지되는 배양기에서 배양하였다. NHBE, A549, H358 각각의 세포를 Phosphate Buffered saline(PBS)와 혼합하여 3x106cells/ml 의 농도로 칩에 주입하고 (2𝜇l), 챔버에 단일세포들이 각각 위치할 수 있도록 30초 동안 상온에서 기다린 후, PDMS 커버를 덮어 세포를 고정하였다. 이때, 24개의 챔버중 평균 6.7개의 챔버에 단일 세포가 위치하였다. 세포가 고정된 것은 현미경을 통해 관측 가능하며, 세포가 고정된 후, LCR meter (Agilent, E4980A)의 마이크로 탐침을 임피던스 분석칩의 전극패드에 고정하여 임피던스 신호를 분석하였다. 임피던스 분석을 위해 100mVp-p 신호를 인가하여 200Hz~2MHz 주파수 범위에서 Sweep분석을 수행하였다.

Fig. 6는 임피던스 크기와 위상응답을 보여준다. 대조군으로 PBS만을 측정한 임피던스신호(크기, 위상)와 폐 정상 상피세포(NHBE)와 폐암세포주 2종(A549, H358)의 임피던스 신호(크기, 위상)를 각각 측정하였다. 임피던스 신호측정은 독립적인 챔버에서 각 세포주 별 6개의 세포를 대상으로 수행하였다. Fig. 6에서 정상세포는 2종의 폐암 세포주에 비해 95.6kHz~2MHz 범위에서 임피던스의 크기가 최소 60.07kΩ 최대154.36kΩ 더 높게 나타났으며, 임피던스의 위상은 4.37kHz~2MHz의 범위에서 3.96°~20.80° 더 높게 나타남을 확인하여, 정상세포와 암세포 2종을 전기적 특성으로 구별 가능함을 실험적으로 제시하였다.

Fig. 6Impedance response of NHBE, A549, H358 and PBS buffer in the frequency range of 200Hz to 2.0MHz for the AC signal of 100mVp-p: (a) magnitude; (b) phase angle.

 

5. 결 론

본 논문에서는 주파수에 따른 단일세포의 임피던스 분석칩을 제안하고 암세포와 정상세포의 구별에 적용 하였다. 전극이 위치한 마이크로챔버에 PDMS 커버를 덮어 단일 세포를 고정하여 복잡한 시료 제어 없이 세포의 주파수에 따른 임피던스 분석을 통해 세포의 구별을 수행하였으며, 폐정상 상피세포(NHBE)와 두 종류의 비소세포 폐암세포주 (A549, A358)를 이용한 성능실험 결과, 정상세포는 2종의 폐암 세포주에 비해 95.6kHz~2MHz 범위에서 임피던스의 크기는 60.07kΩ~154.36kΩ 더 높게, 임피던스의 위상은 4.37kHz~2MHz의 범위에서 3.96°~20.80° 더 높게 나타났다. 따라서, 95.60kHz~2MHz 주파수 범위에서 임피던스 크기와 위상 두 값 모두로 정상세포와 암세포의 구별이 가능함을 보였다. 본 임피던스 분석칩은 복잡한 시료의 제어 과정 없이 주파수에 따른 임피던스 특성을 분석하였으며, 본 논문에서 제안된 칩은 암세포와 정상세포의 구별과 나아가 세포의 임피던스 특성 관찰 및 암 진단에 활용할 수 있다.

 

- 기호설명 -

Lc: 챔버 폭 Hc: 챔버 높이 Gc: 챔버간 간격 Ge: 전극 간격 Le: 전극 길이 We1: 챔버 내 전극 폭 We2: 챔버 외 전극 폭 He : 전극 높이