Ⅰ. 서 론
암은 우리나라의 사망원인 1위로 2011년 기준으로 인구 10만 명당 142.8명이 암으로 사망하였고, 암에 의한 사망률은 최근 7년간 지속적인 증가 추세에 있다1). 암의 치료는 외과적 수술요법, 화학요법, 방사선요법 등이 있으나 치료의 제한성, 독성에 대한 부작용, 항암제의 종양에 대한 선택적 한계, 탈모, 위장장애 등의 합병증을 갖고 있다2).
최근 부작용이 적으면서 질병의 치료 및 예방에 효과가 있는 천연물질들에 대한 관심도가 증가하고 있고3) 인체의 면역력을 강조하는 대안적 치료법으로 종양 특이적인 면역요법4)과 비특이적인 면역계 자극 방법5) 등에 대한 연구가 활성화되고 있으나 치료효과의 한계와 부작용 등으로 임상 적용에 제한이 있는 실정이다.
한의학에서 癌은 積聚, 癓瘕, 反胃, 癭瘤, 癰疽, 瘡瘍등에 해당하며6) 치료는 祛邪法과 扶正培本및 兩者를 겸하는 扶正祛邪法으로 분류되어7) 乾漆8) 등의 活血祛瘀藥 및 山蔘9)과 같은 補益藥을 사용한 임상논문이 있고 鬱金10) 등의 암세포에 대한 독성 보고와 함께 楡根皮11), 五積散12) 등의 면역 활성화를 통한 항암효과를 밝히는 연구 등이 활발히 이루어지고 있다.
芷貝散은 ≪醫學入門≫13)에 古芷貝散으로 처음 수록되어 乳結核에 사용되었고 이후 여러 醫方書에서 乳結核, 乳痛症에 활용되는 것으로 알려져 있다14). ≪東醫寶鑑≫15)에 언급된 ‘結核久成嬭癌’은 乳房結核이 오래되면 乳癌이 된다는 뜻으로 이는 芷貝散의 消腫散結하는 작용이 乳房結核을 초기에 치료하여 乳癌으로의 진행을 예방하고 乳房腫瘍에 대한 치료 효과가 있음을 시사한다. 芷貝散에 대한 실험적 연구로는 급만성 염증 질환 및 sepsis에 대한 항염증 효과16)와 백혈병 세포 증식억제 효과17) 등이 밝혀졌으나, 면역 활성화에 의한 항암효과에 대한 보고는 아직까지 없다.
이에 저자는 芷貝散추출물의 염증억제와 선천면역계의 활성에 따른 항암 효과를 알아보고자 4T1 mouse mammary carcinoma cells과 colon26-M3.1 carcinoma cells를 이용하여 혈관투여에 의한 종양세포의 전이 억제와 lipopolysaccharide(LPS) 자극에 의한 염증 매개물질의 생산조절, macrophage의 cytokines 분비와 종양 세포억제, natural killer(NK)-cell 제거 후 종양 전이에 대한 실험을 실시한 바, 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
Ⅱ. 실 험
1. 재 료
1) 약 재
芷貝散1첩의 약재 구성과 분량은 다음과 같고(Table 1), 약재는 강남경희한방병원에서 엄선하여 구입한 후 사용하였다. 白芷와 貝母를 각 50 g씩 정량하여 분말로 만든 후 1 L의 물을 가하고 중탕기를 이용하여 100℃에서 2시간 추출 후, 10,000 rpm에서 10분 원심분리하여 상등액을 수집하였다. 수집된 상등액에 phosphate buffer saline(PBS)를 가하여 100 mg/ml의 stock solution을 제조하고 0.2 μm 필터로 여과하여 실험에 적용하였다.
Table 1.The Constitution of Jipae-san
2) 동 물
생후 6~8주령의 雌性BALB/c 마우스(20±1 g)를 (주)오리엔트(Seoul, Korea)에서 분양 받아 사용하였다. 마우스는 사육조에 5~10마리씩 넣어 정수된 물과 펠렛사료(Samyang Co. Ltd., Incheon, Korea)를 자유 공급하였고, 실험실 환경은 온도 22℃, 습도 50% 및 12시간 간격으로 자동 조명되는 상태에서 스트레스를 받지 않도록 주의하여 사육하였다.
3) 시 약
종양세포의 배양을 위한 Roswell park memorial institute(RPMI)-1640과 Eagle's minimal essential medium(EMEM), Dulbecco's modified eagle medium(DMEM), fetal bovine serum(FBS), vitamin solution, nonessential amino acid, L-glutamic acid, thioglycollate, PBS, penicilline과 10 μg/ml streptomycin는 Gibco(Carlsbad, CA, USA)에서 구입하여 사용하였다. Cell counting kit(EZ-Cytox)는 Daeil Lab(Seoul, Korea)에서 구입하였다. Bouin's 용액(saturated picric acid:formalin:acetic acid=15:5:1), lipopolysaccharide(LPS) 및 Griess 시약은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. Anti-asialo GM1 항체는 Wako(Osaka, Japan)에서 구입하였다. LDH kit는 Biovision(San Francisco, USA)에서 구입하였다.
4) 세포주와 세포배양
실험에 사용한 종양세포주인 4T1 mouse mammary carcinoma cells(originated from mice breast tumor)는 ATCC(American Type Culture Collection)에서 구입하였고, colon26-M3.1 carcinoma cells는 일본 북해도대학 면역과학연구소에서 기증받아 사용하였다. 4T1 mouse mammary carcinoma cells 및 colon26-M3.1 carcinoma cells의 배양은 각각 7.5% FBS, 10 μg/ml penicilline과 10 μg/ml streptomycin이 함유된 DMEM 및 EMEM을 이용하였고 macrophage 및 lymphocytes의 배양은 7.5% FBS가 함유된 RPMI-1640배지를 각각 이용하였으며, 5% CO2, 95% 습도 및 37℃의 배양기(Thermo Fisher Scientific Inc. Waltham, USA)에서 배양하였다.
2. 방 법
1) 종양 전이 모델
20 μg과 100 μg의 芷貝散추출물을 종양접종 2일 전에 1회 혈관주사 하고 4T1 mouse mammary carcinoma cells를 각각 1×105 cells/mouse(200 μl)로 정맥주사한 후 21일 후에 마우스를 희생시키고 폐를 적출하여 Bouin's 용액에서 전이된 종양을 고정시킨 후 종양의 군집 수를 측정하였다. 芷貝散에 의한 항종양 전이 효과는 종양만 접종한 대조군과 비교함으로써 조사하였다.
2) 세포독성 측정
5×103 cells/well의 밀도로 각 종양 세포와 macrophage를 96-well plate의 각 well에 분주하였다. 종양 세포의 경우 5,000 μg/ml부터 2배 희석법으로 156.25 μg/ml까지 희석한 芷貝散추출물 100 μl를 각각 첨가하고 3일간 배양하였고, macrophage는 10,000 μg/ml부터 10배 희석법으로 0.1 μg/ml까지 처리한 후 24시간 및 72시간 동안 배양하였다. 그 후 WST를 이용하는 EZ-Cytox로 제조사의 지침에 따라 450 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 세포독성효과는 시료를 첨가하지 않는 대조군에 대한 백분율(％)로 표시하였다.
3) Macrophage에 LPS 처리 후 염증 매개물질 측정
96-well plate에 macrophage 1×105 cells/well을 분주하고 24시간 배양하여 안정화시킨 후, 염증을 유발하기 위하여 LPS를 최종 농도가 0.5 μg/ml이 되도록 첨가하고 동시에 1,000 μg/ml부터 10배 희석법으로 1 μg/ml까지 희석한 芷貝散추출물을 첨가하였다. 양성대조군은 LPS만 첨가하고 24시간 배양 후 각 배양액에 생산된 염증 매개물질인 tumor necrosis factor(TNF)-α 및 nitric oxide(NO)의 양을 측정하였다. NO의 생산능 측정은 LPS 및 芷貝散추출물로 동시 배양된 macrophage의 세포 배양 상등액 0.1 ml과 동량의 Griess 시약을 혼합하여 10분간 반응 후 540 nm에서 측정 후, sodium nitrite(NaNO2)에 대한 표준 곡선에 대입하여 측정하였다.
4) Macrophage의 cytokine 분비 측정
BALB/c 마우스에 3％ thioglycollate 1 ml를 복강주사하고 3일 후에 경추 분리법으로 도살한 후, 복강에 RPMI-1640 배지 10 ml를 주입하여 복강 내 세포(peritoneal exudative cells; PECs)를 수집하였다. PECs를 24-well culture plate의 각 well에 1.5×106 cells/well로 조정하여 분주하였다. 2시간 동안 배양하여 macrophage를 plate에 부착하고 배양액으로 세척하여 부착되지 않은 세포를 제거하였다. 芷貝散추출물을 1,000 μg/ml 농도부터 10배 희석법으로 1 μg/ml까지 첨가하고 24시간 동안 배양 후, 배양 상등액을 회수하였다. 배양 상등액에 유도 분비된 TNF-α, interleukin(IL)-6 및 IL-12과 chemokine인 monocyte chemotactic protein-1(MCP-1)의 측정은 각 성분에 대한 ELISA kit(BD, San Jose, CA, USA)을 구입하여 제조사의 지침에 따라 측정하였으며, 각 성분의 양은 각각에 대한 표준 곡선에 대입하여 계산하였다. Cytokine 생산을 위한 양성대조군으로는 LPS를 이용하였다.
5) Macrophage의 종양 세포 억제 측정
BALB/c 마우스에 3％ thioglycollate와 芷貝散추출물 100 μg을 동시에 복강주사하고 3일 후에 PBS를 이용하여 마우스로 부터 thioglycollate-elicited PECs를 수집하였다. 10％ RPMI-1640 배지를 이용하여 수집된PECs를96-well plate에2×105 cells/well로 분주하고 2시간 동안 배양 후 PBS를 이용하여 3회 세척함으로써 non-adherent cells를 제거하고 암세포에 대한 효과세포(effector cell)로 준비하였고 colon26-M3.1 carcinoma cell을 목표세포(target cell)로 준비하였다. Effector/target의 비가 5, 10 및 20이 되게 조정하여 colon26-M3.1 carcinoma cell을 첨가 후 24시간 동안 배양하였다. 배양 완료 후 100 rpm으로 10분 동안 원심분리하고 배양 상등액을 수집하여 살해된 세포가 방출한 LDH의 양을 LDH 분석 kit를 이용하여 측정하였다. 동시에 배양 상등액에 함유된 TNF-α 및 NO의 양을 각의 분석 kit를 이용하여 분석하였다. 대조군은 BALB/c 마우스에 3％ thioglycollate만 복강주사 하였다.
6) NK-cell 관련 종양 전이 모델
BALB/c 마우스를 NK-cell 제거군과 비제거군에 각각 10마리씩 무작위 배정 후, NK-cell 제거군은 종양 접종 3일전 및 1일전에 20배로 희석된 anti-asialo GM1 항체를 마우스당 500 μl씩 총 2회 복강주사하였다. NK-cell 제거군과 비제거군 마우스 중 각각 5마리를 무작위로 선택하여 芷貝散추출물 100 μg을 1일 1회 정맥주사 하고, 나머지는 동일한 용량과 방법으로 생리식염수를 정맥주사 하였다. 정맥주사 2일 후, 각 마우스 당 colon26-M3.1 carcinoma cells를 꼬리정맥에 접종하였다. 접종 14일 후 경추분리법으로 마우스를 도살한 후 폐를 적출하여 Bouin's 용액에서 전이된 종양을 고정하고 종양의 군집 수를 측정하였다.
7) 통계처리
실험결과에 대한 통계처리는 SPSS 13.0 for windows program을 이용하였고, 실험군과 대조군의 비교는 One way ANOVA 또는 student's t-test를 시행하였다. 사후검정은 Turkey의 b test를 시행하였으며 p＜0.05를 유의한 것으로 하였다.
Ⅲ. 결 과
1. 종양 전이 억제 효과
4T1 mouse mammary carcinoma cells접종 2일 전에 20 μg 및 100 μg의 芷貝散추출물을 각각 1회 혈관 주사법으로 투여하고 종양 전이를 관찰한 결과, 종양군집수가 43.20±12.27과 18.40±8.91로 나타나 대조군의 79.20±9.20에 비하여 통계적으로 유의한 종양 전이 억제 효과를 보였다 (Fig. 1).
Fig. 1.Effect of JSE on Tumor Metastasis 4T1 Mouse.
2. 세포독성 결과
1) 종양 세포에 대한 세포독성 결과
4T1 mouse mammary carcinoma cell과 colon26-M3.1 carcinoma cell에156.25 μg/ml, 312.5 μg/ml, 625 μg/ml, 1,250 μg/ml, 2,500 μg/ml 및 5,000 μg/ml 농도의 芷貝散추출물을 첨가하여 세포생존율을 측정한 결과, 4T1 mouse mammary carcinoma cell은 각각101.44±3.08％, 101.79±9.33％, 100.22±1.35％, 92.74±2.89％, 73.28±2.69％ 및 55.66±1.83％로 나타났고 colon26-M3.1 carcinoma cell은 각각 101.33±6.20％, 102.07±2.24％, 98.81±5.28％, 86.50±5.80％, 68.31±1.98％, 47.97±4.09％로 나타났다(Fig. 2).
Fig. 2.Cytotoxicity of JSE on 4T1 Mouse Mammary.
2) Macrophage에 대한 세포독성 결과
芷貝散추출물을 10,000 μg/ml부터 10배 희석법으로 0.1 μg/ml까지 처리한 후, macrophage의 세포생존율을 측정한 결과, 0.1 μg/ml, 1 μg/ml, 10 μg/ml, 100 μg/ml, 1,000 μg/ml 및 10,000 μg/ml에서 배양 1일째에각각100.53±2.11％, 98.70±3.95％, 103.10±5.26％, 108.80±6.16％, 106.57±5.26％ 및 72.53±4.70％로 나타났고, 배양 3일째에 각각 101.57±2.55％, 101.67±1.32％, 104.20±9.10％, 107.10±5.24％, 104.10±6.70％ 및 52.80±5.27로 나타났다(Fig. 3).
Fig. 3.Cytotoxicity of JSE on Macrophage.
3. Macrophage에 LPS 처리 후 염증 매개물질 생산 억제 효과
1) TNF-α
Macrophage에 0.5 μg/ml의 LPS와 함께 芷貝散추출물을 1,000 μg/ml부터 10배 희석법으로 1 μg/ml까지 처리한 후 TNF-α 분비를 관찰한 결과, LPS만 처리한 경우 1948.47±98.55 pg/ml에 비하여 10 μg/ml, 100 μg/ml 및 1,000 μg/ml에서 각각 1437.30±282.84 pg/ml, 1205.60±107.76 pg/ml 및 980.20±53.88 pg/ml로 통계적으로 유의하게 억제되었다(Fig. 4).
Fig. 4.Production of TNF-α fromMacrophage Stimulated by JSE and LPS.
2) NO
Macrophage에 0.5 μg/ml의 LPS와 함께 芷貝散추출물을 1,000 μg/ml부터 10배 희석법으로 1 μg/ml까지 처리한 후 NO분비를 관찰한 결과, LPS만 처리한 경우 51.27±1.90 mM에 비하여 10 μg/ml, 100 μg/ml 및 1,000 μg/ml에서 각각 41.40±2.83 mM, 32.40±0.00 mM 및 32.75±0.21 mM로 통계적으로 유의하게 억제되었다(Fig. 5).
Fig. 5.Production of NO from Macrophage Stimulated by JSE and LPS.
4. Macrophage의 cytokine 분비 효과
1) TNF-α
Macrophage에 芷貝散추출물을 1,000 μg/ml부터 10배 희석법으로 1 μg/ml까지 처리한 후 TNF-α의 분비를 관찰한 결과, 대조군 40.50±10.04 pg/ml에 비하여 100 μg/ml 및 1,000 μg/ml 농도에서 각각 416.20±35.49 pg/ml 및 701.20±27.86 pg/ml로 통계적으로 유의하게 증가하였다(Fig. 6).
Fig. 6.Production of TNF-α from Peritoneal Macrophages Stimulated by JSE.
2) IL-12
Macrophage에 芷貝散추출물을 1,000 μg/ml부터 10배 희석법으로 1 μg/ml까지 처리한 후 IL-12의 분비를 관찰한 결과, 대조군 67.00±0.59 pg/ml에 비하여 100 μg/ml 및 1,000 μg/ml 농도에서 각각 134.10±26.59pg/ml 및 147.30±12.44 pg/ml로 통계적으로 유의하게 증가하였다(Fig. 7).
Fig. 7.Production of IL-12 from Peritoneal Macrophages Stimulated by JSE.
3) IL-6
Macrophage에 芷貝散추출물을 1,000 μg/ml부터 10배 희석법으로 1 μg/ml까지 처리한 후 IL-6의 분비를 관찰한 결과, 대조군 61.80±4.53 pg/ml에 비하여 100 μg/ml 및 1,000 μg/ml 농도에서 각각 493.30±63.07 pg/ml 및 849.45±39.81 pg/ml로 통계적으로 유의하게 증가하였다(Fig. 8).
Fig. 8.Production of IL-6 from Peritoneal Macrophages Stimulated by JSE.
4) MCP-1
Macrophage에 芷貝散추출물을 1,000 μg/ml부터 10배 희석법으로 1 μg/ml까지 처리한 후 MCP-1의 분비를 관찰한 결과, 대조군 222.80±21.21 pg/ml에 비하여 100 μg/ml 및 1,000 μg/ml 농도에서각각1013.25±182.08 pg/ml 및 1258.75±232.85 pg/ml로 통계적으로 유의하게 증가하였다(Fig. 9).
Fig. 9.Production of MCP-1 from Peritoneal Macrophages Stimulated by JSE.
5. Macrophage의 tumoricidal 활성
1) 종양 세포 억제 효과
芷貝散추출물로 자극된 macrophage와 colon26-M3.1 carcinoma cell의 비율을 5:1, 10:1 및 20:1로 하여 종양세포 살해 비율을 측정한 결과, 10:1 및 20:1에서 각각 대조군 2.07±0.39％, 3.90±0.66％에 비해 5.69±0.59％, 11.68±1.13％로 통계적으로 유의하게 증가하였다(Fig. 10).
Fig. 10.Effect of JSE on Cancer Cell.
2) TNF-α
芷貝散추출물로 자극된 macrophage와 colon26-M3.1 carcinoma cell의 비율을 5:1, 10:1 및 20:1로 하여 TNF-α의 활성을 관찰한 결과, 대조군 922.17±27.36 pg/ml, 1013.23±10.05 pg/ml, 1085.00±25.30 pg/ml에 비해1292.50±21.84 pg/ml, 1270.40±11.03 pg/ml, 1203.10±43.17 pg/ml로 증가하였으나 통계적으로 유의하지는 않았다(Fig. 11).
Fig. 11.Effect of JSE on TNF-α.
3) NO
芷貝散추출물로 자극된 macrophage와 colon26-M3.1 carcinoma cell의 비율을 5:1, 10:1 및 20:1로 하여 NO의 활성을 관찰한 결과, 대조군 8.80±0.17 mM, 8.90±0.29 mM, 11.10±2.17 mM에 비해 23.50±2.11 mM, 31.87±2.71 mM, 36.20±4.40 mM으로 통계적으로 유의하게 증가하였다(Fig. 12).
Fig. 12.Effect of JSE on NO.
6. NK-cell 제거 후 종양 세포 전이 억제 효과
NK-cell 제거군과 비제거군을 나누어 芷貝散추출물 100 μg을 1일 1회 정맥주사하고 2일 후, colon26-M3.1 carcinoma cells를 마우스 꼬리정맥에 접종하여 폐에 나타난 종양의 군집 수를 관찰한 결과, NK-cell제거 시 대조군과 유의한 차이가 없었으나, NK-cell 존재 시 대조군 63.40±6.38개에 비하여 15.40±3.51개로 유의하게 억제하였다 (Fig. 13).
Fig. 13.Effects of JSE on Tumor Metastasis after Depletion of NK-Cell with Anti-asialo GM1 Serum.groups
Ⅳ. 고 찰
발암의 원인은 구체적으로 규명하기 어려우나, 만성적 염증으로 인해 생겨나는 염증관련 물질들이 정상세포들의 DNA구조에 손상을 일으켜 암으로의 분화를 유도하고 비가역적으로 변화된 암세포의 성장을 촉진한다는 것이 알려져 있다18). 따라서 자극에 대한 염증물질의 생산성을 조절하는 것은 암의 예방 및 억제에 중요한 열쇠가 된다.
생체의 면역반응은 외래물질 특히 감염원에 대한 숙주의 방어체계로서 항원 비특이적인 선천면역계와 항원 특이적 면역반응을 유도하는 적응면역계로 구분하고 있다. 선천면역계에서 암세포에 대하여 살해력을 가지는 대표적 작동세포로는 주로 macrophage 및 NK-cell 등이 있으며, macrophage가 생산하는 cytokines는 주로 이들 작동세포의 활성화에 관여한다19). 선천면역계의 활성화는 종양 특이적 적응면역반응의 중요한 기전이 되고, 면역세포가 생산하는 다양한 cytokines의 작용에 의하여 체내 염증 유도, 면역세포 간신호 전달, 면역세포의 증식 및 작동세포의 활성조절에 의한 면역반응 조절 및 조혈세포로부터 면역세포로의 분화에 관여한다20). 따라서 약물을 통한 면역요법의 항암효과는 선천면역계와 적응면역계의 활성화를 확인함으로써 입증할 수 있다.
한의학에서 癌은 積聚, 癓瘕, 反胃, 癭瘤, 癰疽, 瘡瘍등에 해당하며6) 치료법은 淸熱解毒, 活血化瘀, 化痰消瘀등 직접 암세포를 살상하는 祛邪法과 益氣養血, 養陰生津, 健脾益氣, 補肝益腎등 인체 抗病능력을 증진시키는 扶正培本法및 이 두가지 치법을 적절히 배합시켜 正氣補養을 위주로 破積, 活血, 解鬱등의 치법을 활용하는 扶正祛邪法등이 있다21).
芷貝散은 ≪醫學入門≫13)에 古芷貝散으로 처음 수록된 처방으로, 白芷와 貝母가 各等分으로 구성되어 있고 乳結核, 乳痛症에 활용되는 것으로 알려져 있다14). 白芷는 散風除濕, 通竅止痛, 消腫排膿의 효능이 있어 感冒頭痛, 齒痛, 赤白帶下, 癰疽瘡瘍등을 치료하고22), 최근 연구에 의하면 LPS 유도 prostaglandin E2(PGE2) 생산과 cyclooxygenase-2(COX-2) 발현을 억제하고23), NO 억제를 통해 항염증효과를 보고하고 있다24). 貝母는 淸熱化痰, 開鬱散結의 효능이 있어 痰多咳嗽, 肺癰, 乳癰, 瘰瀝등 을 치료하고22), 인간백혈병 세포주인 HL-60세포의분화촉진25) 및angiotensin converting enzyme(ACE) 활성과 혈관조직의 NO/cGMP방출 억제를 통한 혈압강하 효과26)를 밝힌 연구도 있다.
芷貝散과 관련하여 ≪東醫寶鑑≫15)에 나오는 ‘結核久成嬭癌’은 乳房結核을 초기에 치료하면 乳癌으로의 진행을 예방할 수 있음을 시사하고, 이는 앞서 언급한 염증 물질의 생산성을 조절함으로써 암의 예방 및 항종양 효과를 끌어내는 과정과 흡사할 수도 있다. 이에 저자는 염증억제와 선천면역계의 활성 측면에서 芷貝散의 항암효과를 확인하고자 유방암 세포 4T1 mouse mammary carcinoma cell과 대장암 세포 colon26-M3.1 carcinoma cell을 실험에 이용하여, 종양세포의 전이 억제, LPS 처리 후 염증 매개물질의 생산조절, macrophage의 cytokines 분비 활성과 종양 세포 억제, NK-cell 제거 후 종양 전이 억제 등을 관찰하였다.
芷貝散추출물의 혈관투여를 통해 4T1 mouse mammary carcinoma cell의 전이에 미치는 영향을 알아본 결과, 20 μg과 100 μg의 芷貝散추출물 투여 시 통계적으로 유의한 종양 전이 억제 효과를 보였다.
芷貝散추출물의 종양 전이 억제 효과가 시료의 자체적인 세포독성에 의한 것인지 macrophage나 NK-cell의 활성화를 통한 선천면역계의 강화에 의한 것인지 확인하기 위해 芷貝散추출물의 세포독성 여부를 확인한 결과, 4T1 mouse mammary carcinoma cell과 colon26-M3.1 carcinoma cell 모두 1,250 μg/ml 이하에서 100%에 가까운 세포 증식을 나타내었다. 또한 종양세포가 아닌 복강 macrophage에 대한 세포독성을 확인한 결과, 1,000 μg/ml 이하의 농도에서 100%에 가까운 세포증식을 나타내어 유의한 세포독성은 없는 것으로 관찰되었다. 이에 芷貝散추출물의 종양 전이 억제 효과는 직접적인 세포 독성에 의한 것은 아닐 것으로 판단된다.
면역체계는 외부 이물질에 적당히 반응하면 체내를 방어하지만, 염증 매개물질이 대량으로 생산되면 만성질환과 발암과정의 직접적 원인이 될 수 있고27,28), LPS는 sepsis와 만성 염증성 질환을 야기하는 미생물 독소로16) 선천면역을 담당하는 세포의 활성을 증대시켜 TNF-α와 같은 pro-inflammatory cytokine의 분비를 촉진하고 다량 생산하여 염증성 매개물질로 알려진 NO의 대량생산을 유도한다29). 이를 토대로 염증유도 물질인 LPS 자극에 의해 macrophage로부터 분비되는 TNF-α와 NO의 양을 관찰한 결과, 芷貝散추출물 10 μg/ml, 100 μg/ml 및 1,000 μg/ml에서 모두 통계적으로 유의하게 억제되는 것이 확인되었고, 이는 이16)의 연구결과와 비슷하며 芷貝散이 항염증 효과를 통해 암의 예방에 중요한 역할을 할 가능성이 있음을 보여준다.
전이 모델에서 芷貝散추출물의 예방적 혈관투여는 혈관으로 접종된 암의 전이를 유의하게 억제하였고, 芷貝散추출물의 1,000 μg/ml이하의 농도에서는 유의한 세포독성 효과가 나타나지 않았다. 이 결과는 암세포가 그들의 목표기관에 부착 후 증식되기 전에 투여된 芷貝散 추출물에 의하여 이미 활성화된 cytolytic macrophage, NK-cell 등 여러 가지 작동세포에 의해 살해되어 나타나는 현상30)으로 사료된다. 이를 입증하기 위해 선천면역계를 구성하는 macrophage가 생산하는 여러 가지 cytokine의 분비를 관찰하여 macrophage의 활성화를 확인하고자 하였다. 그 결과, TNF-α, IL-12, IL-6 및 MCP-1는 芷貝散추출물 100 μg/ml, 1,000 μg/ml에서 유의하게 증가하였다. TNF-α는 macrophage에서 분비되어 T cell을 활성화시키고 암세포를 억제하는데 중요한 역할을 하는 cytokine이다31). IL-12는 macrophage로부터 면역반응 초기에 생산되는 cytokine으로서 암세포의 존재시 암세포에 살해능을 가지는 NK-cell의 활성화에 직접 관여하기에 항암활성의 유도에서 가장 중요한 cytokine의 하나로 인정되고 있다32). IL-6는 면역반응, 조혈 작용과 염증을 조절하는데 관여하는 다양한 기능을 가진 cytokine으로서33,34), 현재까지의 다양한 연구에 따르면 종양 세포에서 생산 분비되는 IL-6가 종양 악액질에서 매우 중요한 역할을 하며35) MCP-1은 단핵구에 대해 화학유인물질 역할을 하여 세포성 면역반응을 유도하는 작용을 가지고 있으며 종양에 macrophage가 침윤하도록 돕는다36).
芷貝散추출물이 cytokine inducer로서의 활성이 있음을 확인한 바, in vitro에서 芷貝散추출물을 투여한 마우스의 macrophage를 colon26-M3.1 carcinoma cell과 동시 배양하면서 芷貝散추출물의 첨가가 암세포에 대한 살해능 증진에 미치는 효과를 검토하였다. 그 결과 芷貝散추출물이 투여된 마우스의 macrophage는 종양세포에 대한 살해 활성이 증가하였고 그 활성은 암세포에 대한 macrophage의 비율인 E/T ratio에 의존적인 경향을 보였다. 특정 자극을 받은 macrophage는 TNF-α 와 NO 등을 생산하여 종양세포에 대한 살해기능을 획득하기에37) TNF-α 및 NO의 생산량을 측정한 결과 TNF-α의 활성은 증가하는 경향을 보이나 통계적 유의성은 없었고, NO의 활성은 E/T ratio 5:1, 10:1 및 20:1에서 모두 유의하게 증가하였다.
NK-cell은 기본적으로 세포 내 감염에 대한 초기 방어 작용을 하며, 동물실험에서 NK-cell을 제거할 경우 암의 발생 빈도가 늘어나고 전이가 증가하는 것을 볼 때 면역활성에 NK-cell의 역할이 중요함을 알 수 있다38). NK-cell의 활성에따른colon26-M3.1 carcinoma cells 전이에 미치는 영향을 알아본 결과, NK-cell이 제거된 군에서는 芷貝散추출물 투여군과 대조군 사이에 유의한 차이가 없었으나, NK-cell이 존재하는 종양 전이 모델에서는 芷貝散추출물 투여군에서 대조군에 비해 유의한 종양 억제 효과를 나타내었다. 따라서 芷貝散 추출물의 혈관투여로 인한 암 억제효과는 芷貝散추출물에 의하여 활성화된 NK-cell의 암세포 살해능 획득이 가장 직접적인 원인인 것으로 사료된다.
이상의 실험 결과에서 芷貝散추출물은 혈관을 통한 전신투여로 유의한 항암 효과를 나타내었기에 향후 항암제와의 병용투여에 대한 상승작용을 유도할 수 있는 가능성을 보여준다. 그러나 본 연구는 macrophage 및 NK-cell 위주의 선천면역계의 활성화 측면만을 다루었다는 한계가 있어 추후 경구투여로 인한 장관면역계 및 적응면역계의 반응에 대한 추가적 확인이 필요할 것으로 사료된다. 또한 芷貝散추출물에서 활성을 나타내는 활성성분의 분리 및 각각의 기전에 대해 자세히 밝히고, 에탄올 추출방법 등 다양한 제법을 이용한 실험적 연구가 보완된다면 芷貝散이 한의학적 암의 임상 치료에 효용성이 큰 약물로 응용될 수 있을 것으로 판단된다.
Ⅴ. 결 론
芷貝散이 암에 미치는 영향을 알아보고자 종양세포의 전이 억제, LPS 처리 후 TNF-α 및 NO, macrophage의 cytokines 분비 활성과 종양세포 억제, NK-cell 제거 후 종양 전이 억제 등을 관찰하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
1. 4T1 mouse mammary carcinoma cell을 이용하여 혈관투여를 통한 종양 전이 억제 효과를 측정한 결과, 芷貝散추출물 20 μg과 100 μg에서 유의한 종양전이 억제가 이루어졌다. 2. 세포독성을 평가한 결과, 芷貝散추출물 1,000 μg/ml 이하에서 4T1 mouse mammary carcinoma cell, colon26-M3.1 carcinoma cell 및 macrophage는 모두 100%에 가까운 세포증식을 나타내었다. 3. LPS 처리 후 TNF-α와 NO의 생산에 미치는 효과를 조사한 결과, 芷貝散 추출물 10 μg/ml, 100 μg/ml 및 1,000 μg/ml에서 유의한 억제 효과를 보였다. 4. Macrophage의 cytokines 분비에 미치는 효과를 조사한 결과, 芷貝散추출물 100 μg/ml, 1,000 μg/ml에서 TNF-α, IL-12, IL-6 및 MCP-1는 모두 유의하게 증가하였다. 5. Macrophage의 종양세포 억제 활성에 미치는 효과를 조사한 결과, 芷貝散추출물은 종양세포 살해 활성을 E/T ratio 10:1, 20:1에서 유의하게 증가시켰고, NO의 활성을 E/T ratio 5:1, 10:1, 20:1에서 유의하게 증가시켰다. 6. NK-cell 유무에 따른 종양 전이 효과를 측정한 결과, 芷貝散추출물은 NK-cell의 존재 하에 대조군에 비하여 유의한 종양 전이 억제 효과를 보였다.
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